基于PEG介导原生质体转化构建粉红聚端孢荧光标记

粉红聚端孢是多种植物的重要病原菌。本研究通过酶解粉红聚端孢幼嫩菌丝细胞壁获得原生质体,用PEG介导原生质体转化将携带GFP基因和博来霉素抗性基因的外源DNA随机插入粉红聚端孢基因组,共获得博来霉素抗性菌株90株,转化效率达18个/μg。选取22株转化子荧光观察,发现均可表达荧光,菌株间荧光强度不同,其中10株转化子荧光表达较强。与野生型相比,突变菌株TR45的菌落生长、产孢量和致病力等生物学特性均未改变,在不含博来霉素的培养皿中继代培养10代荧光仍能稳定表达。本研究构建的高效原生质体制备和PEG介导粉红聚端孢遗传转化方法,可用于该菌基因功能研究,绿色荧光标记菌株可用于病菌侵入、田间监测、侵染循环等发生规律研究。     

杨树腐烂病菌(Cytospora chrysosperma)原生质体遗传转化体系的构建

【目的】通过分析不同酶解条件对金黄壳囊孢菌[Cytospora chrysosperma(Pers.)Fr.]原生质体释放的影响,建立高效制备原生质体及其遗传转化体系的方法,为开展杨树腐烂病菌的致病分子机制研究奠定基础。【方法】以杨树腐烂病菌菌株CFCC 89981为受体,在细胞壁降解酶作用下产生用于转化所需的原生质体,通过PEG(Polyethylene glycol)介导将g GFP DNA导入杨树腐烂病菌的原生质体中获得转化子。经PCR扩增、Southern blot和荧光观察验证g GFP DNA插入到杨树腐烂病菌基因组中并表达出GFP(Green fluorescent protein)蛋白。【结果】以p H 5.5的1.2 mol/L KCl为稳渗剂,杨树腐烂病菌菌丝经Driselase和Lysing enzymes共同酶解4 h可获得1.2×108个/m L原生质体,再生率可达63.74%±9.73%,FDA(Fluorescein diacetate)溶液染色结果显示98%左右的原生质体具有较高的活力。利用PEG介导的遗传转化方法,转化效率可达76个/μg DNA。PCR检测和Southern blot均可在转化子基因组中检测到GFP基因片段,且荧光检测转化子的菌丝均呈绿色荧光,表明GFP基因在杨树腐烂病菌中表达。此外,GFP转化子在无潮霉素抗性的PDA培养基中多代转接后仍稳定遗传并表达GFP蛋白。【结论】通过筛选酶解条件,获得高质量、高活性的杨树腐烂病菌原生质体,并利用PEG介导的转化方法建立了高效稳定的原生质体遗传转化体系。该体系的建立为杨树腐烂病菌的后续研究奠定了技术基础。     

禾谷镰孢转化体系的优化

禾谷镰孢是小麦赤霉病和玉米茎腐病的主要病原真菌。试验优化了聚乙二醇介导的原生质体转化法,建立了禾谷镰孢高效转化的稳定体系,并总结了影响转化成功的主要因素。以此方法对禾谷镰孢进行活体荧光标记,并用转化菌株侵染小麦胚芽鞘,在荧光显微镜下追踪病原真菌在宿主植物体内的生长及扩展过程。     

糖多孢红霉菌A226 的原生质体转化和染色体同源整合

糖多孢红霉菌的原生质体转化和染色体同源整合,是红霉素生物合成基因改造的重要途径。本研究对糖多孢红霉菌A226原生质体制备和转化条件进行了优化,结果表明以对数生长后期和稳定期菌丝体制备的原生质体转化效率较高;质粒、原生质体和PEG－T缓冲液体积比例为15：40：200（μl)时转化效果较好;比重小原生本的转化效率虽高,但在转化子中有效整合的比例较低;PEG1000和PEG3350对转化效率没有显差异;而Yamamoto转化系统优于Weber转化系统。PCR鉴定、抑菌活性鉴定和质谱分析均表明,转化质粒已整合到染色体红霉素合成基因位点。     

猕猴桃间座壳菌Diaporthe actinidiae的绿色荧光蛋白基因标记及侵染过程

果实软腐病是猕猴桃贮藏期间最严重的真菌病害,猕猴桃间座壳Diaporthe actinidiae是该病检出率最高且致病力最强的病原菌.该病菌从花前期开始侵染,至果实贮藏期才表现症状,侵染至发病周期较长,可借助荧光标记对其侵染过程进行研究.本研究采用PEG介导原生质体转化的技术,运用携带GFP及潮霉素抗性基因的双元载体p...     

青色荧光蛋白标记的禾谷镰孢转化子的构建

【背景】近年来玉米茎腐病在我国大部分玉米产区普遍重度发生,其中镰孢菌茎腐病不仅造成了重大的经济损失,而且镰孢菌产生的毒素给人体和动物的健康也带来严重威胁。【目的】玉米茎腐病的病原组成复杂,禾谷镰孢是其中的主要病原之一,该病原菌侵染寄主导致发病的机制急需深入研究。【方法】以pCAMBIA1300质粒为骨架,利用重叠PCR的方法构建表达青色荧光蛋白的质粒pCAMBIA1300-CFP-Kan,通过农杆菌介导的遗传转化技术,将青色荧光蛋白的编码基因整合到禾谷镰孢基因组中。【结果】经过PCR鉴定和荧光显微观察,确定获得了31株青色荧光标记的禾谷镰孢菌。【结论】侵染试验结果显示,激光共聚焦显微镜下禾谷镰孢在玉米茎秆组织中的定殖位置清晰可见,该结果为进一步研究不同镰孢菌在寄主中的定殖规律奠定了基础。     

PEG介导的柱状田头菇遗传转化体系建立

柱状田头菇（茶树菇）Agrocybe aegerita是一种美味的食用菌,具有极高的经济价值。随着其全基因组测序的完成,功能基因组学研究也逐渐展开,其中,高效的遗传转化体系作为技术基础成为研究重点。本研究以柱状田头菇原生质体为受体、潮霉素抗性基因（hph）作为筛选标记,以增强型绿色荧光蛋白基因（egfp）为报告基因,应用PEG介导法进行柱状田头菇遗传转化体系研究。结果表明,150μg/mL潮霉素可以完全抑制柱状田头菇的生长。30℃下用2%裂解酶液酶解菌丝3h,能够获得最大得率的原生质体。通过PEG介导将构建好的DNA片段转化入柱状田头菇原生质体,通过潮霉素抗性筛选获得转化子,转化得率达到7个/μg DNA。PCR验证和荧光显微镜观察,外源片段成功转入柱状田头菇中并稳定表达。本研究建立的PEG介导转化体系,为柱状田头菇基因功能研究提供了技术基础。     

禾谷镰刀菌中FgPDE1基因的敲除及其功能的研究

目的:旨在敲除禾谷镰刀菌Fusarium graminearum Fg PDE1基因,确定其缺失突变体表型,从而分析该基因的生物学功能。方法:应用Split-marker技术构建含有潮霉素基因敲除盒,通过PEG介导原生质体转化,PCR筛查抗潮霉素转化子以获得缺失突变体ΔFg PDE1,根据突变体表型变化及致病性的检测对Fg PDE1基因的功能进行分析。结果:采用Split-marker技术,成功构建了Fg PDE1基因敲除盒;PEG介导转化禾谷镰刀菌原生质体后成功获得转化子。经PCR筛查,得到3个PCR确认的敲除突变体;表型观察发现,ΔFg PDE1菌落的外型及菌落生长速度与野生型没有明显差异。孢子侵染西红柿果实实验证明:以西红柿为侵染宿主,相对于野生型,突变体致病性没有明显减弱;但突变体分生孢子产量显著下降。结论:Fg PDE1基因可能与禾谷镰刀菌分生孢子的形成有关。     

链格孢菌原生质体的制备与限制性内切酶介导整合(REMI)转化的致病性诱变

以链格孢菌Alternariaalternata菌株NEW为供试菌株,研究了菌龄、酶系统、酶解时间、酶解温度及稳渗剂对链格孢菌原生质体制备的影响。结果表明,制备链格孢菌原生质体比较适宜的条件为PD液体培养基培养20h,以0.7mol/LNaCl为稳渗剂、1%LysingEnzyme、1%Drislase和1%Snailase3种酶溶液混合使用,30℃酶解3h。对原生质体进行了限制性内切酶介导整合(REMI)转化,筛选到了链格孢菌弱致病突变株NEW001,为致病相关基因的标记和克隆打下了基础。     

灰树花gpd-Gf启动子的功能分析

利用从灰树花菌丝体中克隆的gpd-Gf（615bp）启动子片段串联于报告基因gfp上游,构建启动子功能活性检测表达质粒pGg-gfp。采用PEG介导法把表达质粒pGg-gfp与辅助质粒pCc1001（含有trp1基因）共转化进色氨酸营养缺陷型的灰盖鬼伞粉孢子的原生质体中。经过选择培养基筛选、假定转化子的分子鉴定以及GFP荧光检测, 结果表明：灰树花gpd-Gf启动子在灰盖鬼伞菌丝中具有较强驱动gfp基因表达的活性,在荧光显微镜和共聚焦显微镜下可以观察到转化子菌丝发出的强烈荧光。     

粉红聚端孢侵染新红星苹果的侵入途径与侵染时期

粉红聚端孢Trichothecium roseum引致的苹果霉心病发生严重。对于新红星品种,T. roseum的侵染过程尚未明确。本研究利用T. roseum荧光标记菌株TR45分析其在新红星品种上的侵染时期和侵入通道。发现T. roseum可以侵染花器组织,引起枯萎坏死;落花后10-15 d,受侵染的花器残体被萼片包裹于萼筒内,随后T. roseum从离生花柱合并处的孔口部位入侵进入合生花柱,沿花柱内的多细胞毛状体间扩展;花后30 d左右,花柱缝逐渐开裂,随果实膨大心室腔壁也开裂,逐渐形成一条贯通萼筒与心室开放通道——萼窦;花后60 d左右,T. roseum的菌丝沿着萼窦扩展进入心室腔,从心室上的裂缝进入果肉组织,最终引起果实霉心。本研究结果有助于解析新红星苹果品种发病重以及难防治的原因,对苹果霉心病防控新策略构建具有重要理论意义。     

双孢蘑菇萎锈灵抗性基因定点突变的载体构建与遗传转化

为建立更为安全、有效的双孢蘑菇遗传转化体系,构建了双孢蘑菇琥珀酸脱氢酶的铁硫蛋白亚基Agsdi1突变（His突变为Leu）表达载体pAgsdi1,并通过农杆菌介导方法转化双孢蘑菇W192,经萎锈灵筛选以及PCR扩增和MnlⅠ酶切验证后获得了转化菌株。验证结果表明,点突变的铁硫蛋白亚基Agsdi1可以作为双孢蘑菇有效的抗性标记基因。因其并未引入新的外源基因,是一种比潮霉素抗性基因更为安全的筛选标记,将可用于双孢蘑菇等食用菌的遗传转化。     

液泡分选蛋白CfVps17参与调控果生刺盘孢的生长发育和致病力

果生刺盘孢是油茶炭疽病的主要流行致病菌。本文研究果生刺盘孢中液泡分选蛋白CfVps17的生物学功能,为阐明该蛋白调控致病分子机制提供依据。采用over-lap方法构建CfVPS17基因敲除载体片段,使用PEG介导法将敲除载体片段转化至果生刺盘孢原生质体中,通过验证筛选获得突变体菌株ΔCfvps17。构建目的基因CfVPS17回补载体pYF11::CfVPS17,经转化获得ΔCfvps17-C回补菌株。测定野生型、突变体ΔCfvps17及回补菌株ΔCfvps17-C的生物学表型,结果表明,与野生型和回补菌株相比,突变体ΔCfvps17菌丝生长速率、产孢量和附着胞形成率显著降低,突变体菌丝中糖原积累减少,对氯化钠和刚果红胁迫耐受性增强;致病力测定结果表明,突变体ΔCfvps17丧失了对油茶叶片的致病力。液泡分选蛋白CfVps17参与调控果生刺盘孢糖原积累、生长发育、外界胁迫应答和致病力。     

cAMP介导的梨果表皮物化信号对链格孢侵染的调控

采用药理学方法,用cAMP抑制剂阿托品（atropine）处理链格孢Alternaria alternata孢子悬浮液,通过体外试验分析cAMP信号级联通路在链格孢响应梨果皮蜡质疏水性、化学组分和外源乙烯利等刺激后启动孢子萌发、附着胞形成的调控作用,并通过体内试验研究其对链格孢致病性的调控。结果表明,高疏水性表面和梨果蜡涂膜表面及1μmol/L的乙烯利均可显著促进链格孢的孢子萌发和附着胞形成。cAMP信号级联通路抑制剂atropine处理后显著抑制了表皮疏水性、蜡质和外源乙烯介导的链格孢的孢子萌发和附着胞形成,其中抑制剂处理后4h,链格孢在疏水性、果蜡涂膜表面和乙烯等处理中附着胞形成率分别较对照降低了75.3%、63.7%和74.3%,同时抑制剂处理还可抑制损伤接种链格孢早酥梨黑斑病的扩展。外源cAMP可以部分恢复抑制剂的作用,外源cAMP+atropine处理后4h,在高疏水性（108°）和果蜡涂膜表面,链格孢附着胞形成率为抑制剂atropine单独处理的2.4倍和1.6倍,表明cAMP信号级联通路可通过调控侵染结构的形成而影响链格孢对梨果表皮物理化学信号的识别和应答。     

CfAtg8在调控果生刺盘孢正负菌株分化中的功能

由果生刺盘孢Colletotrichum fructicola引起的炭疽叶枯病严重危害苹果果实和叶片。刺盘孢属真菌可以产生具有形态和遗传差异的正型(+)和负型(-)菌株,但其分化的分子机制目前尚不清楚。本研究通过同源重组对CfAtg8功能进行分析,结果显示,CfAtg8显著影响果生刺盘孢正菌株(1104-7)菌落颜色和气生菌丝茂密程度,但不影响负菌株(1104-6);正菌株突变体不产生子囊壳,负菌株突变体子囊壳变小、数量增多;正菌株突变体与负菌株野生型1104-6杂交不形成交配线,负菌株突变体与正菌株野生型1104-7杂交形成正常交配线;此外,CfAtg8还影响正、负菌株分生孢子萌发、附着胞形成及致病性等。这些结果表明自噬基因CfAtg8是影响果生刺盘孢正负菌株分化、形态发育和致病的重要基因。     

PEG介导的黑附球菌遗传转化体系的建立

以生防真菌黑附球菌原生质体为受体、潮霉素抗性基因（ hph）为筛选标记,应用PEG介导法进行了遗传转化体系的研究。潮霉素敏感性测试结果表明,黑附球菌对潮霉素的耐受浓度为50mg/L。PEG介导的黑附球菌原生质体最佳遗传转化体系为：30℃下用2%裂解酶酶解黑附球菌菌丝2h,过滤收集原生质体,经MTC清洗重悬后将质粒pYF11-hph转化黑附球菌原生质体,在RM培养基中混匀再生;经潮霉素药剂筛选和PCR验证,表明外源基因 hph已转入到黑附球菌中并获得稳定表达。本实验成功地建立了稳定的PEG介导的黑附球菌遗传转化体系,为研究其代谢途径、生防机制及构建工程菌株提供了技术保障。     

根癌农杆菌介导的巨大口蘑遗传转化体系的构建

以巨大口蘑菌丝为受体材料,利用含有双元质粒plasmid4的根癌农杆菌EHA105介导,首次成功建立了巨大口蘑的遗传转化体系。通过潮霉素抗性筛选、PCR鉴定和绿色荧光蛋白的检测,表明潮霉素抗性基因（Hyg）已经整合到巨大口蘑基因组中,增强型绿色荧光蛋白基因（eGFP）在巨大口蘑菌丝中获得表达,并能够稳定遗传。本研究建立了农杆菌介导的巨大口蘑遗传转化体系,为今后巨大口蘑的基因功能研究奠定了基础。