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1.
PCR扩增BMP-2与BMP-7的编码基因, 利用重叠PCR以柔性肽(Gly4Ser)5编码序列将二者串连并克隆到质粒pIRESneo3上, 转染CHO-K1细胞得到混合稳定克隆。ELISA检测培养液中BMP-2/7异源二聚体蛋白的表达水平为230.75±13.34 ng/mL, 以此为条件培养基处理成骨细胞株MC3T3, 对照组为分别含有CHO-K1细胞及大肠杆菌表达的BMP-2同源二聚体以及PBS的条件培养基。结果发现碱性磷酸酶染色与茜素红染色差异明显, 定量RT-PCR显示分子指标OC、ALP、Runx2与Osx的转录水平明显增高(P<0.05), Luciferase报告基因检测BMP/Smad通路活性较对照组升高明显(P<0.05)。首次设计构建了BMP-2/7异源二聚体蛋白, 其成骨活性显著高于BMP-2同源二聚体。  相似文献   
2.
核心启动子(core promoter,CP)是位于转录起始位点附近由100个左右核苷酸所构成的功能区域,负责与转录因子结合同其它顺式作用元件如增强子、沉默子一起对转录进行调控。目前所发现的真核蛋白编码基因核心启动子元件包括:TATA盒、上游启动子元件BRE、起始子Initiator(Inr)、下游启动子元件DPE以及新发现的位于DPE附近的十基序元件MTE。上述核心启动子元件普遍存在于真核蛋白编码基因之中,对真核生物的生长、发育、适应环境起着重要作用。  相似文献   
3.
miR-17-92是一个高度保守的基因家簇,参与哺乳动物多个器官发育并与多种实体瘤的发生密切相关。运用多个在线数据库,发现了miR-17-92的上游转录因子及下游靶基因间的多个前馈和反馈环路。并对参与miR-17-92调控环路的基因进行功能聚类分析,进而绘制出miR-17-92的核心调控网络图。结果提示miR-17-92与其上游转录因子共调控的靶基因可能参与了生物体的细胞周期调控,迁移、凋亡、激素应答、免疫系统发育等多种生物学过程,KEGG pathway分析提示其还与多种肿瘤信号通路密切相关。因此,对miR-17-92分子调控网络生物信息学的分析可以有助于理解其在细胞发育和肿瘤发生过程中的作用机制并为后续实验验证提供良好的指导。  相似文献   
4.
Osterix(Osx)是一种具有锌指结构的转录因子,对骨形成十分重要. 但到目前为止,直接接受Osterix调控的靶基因尚不清楚.用骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP2)诱导原代培养小鼠成骨细胞的骨分化,定量RT PCR检测Ⅰ型胶原蛋白(collagen Ⅰ a 1, Col1a1)与Osx的转录水平.结果发现,二者的转录时相具有相同的变化模式.为了确定二者之间的关系,采用腺病毒表达系统在原代成骨细胞中过表达Osx. 数据表明,Osx能够明显上调Col1a1的转录水平.用EMSA(electromobility shift assay)检测这些过表达Osx基因的成骨细胞核抽提物,迁移条带的出现表明,Osx能够直接与Col1a1的启动子相结合.结果提示,在原代培养的成骨细胞中,Osterix通过直接与启动子相结合,调控Col1a1基因的转录.  相似文献   
5.
建立稳定高效的动物细胞表达系统对于许多重组蛋白质药物的工业化生产有着十分重大的意义。用PCR扩增得到dhfr基因 ,克隆入载体pIRESneo3基因以替换原有的neor 基因 ,并将hbFGF作为报告基因插入其多克隆位点 ,得到重组子pIRESdhfr hbFGF ,转导CHO细胞后 ,MTX浓度梯度筛选稳定表达hbFGF的细胞株 ,ELISA与WesternBlot检测培养基中hbFGF的分泌表达。结果发现10、100、1000nmol LMTX组均检测到hbFGF的表达 ,其中表达量最高的一株细胞传代20次后表达量仍能维持较高的水平。因此利用双顺反子表达系统可以实现外源基因在动物细胞中的高效稳定表达 。  相似文献   
6.
人尿激肽原酶的纯化与鉴定   总被引:2,自引:0,他引:2  
采用两性离子胶体沉淀和乙醇沉淀相结合的粗提方法,经离子交换、疏水层析、亲和层析及凝胶过滤4个步骤有效地将人尿激肽原酶(hk-1)粗提物纯化,比活提高了1 755倍,总得率为70%.用以慈菇蛋白酶抑制剂为配体的亲和层析纯化hk-1,效果理想,整个工艺路线适合产业化生产.纯化产物在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳上为单带,高压液相色谱(HPLC)上为单峰,基质辅助激光解析电离飞行时间质谱测得分子质量为33 450 u,等电聚焦测得pI在4.3附近,为含糖蛋白.同时测定了该酶的热稳定性和pH稳定性.纯化过程中同时分离得到另一种药用蛋白——人尿胰蛋白酶抑制剂(HUTI).  相似文献   
7.
通过构建6种荧光融合蛋白质粒载体pECFP-IκBα、pECFP-IκBαM、pECFP-IκBα243N、pECFP-IκBα244C、pp53-DsRed和pp53/47C-DsRed,应用激光共聚焦显微镜,观测静止细胞内p53与IκBα及其各种突变体的定位特点及相互作用关系,直观地说明了活体细胞内的p53可与IκBα的C端的PEST区发生相互作用,p53的N端也参与了p53·IκBα复合体的形成.同时,实时观测外界刺激下细胞内DsRed/CFP两荧光比值的变化,探讨p53·IκBα复合体形成与解离的动态平衡,细霉素B(leptomycinB,LMB)作用下细胞内p53与IκBα的动力学分布、及核穿梭动态过程的意义.IκBα蛋白可能已经成为p53和NF-κB信号通路的一个交叉点,从而扩展了对于这两条重要信号通路调控的认识.  相似文献   
8.
目的:尝试通过计算机的辅助筛选基因重组组合,期望能减少人工筛选的工作量并得到高表达的蛋白。方法:从影响表达的两个因素即翻译起始区陬的二级结构自由能和翻译起始区的密码子偏好性问题研究入手,对部分核苷酸进行了突变,利用RNA二级结构预测软件DNASISv2.5对hbFGF的陬区起始密码子开始前35个核苷酸进行了分析,筛选出预期表达量高的组合并在实验中加以验证。结果:从32种突变方式中筛选出10条自由能绝对值最低的序列做引物,克隆至表达载体上,得到了两株高表达菌株。结论:利用计算机辅助设计可以优化和筛选实验结果,提高工作效率,降低具体实验的工作量。  相似文献   
9.
骨形态发生蛋白2通过Smad途径上调Osterix的表达   总被引:2,自引:0,他引:2  
Osterix(Osx)是一种重要的调控成骨细胞分化的具有锌指结构的转录因子.骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2, BMP2)能够上调Osx的表达,但其分子机制并不清楚.采用实时定量RT-PCR方法检测到BMP2诱导成骨相关细胞C3H10T1/2, MC3T3-E1, C2C12中Osx的转录水平显著上调,并且与成骨分化指标Col1a1, osteocalcin具有相似的表达动力学特征.而且,在C3H10T1/2细胞中过表达负显性(dominant negative, DN)Osx基因,能够有效抑制BMP2诱导的成骨分化.过表达BMP/Smad信号通路抑制蛋白Smad6,能够抑制Osx转录水平的上调.但是通过荧光素酶报告载体对Osx的启动子-1254~+85区域进行分析后未发现接受BMP通路调控的启动子区域.上述结果表明,BMP2能够通过Smad途径上调Osx的表达,并对成骨分化的过程具有十分重要的作用.  相似文献   
10.
许多研究表明,miRNAs在肿瘤中失活与特定的遗传和表观遗传机制改变有关,hsa-miR-203在膀胱癌组织和细胞中表达下调并扮演着抑癌基因的角色。为了验证hsa-miR-203在膀胱癌细胞中是否受DNA甲基化抑制,采用去甲基化抑制剂5-Aza-CdR(5-氮-2'-脱氧胞苷)处理5637和BIU-87膀胱癌细胞,MSP和RT-PCR检测表明,hsa-miR-203的启动子在5637和BIU-87细胞中存在完全的甲基化,而5-Aza-CdR能逆转hsa-miR-203启动子的甲基化状态,恢复hsa-miR-203的表达。MTT法测定显示,5-Aza-CdR使5637和BIU-87膀胱癌细胞增殖受到明显抑制,并呈时间和剂量依赖性。同时,流式细胞仪检测显示,5-Aza-CdR使5637和BIU-87膀胱癌细胞周期阻滞于G_0/G_1期。因此,5-Aza-CdR能抑制膀胱癌细胞5637和BIU-87增殖并干扰其细胞周期。hsa-miR-203启动子异常甲基化是其在膀胱癌细胞中低表达的重要机制,5-Aza-CdR能逆转hsa-miR-203基因的甲基化,恢复hsa-miR-203的表达,为hsa-miR-203作为膀...  相似文献   
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