应用rpoB和16S rDNA基因的变性梯度凝胶电泳技术对山羊瘤胃细菌多样性的研究

采用免培养的rpoB和16S rDNA基因的变性梯度凝胶电泳技术(DGGE)对3种山羊(波尔山羊,内蒙古绒山羊,四川南江黄羊)瘤胃细菌优势菌群结构进行了比较分析。研究结果显示rpoBDGGE图谱中条带数目少于16S rDNA图谱,并且条带分离效果明显,更有利于分析瘤胃细菌群落组成。从两种DGGE图谱中均可以发现3种山羊瘤胃细菌具有一定的相似性,种内个体间相似性明显高于种间相似性,这说明寄主品种是影响瘤胃细菌种群构成的一个重要因素。同时进行了部分优势细菌16S rDNA基因V6-V8区序列的系统发育分析。基因序列分析表明,DGGE图谱中优势条带的16S rDNA基因序列中有4条克隆的序列与基因库最相似菌的相似性大于97%,余下的克隆序列相似性在89%～96%之间,其中13条序列的与之相似性最高的序列均来自于未被鉴定的瘤胃细菌。     

应用微卫星多态分析四个鲤鱼群体的遗传多样性

选择12个斑马鱼功能基因的微卫星标记和12个鲤鱼微卫星标记,检测黑龙江鲤(Cyprinus carpiohaematopterusTemminck et Schlegel)、散鳞镜鲤(C.carpio)、荷包红鲤抗寒品系(C.carpiovar.wuyuanensis)、松浦鲤(C.carpioSongpu carp)的群体遗传多样性。共检测到3882个扩增片段,长度为126～489bp,在群体间扩增出1～5个等位基因不等,共计59个等位基因,平均等位基因2.46个。数据经PHYLIP V3.6软件估算和MEGA3软件作图,确立4个群体间的亲缘关系。并应用Bootstrap检验估计系统树中节点的自引导值,并进行了系统发生分析。结果表明①4个群体检测的有效等位基因数都在55个以上,平均观测杂合度为0.36～0.43,平均期望杂合度为0.49～0.53,平均多态信息含量为0.21～0.25,说明这几个群体多态性属于中度偏高水平,遗传多样性较高;②群体间相似系数都在0.84以上,遗传距离较近,为0.067～0.170,与前人研究结果一致。聚类分析显示,松浦鲤与散鳞镜鲤亲缘关系最近,荷包红鲤抗寒品系与它们的亲缘关系较黑龙江鲤更近;③在3个斑马鱼功能基因相关的微卫星位点上,黑龙江鲤缺失特异扩增条带,这可能与几种鱼类的育成史有关。     

鲎素抗菌肽饲喂小鼠对小鼠肠道微生物菌群的影响

目的应用PCR和DGGE技术分析饲喂鲎素对小鼠粪样细菌区系变化的影响。方法将健康21日龄清洁级KM小鼠,随机分为4个处理,分别饲喂生理盐水、合成鲎素、抗生素和益生菌。粪样细菌16SrDNA的V6-V8可变区经PCR扩增,扩增产物经DGGE电泳后再进行相似性分析。切下9条DGGE胶中特异性条带,PCR扩增,TA克隆,测序,鉴定细菌种属。结果对照组DGGE电泳条带较多,在不同时期肠道菌群相似性均较高,相似性在73.5%～76.7%;灌胃合成鲎素和益生菌悬液组,DGGE电泳条带数和对照组比略有减少,不同处理时期肠道菌群相似性在68.1%～69.4%;灌胃抗生素组,DGGE电泳条带数明显减少,不同处理时期肠道菌群相似性在51.4%～63.0%。结论断奶小鼠在灌胃鲎素和抗生素后,肠道微生物区系和对照比发生了改变,最终形成特定的微生物区系;DGGE中特异条带的鉴定表明,灌胃鲎素可以促进粪链球菌和乳酸杆菌的生长,提高数量。     

蓖麻杂交种的SSR鉴定及遗传变异分析

采用SSR标记对蓖麻CSR24×CSR181杂交所得的F1种子进行分析,为蓖麻早期杂种鉴定和遗传变异分析奠定技术与理论基础。结果表明:(1)各位点鉴定所得结果基本一致,除RCM207和RC129位点鉴定的杂种率未超过10%外,其它位点的杂种率都十分接近,在13.46%～17.27%之间。(2)少数个体在相关位点发生了变异,在引物RC242的扩增图谱中有4个单株出现了双亲特异条带的缺失,产生了双亲都没有的新条带;在引物Rco23、Rco26、Rco29、RC129、RCM613和RCM999的扩增结果中出现了父本特异条带的缺失,同时产生了一条新条带。(3)多样性及UPGMA聚类分析表明杂交后代遗传变异显著,子代个体与亲本间的遗传相似系数在0.45～1.0之间,个体间差异明显。     

鲤的微卫星引物对草鱼基因组分析适用性的初步研究

运用微卫星DNA-聚合酶链反应(STR—PCR)基因分型技术,选取已发表的28对鲤的微卫星引物,探讨鲤的引物用于草鱼基因组微卫星分析的可能性。通过优化PCR反应条件,消除了影子带和异源核酸双链分子两类微卫星相关假阳性带对STR—PCR分析的干扰。在此基础上,筛选出7对引物可在湘江野生草鱼基因组中扩增出特异性条带,占总数的25％;其中的4对引物(约占总数的14．3％)在8尾湘江野生草鱼小群体中即检测到了个体间等位基因的多态性。这些初步的结果表明鲤的微卫星引物可以用于草鱼基因组的分析。     

PCR-DGGE方法分析原油储层微生物群落结构及种群多样性

使用基于 16 S r DNA的 PCR- DGGE(变性梯度凝胶电泳 )图谱分析结合条带割胶回收 DNA进行序列分析 ,对新疆克拉玛依油田一中区注水井 (12 # 9- 11)和与该注水井相应的两个采油井 (12 # 9- 9S、13# 11- 8)井口样品微生物群落的多样性进行了比较并鉴定了部分群落成员。 DGGE图谱聚类分析表明注水井与两油井微生物群落的相似性分别为 30 %和 2 0 % ,而两油井间微生物群落结构的相似性为 5 4 %。DGGE图谱中优势条带序列分析表明注水井样品和油井样品中的优势菌群为未培养的环境微生物 ,它们与数据库中 α、γ、δ、ε变形杆菌 (Proteobacteria)和拟杆菌 (Bacteroidetes)有很近的亲缘关系。 DGGE与分子克隆相结合的分子生物学方法在研究微生物提高原油采收率 (MEOR)机理 ,以及指导 MEOR在油田生产中的应用有着重要的意义     

三种药物对岩原鲤幼鱼的急性毒性试验

以岩原鲤幼鱼为材料,研究了青霉素、硫酸铜和高锰酸钾3种药物对岩原鲤的急性毒性.结果表明,青霉素、硫酸铜和高锰酸钾对岩原鲤幼鱼的96 h-LC50值(95%可信区间)分别为28.67 mg/L (18.74～43.87mg/L)、0.69 mg/L (0.49～0.96 mg/L)、1.29 mg/L (0.99～1.67 mg/L),3种药物的安全浓度分别为2.87 mg/L、0.07 mg/L和0.13 mg/L.     

吉富罗非鱼雌雄群体遗传差异的SSR分析

为探讨吉富罗非鱼(genetic improvement of farmed tilapia,GIFT)雌、雄群体间的遗传差异,本研究对国家级广西南宁罗非鱼良种场雌、雄吉富罗非鱼进行了遗传差异分析。研究结果表明,选取的11对SSR引物中有10对能获得稳定的目的条带;每个SSR基因座的等位基因数在2～4个之间,雌性罗非鱼的平均等位基因(Na)2.9个,稍高于雄性的2.8个;雌、雄吉富罗非鱼平均观察杂合度(HO)分别为0.4183和0.4154,多态信息含量(PIC)分别为0.4048和0.3932,属中度多态;雌雄个体间的遗传距离和相似性指数分别为0.0908和0.9132。此外,SSR基因座PRL-SO2在雄鱼中偏离Hardy Weinberg平衡(P0.005)。上述结果表明,吉富罗非鱼雌、雄群体的SSR多态性基本相同,推测这两者基因组间的差异较小。     

藏灵菇微生物种群结构的分子特性研究

用PCR—DGGE指纹技术,研究了藏灵菇中微生物多样性及藏灵菇发酵奶发酵过程微生物种群动力学。结果表明,藏灵菇中细菌的种群结构较酵母菌的复杂,不同来源的藏灵菇中细菌种群结构的相似性为78％-84％,酵母菌种群结构的相似性为80％-92％。发酵过程中细菌种群结构变化图谱中的条带B和条带E,以及酵母菌种群结构变化图谱中的条带N贯穿于整个发酵过程,是发酵过程的优势菌。序列分析表明,细菌种群结构的DGGE图谱中的绝大多数条带与乳酸菌相对应,其中最亮条带（条带E）的序列与乳酸乳球菌的相似性为100％。     

大头鲤原种种群的遗传现状

大头鲤(Cyprinus pellegrini)是一种云南高原湖泊特有的国家Ⅱ级重点保护鱼类。土著种大头鲤与外来种鲤(C.carpio)的渐渗杂交在星云湖野生种群中已经广泛发生。本研究结合形态和微卫星及线粒体DNA分析检测了螺蛳铺大头鲤原种种群的遗传现状。结果显示,螺蛳铺大头鲤样本所有个体在形态上位于大头鲤与鲤的参照样本之间;在微卫星因子对应分析中也显示,其位于大头鲤与鲤的参照样本之间,但与大头鲤参照样本较为相似;在线粒体DNA分析中显示,都具有鲤的单倍型。中间性形态特征以及核基因组成与线粒体基因组成的不一致现象,表明螺蛳铺大头鲤样本均为杂种个体。因此,螺蛳铺大头鲤原种种群可能是一个杂种种群,有必要重新建立大头鲤人工繁殖计划。     

锦鲤4个人工雌核发育家系的微卫星标记研究

利用Crooijmans et al.(1997)分离的包含CA重复单元的普通鲤鱼（Cyprinus carpio L.)的8个微卫星DNA标记,对从锦鲤（Cyprinus carpio L.)的红白,大正和昭和3个不同品系中所获得的4个不同人工雌核发育家系的20尾个体进行PCR扩增。电泳结果表明,8对引物在20尾个体中均能重复稳定地扩增出相应的同源序列。随引物不同,各等位基因数为1－11个,大小在68－264bp。在MFW4,MFW7,MFW19,MFW20,MFW23和MFW24 6个微卫星的扩增结果中,20尾个体的扩增图谱呈现了高度的遗传多态性,不同雌核发育家系内个体的遗传异质性也较大。其中大正（TaS)和红白1（RW1）的个体不仅花色分化显著,而且个体间的平均遗传距离分别高达0．28。通过对微卫星等位基因和基因型分析发现,由于锦鲤品系中的每一个体是通过不断地杂交选育而获得,基因组来源复杂,基因高度杂合。因此,只进行1代的人工雌核发育,其家系内仅部分个体的部分座位出现纯合。所获得的人工雌核发育锦鲤为后续的色素遗传调控机制研究提供了必要的实验材料;同时,所鉴定的微卫星分子标记为进行锦鲤的分子标记育种的基因组作图提供了理想的工具。     

岩原鲤遗传多样性和种群历史动态研究

研究基于线粒体DNA细胞色素b (mtDNA Cyt b)基因序列, 对2013—2017年间采自我国长江上游贵州省赤水市和重庆市万州区共161尾岩原鲤(Procypris rabaudi)个体进行了遗传多样性分析。结果表明, 在所有个体序列中, A、T、C、G碱基的平均含量分别为30.2%、27.9%、28.2%和13.7%, (A+T)含量(58.1%)明显大于(G+C)含量(41.9%), 表现出较强的反G偏倚性。161条序列检测到18个变异位点, 定义了15种单倍型, 整体单倍型多样性指数(H_d)、核苷酸多样性指数(P_i)分别为0.590、0.00132; 岩原鲤赤水群体遗传多样性水平低于万州群体; 万州群体的单倍型多样性和核苷酸多样性均呈现逐年降低的趋势, 但是赤水群体的单倍型多样性和核苷酸多样性呈现逐年增加的趋势。基于最大似然法构建的系统发育树和单倍型网络图结果一致, 万州和赤水群体并未形成明显的地理分布格局。Mega 6.0软件计算2个群体之间的遗传距离为0.001。F_st值统计表明, 2个地理群体间F_st值为0.01749 (P>0.05), 群体间没有出现遗传分化现象。两群体间基因交流频繁, 基因流N_m=24.71。分子方差分析(Analysis of Molecular Variance, AMOVA)显示: 98.25%的遗传变异是由群体内产生的。中性检验结果表明万州岩原鲤群体历史上曾发生过种群扩张事件, 时间约为0.15百万年前。岩原鲤群体整体上遗传多样性偏低, 急需提出合理的管理措施, 以加强长江流域岩原鲤物种的资源保护。     

Cloning of IGF2b 5'Flanking Region and Methylation Analysis of Its GC-rich Sequence in Common Carp (Cyprinus carpio)

鲤(Cyprinus carpio)胰岛素样生长因子2b(insulin-like growth factor 2b,IGF2b)基因为鲤IGF基因家族重要的成员,已有的研究表明5’侧翼区序列对其功能的发挥有重要作用.因此,采用基因组步移法获取5′侧翼区序列,通过亚硫酸盐修饰的方法分析不同品种该区域GC富集区的甲基化状况.本文成功从鲤基因组DNA中获得695 bp的IGF2b 5'侧翼区序列.已获取的IGF2b 5'侧翼区序列经过TFSEARCH分析后发现了多个转录因子结合位点和TATA框,通过BLAST比对发现,鲤IGF2b 5'侧翼区DNA序列与斑马鱼( Danio rerio) IGF2b基因相比,相似性为87％.检测该区域富含GC的序列17个位点,发现建鲤(C.c.var.jian)有2个个体的3个位点出现甲基化,而黄河鲤(C.c.haematopterus)只有1个个体1个位点出现甲基化,这说明2个品种鲤在这个区域出现甲基化修饰的几率低,也验证了这2品种在该基因该区域GC富集区是稳定的.     

岩原鲤微卫星富集文库的构建及微卫星分子标记的筛选

用磁珠富集法构建了岩原鲤Procypris rabaudi AC重复和GATA重复的微卫星富集文库.采用PCR方法分别以人工合成的oligoA和探针(AC)12或(GATA)6为引物筛选含有微卫星的阳性克隆.(AC)n 富集库和(GATA)n富集库的阳性克隆率分别为30%和7%左右.对40个AC重复的阳性克隆和30个GATA重复的阳性克隆测序,共获得61个微卫星序列,其中包含了一个三碱基重复(TGA)的微卫星序列.选择设计了19对AC重复和16对GATA重复的微卫星引物以及1对TGA重复的微卫星引物,通过PCR优化,共有20对引物能够产生稳定、清晰的目的产物带.为了检测获得的岩原鲤微卫星座位是否能用于近缘物种的研究,我们将20对岩原鲤微卫星引物用于中华倒刺鲃Spinibarbus sinensis基因组DNA PCR扩增,有60%的引物对能产生特异性的目的条带.本研究获得的20个岩原鲤微卫星座位可以用于岩原鲤及近缘物种的遗传多样性、种群遗传结构等的进一步研究.     

基于18S rRNA基因的PCR/DGGE技术研究山羊瘤胃原虫动态变化

应用PCR/DGGE技术对山羊采食前后瘤胃原虫的多样性随时间的变化进行了研究.采食前和采食后1、2、4和8h分别采集瘤胃内容物样品,对瘤胃原虫特异性的18SrRNA基因经PCR扩增、DGGE电泳分析.结果显示,采食前后DGGE图谱由10条左右清晰可辨的谱带组成,图谱上的泳带反映了瘤胃内的优势原虫,泳带数量和位置的复杂性说明了瘤胃原虫的多样性.并对其中两个优势条带切胶测序,基因序列分析分属于毛口目和内毛目.瘤胃原虫区系相似性分析,采食前为90.5%～94.1%;采食后相似性发生改变,且存在个体差异.多样性指数由采食前的O.82逐渐上升到采食后8h的O.90(P>0.05).DGGE指纹技术有效地反映了不同样品中原虫优势种的组成,并可通过此技术跟踪研究瘤胃原虫区系在不同条件下的动态变化.     

PCR-DGGE研究微生物种群中多条带产生原因分析

鸡肠道微生物菌群经PCR-DGGE分析,回收PCR-DGGE分析胶上的一条DNA片段,回收的DNA片段再重复进行2次PCR-DGGE分析,以及分别用PCR反复循环扩增和PCR高保真酶扩增后再进行DGGE分析等方法研究PCR-DGGE分析中多条带产生原因。结果显示PCR-DGGE分析中多条带产生原因可能是作PCR扩增模板的DNA混杂有少量其他DNA片段,多条带现象不易被消除。DGGE分析胶上的DNA片段测序时,将该DNA片段回收、PCR扩增后克隆,提取多个阳性克隆菌的质粒DNA片段,分别与其原目的DNA片段进行DGGE分析,在DGGE分析胶上选取与原目的DNA片段处于同一电泳位置的质粒DNA测序,提高测序的准确性。     

应用PCR-DGGE技术研究石莼、网地藻藻际微生物多样性

应用变性凝胶梯度电泳(PCR-DGGE)技术对石莼、网地藻藻际微生物多样性进行研究,并对其进行相似性、未加权聚类分析(UPGMA)及微生物多样性(Shannon)指数分析。结果表明,PCR-DGGE图谱显示,石莼、网地藻藻际微生物DGGE图谱有着明显的差异性,具体表现在条带数及密度值的不同。Quantity one图谱分析表明:石莼藻际微生物16S r RNA基因的V3区共分离得到25条DNA片段,网地藻为16条DNA片段。DGGE相似性及未加权聚类分析表明:网地藻藻际微生物间的相似性为77.78%,石莼藻际微生物细菌群落间的相似性为49.25%。Shannon指数分析表明,石莼藻际微生物多样性指数显著高于网地藻(P0.05)。石莼藻际微生物细菌群落较网地藻丰富。     

基于SSR标记的8个山荆子居群遗传多样性和遗传关系分析

采用10对SSR引物对8个山荆子[Malus baccata (L.) Borkh.]居群140个单株的基因组总DNA进行PCR扩增,并据此对8个居群的遗传多样性和遗传关系进行了分析.结果表明:用10对SSR引物共扩增出91条带,多态性条带百分率达100.00％.8个居群的遗传多样性参数差异较大,有效等位基因数为1.437 9～1.535 0,Nei's基因多样性指数为0.256 0～0.309 2,Shannon信息指数为0.376 7～0.459 2,多态性条带百分率为64.84％～85.71％.居群间的有效等位基因数为1.616 9,Nei's基因多样性指数为0.355 1,Shannon信息指数为0.528 5,均明显高于居群内;8个居群间的基因流为1.739 5,基因分化系数为0.223 3,显示居群间的基因交换较多.UPGMA聚类分析结果表明:在Nei's遗传距离0.148 6处,8个居群被分为3组,河北塞罕坝居群单独为一组,山西五台山居群和北京东灵山居群为一组,其余5个居群为一组.据此推测:山荆子起源于中国华北和东北地区,山西灵空山、黑龙江小兴安岭、吉林长白山和山西中条山居群可能是其遗传多样性的核心居群.     

基于线粒体DNA控制区序列的重庆岩原鲤人工养殖群体遗传多样性分析

为研究重庆市长寿和涪陵地区岩原鲤(Procypris rabaudi)人工养殖群体的遗传多样性, 采用PCR扩增获得175尾岩原鲤个体的线粒体DNA控制区(mtDNA D-loop)部分序列片段。对其中692 bp序列分析共发现11个单倍型, 其中Hap1为主要单倍型, 占总样本的76.57%。单倍型Hap10演化速率较快, 并且与单倍型Hap6遗传距离最远。长寿及涪陵地区岩原鲤人工群体的单倍型多样性分别为0.4100±0.0550和0.3970±0.0820, 核苷酸多样性分别为0.0013±0.0003和0.0013±0.0004。通过与长江上游江段野生群体(苍溪江段、合江江段、木洞江段、通江江段、万州江段、武隆江段、习水河和唐河)及北碚区人工养殖群体的遗传多样性进行比较, 发现岩原鲤长寿及涪陵地区人工养殖群体遗传多样性明显低于野生群体, 但略高于北碚人工养殖群体。为保持岩原鲤人工养殖群体的遗传多样性, 应尽量选择遗传距离较远的亲本进行配对, 并定期补充不同遗传背景的个体作为后备亲鱼。