不同免疫方案制备家蚕抗菌肽多抗血清的比较

目的:以His-CecropinXJ融合蛋白、pcDNA3.0-cecropinXJ重组质粒为免疫原,分别采用蛋白皮下免疫、DNA肌肉免疫及使用活体基因导入仪肌肉免疫BALB/c小鼠,制备新疆家蚕抗菌肽的多克隆抗血清,并评价不同免疫方案对抗原免疫原性的影响。方法:采用间接ELISA测定免疫血清中抗新疆家蚕抗菌肽IgG抗体的滴度及亚型分类。用Western blot检测各免疫方案制备的抗血清,与新疆家蚕抗菌肽CecropinXJ抗原结合的特异性。结果:不同免疫方案均可诱导产生针对新疆家蚕抗菌肽不同滴度的多克隆抗血清。使用活体基因导入仪免疫后,可诱导高滴度的抗体产生。结论:以His-CecropinXJ蛋白免疫BALB/c小鼠后,可诱导高滴度的IgG1抗体产生;以pcDNA3.0-cecropinXJ质粒免疫后,可诱导针对IgG2a的抗体产生。     

miR-155对肝癌细胞增殖的影响

目的:在肝癌细胞系中过表达miR-155,研究其对肝癌细胞增殖的影响。方法:将pc DNA3.0-miR-155表达载体瞬时转染Huh7.5.1及Hcclm3肝癌细胞系,通过实时定量PCR技术对miR-155在转录水平的表达进行检测,采用CCK8法及克隆形成实验检测miR-155过表达后对Huh7.5.1及Hcclm3肝癌细胞系增殖的影响。结果:转染细胞后72 h,经实时定量PCR检测,Huh7.5.1及Hcclm3肝癌细胞中成熟miR-155的表达分别上调约431及16倍(P0.01),说明其能有效高表达;CCK8法及克隆形成实验结果显示,miR-155能够明显促进肝癌细胞增殖(P0.01)。结论:pc DNA3.0-miR-155转染Huh7.5.1及Hcclm3肝癌细胞系后能高效表达成熟miR-155,同时证明过表达miR-155能使肝癌细胞的增殖受到非常明显的促进。     

用生物传感器方法测定正常小鼠肝脏中miR-21活性

目的:建立生物传感器检测小鼠肝脏中microRNA (miRNA)活性的方法,测定miR-21在正常小鼠肝脏中的活性。方法:首先,分子克隆方法构建检测miRNA活性的通用型质粒传感器Dsensor。将各种miRNA的互补序列插入Dsensor中构建成相应miRNA活性检测传感器。用水动力法将检测miR-21的Dsensor注射至正常小鼠体内,以miR-122 Dsensor为阳性对照,miR-206 Dsensor为阴性对照,以不插入任何miRNA互补序列的Dsensor为空白对照。不同时间点尾静脉采血测定Gluc表达,处死小鼠测定肝脏中Fluc表达,比较计算得出miRNA活性。最后,用QRT-PCR法测定小鼠肝脏组织中miR-21、miR-122和miR-206表达水平。结果:用RIF(Relative inhibiting fold)值表示miRNA活性,miR-21、miR-122和miR-206活性分别为80.03±21.25,29.90±5.90和0.92±0.29,表明小鼠正常肝脏中miR-21的负调控活性明显高于miR-122。然而,QRT-PCR法测定结果显示,miR-21的表达水平明显低于miR-122,而miR-206几乎没有表达。从miR-21与miR-122的活性与表达水平比较发现,miR-21的表达水平并没有真实反映其活性。结论:成功建立了一种小鼠肝脏中miRNA活性检测方法;首次发现小鼠正常肝脏中miR-21活性水平比miR-122更高,而表达水平却明显低于miR-122。提示miR-21对于维持肝脏的正常生理功能的重要作用,值得进一步研究其调控的靶基因和机理。     

miR-122过表达转基因小鼠质粒构建及其功能验证

目的:比较两种miR-122转基因小鼠过表达载体构建方法,为建立miR-122过表达转基因小鼠奠定基础。方法:PCR扩增长约291bp的pre-miR-122的序列,分别定向克隆到pBROAD3-GFP载体GFP基因上游内含子或下游3'UTR区域,两种质粒分别转染293T细胞,Q-PCR检测miR-122和GFP的表达水平,并观察GFP绿色荧光。miR-122 sensor reporter是将3个miR-122成熟序列的反义序列串联克隆至psiCHECK2载体luciferase 3'UTR中,然后分别与2种miR-122过表达质粒载体共转染293T细胞,最后检测荧光素酶活性来鉴定miR-122调控功能。结果:2种构建方法的miR-122表达水平都明显增高,而只有插入到GFP基因3'UTR的质粒表达GFP功能正常。结论:构建microRNA过表达载体时,microRNA位于报告基因3'UTR区域不会影响microRNA和报告基因的功能;构建的两种miR-122过表达质粒载体都可应用到转基因小鼠研究中,而将miR-122插入到GFP下游的方法则更利于miR-122的表达。     

人肝脏特异性miR-122表达载体的构建及鉴定

人肝脏特异性miRNA-122是肝脏中表达丰度最高的miRNA。为研究该miR-122的生物学功能,从HepG2细胞基因组中用PCR的方法扩增了miR-122的前体,构建了miR-122的表达载体pLMP-miR-122。pLMP-miR-122质粒转染人正常肝细胞系L-O2和肝癌细胞系HepG2后,细胞内成熟miRNA-122的表达量显著增加。该质粒与HBV1.3共转染HepG2细胞72h后,HBV的HBs和HBe蛋白水平的表达量均下降,说明miRNA-122参与了HBV基因的复制和表达的调控,为进一步研究miRNA-122的功能和其他一些肝病如HCC的调控机制打下基础。     

基因在脑内的表达

冈山大学药学部助教授津田正明等在小鼠脑内导入重组质粒DNA,瞬时表达获得成功.于9月12日在大阪召开的日本生化学会上报告了这一结果.目前的研究是在小鼠脚垫的肌肉注入质粒DNA进行表达.在活体动物脑内表达外源基因这大概在世界尚属首次.津田等与冈山大学医学部和庆应大学等共同进行此项研究.打算以此阐明脑机能问题.     

miR-122与甲胎蛋白表达调控的研究

miR-122是肝脏特异高表达的一种miRNA,其通过相关基因的表达调控而参与肝脏的发育分化,且与丙型肝炎病毒感染、慢性肝炎及肝癌的发生发展密切相关。甲胎蛋白(α-fetoprotein,AFP)是肝癌细胞特异的血浆蛋白,70%以上的肝癌病人在发病期间都有甲胎蛋白基因的高表达,在临床上已被用作肝癌诊断的生物标志物。本文就miR-122与甲胎蛋白表达与肝癌相关基因之间的关系展开综述。     

电激和普鲁卡因增强DNA导入哺乳动物活体效率

目的:探究电激和普鲁卡因对DNA导入哺乳动物活体效率的影响.方法:向小鼠的股四头肌注射20 μg β- gal质粒,分别采用以下方法:直接注射;先注射100 μL0.25％的普鲁卡因,24h后注射质粒;注射质粒后进行经过前期优化后的电激程序进行加强(500 V,4个脉冲).注射后的第2d、1w和2w后进行x- gal染色检测.结果:三种导入方法均可将外源质粒导入肌肉组织中并进行表达.电激和普鲁卡因可以显著增强肌肉对外源基因的吸收和表达,尤其是优化后的电激程序,其可以使肌肉长期稳定高效的表达外源导入基因.结论:普鲁卡因是常用的增强DNA导入效率的促进剂,而合适的电激可以更为显著地增强DNA导入效率,均是基因治疗中提高基因导入效率的良好候选方案.     

pCAGGs-miR-483重组质粒构建及miR-483转基因小鼠模型的建立

miR-483是近年发现的一种编码于胰岛素样生长因子2(insulin-like growth factor2,Igf2)基因第2内含子的microRNA.研究表明,高脂饮食诱导的肥胖动物的心脏、肝脏及肝、肾肿瘤组织中miR-483表达异常,但其生物学功能尚待研究.建立稳定表达miR-483并能够传代的miR-483转基因小鼠是研究其功能的重要环节.利用特异miR-483克隆引物,以小鼠基因组为模版,经PCR获得pre-miR-483片段,通过重组构建pCAGG-miR-483重组质粒.该质粒可在真核细胞中稳定表达成熟miR-483.再利用原核显微注射法建立miR-483过表达转基因小鼠.利用实时PCR检测各组织miR-483含量.结果显示,miR-483转基因小鼠心肌、骨骼肌、肝脏等组织可过表达成熟miR-483.此外,miR-483转基因过表达小鼠较野生型小鼠体重降低,提示miR-483可能在发育、代谢等方面具有调节作用.miR-483转基因小鼠模型的建立为microRNA功能研究提供了在体研究的平台.     

MicroRNA 122对肝癌细胞基因表达谱的影响

为研究microRNA（miR-122）对肝癌细胞Hep3B基因表达谱的影响,并探讨其在肝癌发过程中的可能作用,构建了miR-122稳定高表达的Hep3B细胞,利用基因表达谱芯片技术筛选得到和对照组细胞比较的差异表达基因.研究结果显示,2倍以上变化的差异表达基因有490个,其中上调的有345个,下调的有145个.这些基因中有16个与肿瘤发生相关,其它基因涉及细胞周期、信号转导、细胞凋亡和细胞增殖分化等众多生物学过程.这些结果提示,miR-122可能在肝癌发生的过程中发挥作用,并可能与这些差异表达基因密切相关.另外,还结合生物信息学方法,在下调表达的基因中预测了miR-122可能直接作用的靶基因.本研究初步探讨了miR-122在肝癌细胞中的生物学功能,为进一步研究miR-122在肝癌发生中的作用奠定了基础,同时也为miRNA的生物学功能及其作用机制的研究提供了一些参考.     

羊痘病毒P32基因真核表达载体的构建、表达及其免疫原性

通过PCR方法扩增全长P32基因和截去跨膜区的P32基因(MP32),将其分别克隆到真核表达载体pcDNA3.1( )和已插入CpG序列的pcDNA3.1-CpG中,构建pcDNA3.1-P32、pcDNA3.1-CpG-P32和pcDNA3.1-CpG-MP32质粒;用脂质体法转染BHK-21细胞,通过间接免疫荧光(IFA)试验验证其表达效果;经肌肉免疫注射健康BALB/c小鼠,用间接ELISA法检测抗体;在免疫后的第3、5周取免疫小鼠的脾细胞,用流式细胞仪检测CD4 和CD8 T细胞亚群.结果所构建的真核表达载体在BHK-21细胞中都能表达P32蛋白;免疫小鼠血清在免疫第2周后均能检测到羊痘特异性IgG抗体;免疫组小鼠脾脏CD4 T细胞数目和CD4 /CD8 T细胞比值明显高于对照组.结果提示,所构建的真核载体可诱导小鼠产生特异性体液免疫应答,并能刺激小鼠产生较强的细胞免疫应答.     

外源质粒DNA对小鼠脾脏物质能量代谢的影响

研究外源质粒DNA经胃肠道途径对免疫激活状态下小鼠脾脏代谢的影响。给Balb/c小鼠灌喂质粒pcDNA3 200μg,分别在灌喂后4h和18h分离脾脏,提取脾脏总RNA。利用Affymetrix基因表达谱芯片对灌喂质粒pcDNA3后的Balb/c小鼠脾脏进行基因表达谱研究。采用Genmmapp和MAPPFinder软件进行功能聚类分析。对上调倍数两倍及两倍以上的基因进行功能聚类发现,灌喂后4h,外源质粒刺激小鼠脾脏产生免疫应答的同时,脾脏中嘌呤代谢及蛋白质合成,胆固醇合成、脂肪酸合成、糖酵解、三羧酸循环及线粒体氧化磷酸化途径等大量代谢过程受到诱导。在灌喂后18h也得到类似的结果。结果表明外源质粒DNA可通过胃肠道途径吸收影响小鼠脾脏物质能量代谢过程。结果有助于在分子水平上深入了解外源质粒DNA经胃肠道吸收后的作用机制。     

荒漠昆虫小胸鳖甲几丁质酶抗血清的制备及抗体效价检测

目的几丁质酶是昆虫重要的防御物质,本研究采用DNA-蛋白质联合免疫策略制备荒漠昆虫小胸鳖甲几丁质酶(MpCHI786)的抗血清,用于检测小胸鳖甲在外界不良条件下几丁质酶的变化。方法从小胸鳖甲成虫中提取总RNA,反转录后RT-PCR扩增Mpchi786 cDNA,构建原核表达载体pET30a-Mpchi786,在大肠杆菌BL21中用IPTG诱导表达获得融合蛋白His-MpCHI786。对融合蛋白切胶纯化后与弗氏佐剂混合作为抗原。另外,构建真核表达质粒pcDNA3.0-Mpchi786,对小鼠尾静脉高压注射,8 h后RT-PCR检测其在肝脏的瞬时表达。以pcDNA3.0-Mpchi786肌肉注射免疫小鼠3次后,再用His-MpCHI786融合蛋白加强免疫2次,DNA免疫和免疫结束后收集免疫小鼠的血清,ELISA和Western blot法检测抗血清效价和特异性。结果 RT-PCR结果显示尾静脉高压注射8 h后,pcDNA3.0-Mpchi786质粒在小鼠肝脏有特异性表达。Western blot检测表明,用His-MpCHI786融合蛋白作为抗原,pcDNA3.0-Mpchi786DNA质粒免疫3次的抗血清和His-MpCHI786融合蛋白加强免疫2次后的抗血清都显示了特异性反应条带。ELISA检测结果显示抗血清效价高达1∶204 800以上。结论利用DNA-蛋白质联合免疫法能够获得效价高、特异性的小胸鳖甲几丁质酶MpCHI786的抗血清。     

微球包裹pcDNA3-GRF（1-32）在小鼠肌肉组织的表达及对生长的影响

以乳酸-乙醇酸共聚物为载体,采用复乳液中蒸发法制备载生长激素释放因子（Growth hormone releasing factor,GRF）真核表达质粒pcDNA3-GRF（1-32）微球,其中包封率达69%,平均粒径为2.20μm,载药量80μg/mg,收率70%;体内转染小鼠肌肉组织, 提取注射部位肌肉组织DNA 和总RNA,经PCR和RT-PCR,发现注射pcDNA3-GRF（1-32）微球组的GRF表达水平最高（UVIBAND Version 99分析）,释放的GRF表达质粒在小鼠肌肉内存在并表达的时间至少30d。体重统计结果表明,30d后微球包裹质粒组累积增重与其它组相比差异极显著（P<0.01）,比裸质粒组、质粒和空白微球混合物组、生理盐水组分别高12.87%,19.72%,58.58%;结论认为,载pcDNA3-GRF（1-32）微球具有缓释作用,并可实现GRF基因体内局部基因转染、表达,发挥其相应的生物学效应,有希望成为提高质粒在动物肌肉组织表达效率的新方法。     

MiR-122在AldoA介导的ob/ob小鼠肝脏代谢中的作用研究

本实验室前期研究发现,2型糖尿病动物模型ob/ob小鼠血清中miR-122的含量较正常C57BL/6小鼠显著升高.本文进一步研究肝脏特异性miR-122及其靶蛋白AldoA(果糖1,6-二磷酸醛缩酶A)在ob/ob小鼠肝脏代谢中的作用.首先,经qRT-PCR技术检测发现ob/ob小鼠肝脏miR-122水平较C57BL/6小鼠显著下降,而Western blotting分析发现ob/ob小鼠肝脏其靶蛋白AldoA的表达水平显著上升.进一步以miR-122分子转染293T细胞后收集其分泌的微囊泡(microvesicles,MVs),经qRT-PCR检测确认后采用特异性荧光染料DiI-C18标记MVs,以不同剂量尾静脉注射BALB/c小鼠体内,不同时间点取肝组织做冰冻切片.在荧光显微镜下观察证实,包裹有miR-122的MVs通过循环系统进入肝脏,同时qRT-PCR定量分析发现肝组织中miR-122含量显著升高,而蛋白质印迹检测发现其靶蛋白AldoA在肝脏中表达显著下降.AldoA主要催化糖酵解途径中果糖1,6-二磷酸和磷酸二羟丙酮及甘油醛-3-磷酸之间的转变,miR-122靶向作用AldoA可能在2型糖尿病的发生发展中发挥重要作用.     

小鼠Uncv基因克隆及真核表达

目的 克隆小鼠的Uncv基因并在真核细胞表达.方法 采用RT-PCR方法扩增小鼠皮肤组织中Uncv基因编码区,以真核表达质粒pcDNA 3.1-Flag为载体,构建Uncv真核表达质粒,将重组载体转染Hela细胞并用Western blot法检测基因表达.结果 构建Uncv基因真核表达载体pcDNA 3.1-Flag/Unev,重组质粒在Hela细胞中有效表达约95×103的融合蛋白.结论 成功构建真核表达载体pcDNA 3.1-Flag/Uncv,并且在真核细胞中有效表达,为研究Uncv基因生物学功能奠定基础.     

结核杆菌抗原85A与小鼠白细胞介素21共表达DNA疫苗的构建及其免疫效应研究

目的:利用真核表达质粒pRSC,构建结核杆菌抗原85A(Ag85A)与小鼠白细胞介素21(mIL21)共表达重组体pRSC-mIL21-Ag85A,为研究新型结核杆菌DNA疫苗提供新的策略。方法:从质粒pcDNA3.1-mIL21中经PCR扩增出mIL21基因,并插入质粒pRSC中构成pRSC-mIL21;再从pIRES-Ag85A质粒中经PCR扩增出Ag85A基因,构建于pRSC-mIL21重组质粒上,成为共表达DNA疫苗pRSC-mIL21-Ag85A。结果:经酶切、基因测序证实,该疫苗构建正确并能成功表达目的基因。共表达DNA疫苗免疫小鼠后,CTL活性、特异性淋巴细胞增殖水平及小鼠血清特异性抗体均呈有意义的提高。结论:结核杆菌Ag85A与mIL21共表达DNA疫苗能诱导小鼠免疫反应,为进一步研究DNA疫苗抗结核杆菌攻击的免疫防护效应奠定了基础。     

CDH17/pcDNA3.1(-)真核表达载体的构建与鉴定

目的:构建肝肠钙黏连蛋白(CDH17)基因pcDNA3.1(-)真核表达质粒,为进一步研究胃癌发病的分子机制和生物学行为以及寻找新的抗转移措施奠定理论基础。方法:用Trizol Reagent抽提胃腺癌组织中总RNA,采用逆转录巢式PCR方法扩增CDH17目的片段,双酶切纯化PCR产物及pcDNA3.1(-),再将CDH17基因片断插入pcDNA3.1(-)线性质粒,即构建成CDH17/pcDNA3.1(-)真核细胞表达质粒,将质粒转染感受态细胞DH5a,筛选阳性克隆行双酶切鉴定及DNA测序鉴定。结果:DNA测序结果与预期目的片段序列一致。结论:CDH17/pcDNA3.1(-)真核细胞表达质粒构建成功。     

小鼠淋巴细胞抗原CTLA-4的胞外肽段表达及纯化

目的: 真核细胞表达小鼠淋巴细胞抗原CTLA-4胞外段肽,研究表达肽段与抗原呈递细胞B7分子结合后减轻小鼠淋巴细胞刺激后的增殖抑制,从而启动T淋巴细胞进一步增殖。方法:从小鼠脾脏淋巴细胞获得总RNA,通过逆转录PCR扩增出CTLA-4全长基因,克隆并测序。依据胞外段序列和真核表达载体pcDNA3.1序列,合成引物扩增胞外片段,两者经内切核酸酶处理、连接构建重组表达pcDNA3.1载体,重组质粒经测序验证后,采用lipofectamine 2000转染入小鼠肝癌细胞Hepa1-6,经G418筛选获得稳定表达细胞株。结果:获得小鼠CTLA-4胞外段真核表达载体和小鼠肝癌细胞Hepa1-6稳定表达转染细胞株,制备了CTLA-4胞外肽段,经His标签抗体和小鼠CTLA-4抗体Western blot检测表达蛋白带均呈阳性。结论:获得CTLA-4胞外段肽,为进一步研究该肽的作用打下基础。     

抗日本血吸虫pVAX1/ SjHGPRT·SDISP 多价疫苗的构建方法探讨

目的:探讨抗日本血吸虫生殖产卵编码基因多价疫苗pVAX1/SjHGPRT.SDISP的构建方法并从基因与蛋白水平验证该构建方法是否成功。方法:分别以pcDNA3.0/SjHGPRT、pcDNA3.0/SjSDISP为模板,设计引物扩增SjHGPRT、SjSDISP,采用overlap方法扩增全长SjHGPRT.SDISP。将纯化后的产物SjHGPRT.SDISP以及pVax1质粒采用Kpn I和Xba I双酶切,1%低熔点胶回收目的 DNA片段以及酶切后Pvax1载体片段双胶连。连接产物转化至DH5α细胞。挑选阳性克隆采用双酶切以及测序方法从基因水平鉴定是否构建成功。将构建产物免疫观察动物,采用免疫组化方法从蛋白水平鉴定疫苗pVAX1/SjHGPRT.SDISP是否构建成功。结果:酶切方法以及测序结果均显示重组质粒的插入序列分别与目的基因完全一致,昆明小鼠肌肉组织酶免疫组织化学染色显示免疫组小鼠肌细胞中呈现较强的棕黄色颗粒,而阴性对照组肌细胞呈阴性。结论:真核重组质粒pVAX1/SjHG-PRT.SDISP构建成功,且在昆明鼠肌肉细胞内能够获得良好的表达。