PEG 介导的苹果腐烂病菌原生质体转化

摘要: 【目的】建立PEG 介导的苹果腐烂病菌原生质体遗传转化体系。【方法】本文利用带有hph 基因的质粒,以苹果腐烂病菌(Valsa mali var.mali) 03-8 为受体菌株,通过PEG 融合法对其原生体进行转化。【结果】于YEPD 内培养48 h 的菌丝,在酶解液浓度为50 mg /mL Driselase + 10 mg /mL Lysing Enzymes 情况下,按10 mL酶液/0. 5 g湿菌体比例,酶解2 h时可以释放出4 × 107 个/mL 原生质体,其转化效率为44 个/μg DNA。对转化子的PCR 检测和Southern 杂交分析表明,hph 基因已经整合进苹果树腐烂病菌的基因组中。转化子在PDA 培养基中继代5 次后,87. 5% 的转化子仍能正常生长,表明外源基因hph 能在苹果树腐烂病菌中稳定遗传。【结论】该转化体系的建立为苹果树腐烂病菌致病相关基因的深入研究奠定了基础。     

石防风原生质体遗传转化及抗除草剂植株的再生

以石防风（Ｐｅｕｃｅｄａｎｕｍｔｅｒｅｂｉｎｔｈａｃｅｕｍ（Ｆｉｓｃｈ．）Ｆｉｓｃｈ．ｅｘＴｕｒｃｚ．）叶柄愈伤组织为材料建立以致密细胞团为主的悬浮培养物,用酶解法获得原生质体。用ＰＥＧ法将拟南芥菜（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ（Ｌ．）Ｈｅｙｎｈ．）抗除草剂基因导入原生质体后进行液体浅层培养。转化细胞经除草剂ｃｈｌｏｒｓｕｌｆｕｒｏｎ筛选,通过胚状体途径产生抗性小植株。转化处理１０６个原生质体,以加入４０～５０μｇ／ｍＬ质粒ＤＮＡ,ＰＥＧ终浓度为１０％,于１ｍＬ转化介质中,２６℃黑暗下处理２０ｍｉｎ的效果最好。ｃｔＤＮＡ的加入对转化结果无明显影响。分子杂交试验表明,突变的ａｌｓ基因已整合进转化植株的基因组中。转基因植株的细胞在脱分化过程中仍具有抗ｃｈｌｏｒｓｕｌｆｕｒｏｎ的能力;移栽成活的转基因小苗仍表现出抗除草剂特性,而未转化的植株在低浓度除草剂下即逐渐死亡。表明转入的ａｌｓ基因在石防风细胞内能够稳定表达。     

豇豆原生质体遗传转化的研究(简报)

豆科植物中有重要的粮食,油料及蔬菜作物,一直是国内外学者热衷研究的对象。豆科作物遗传转化的研究,虽已取得一些进展,但有关籽粒型豆科重要作物细胞转化的报道仍不多。我们以豇豆下胚轴为材料,探讨了农杆菌介导的和PEG介导的外源DNA转移到豇豆细胞的条件,并获得外源基因稳定表达的转化愈伤组织。豇豆原生质体分离与培养:豇豆种子用0.1%HgCl_2灭菌20min,无菌水冲洗数次后,置1/2MS_0培养基上萌发3—4天(25℃),在超净工作台上切取子叶。参照我们以前所采用的方法分离和培养豇豆原生质体(MS培养基)。     

小麦原生质体高效转化体系的建立

植物原生质体广泛应用于植物基因功能研究中,包括瞬时基因表达、亚细胞定位、蛋白互作和蛋白活性分析等。当前,小麦基因的亚细胞定位和功能分析,大多利用模式植物拟南芥等异源的原生质体,易于造成研究结果的不准确。为避免这种情况,小麦原生质体制备及高效转化体系的建立与应用是必需的。在PEG介导的小麦原生质体转化过程中,原生质体分泌的核酸酶大量降解质粒DNA,转化效率的提高因此受到阻碍。为了建立小麦原生质体的高效转化体系,本文测试了抑制胞外核酸酶活性的因素和提高质粒DNA浓度等多个条件对转化效率的影响。结果表明,转化过程中加入双倍用量的质粒DNA进行转化,且始终保持低温环境(1℃)用以抑制核酸酶酶活性,可以使小麦原生质体的转化效率提高至85%。本文还将该系统成功地应用于2个小麦抗病相关蛋白的亚细胞定位研究,证明了该系统的高效性和实用性。该研究对未来相关研究有一定参考价值。     

玉米大斑病菌(Exserohilum turcicum)原生质体的分离及转化

玉米大斑病是严重危害玉米生产的一个世界性真菌病害。由于玉米大斑病菌(Exserohilum turcicum)在无性生长过程中迅速产生黑色素,致使原生质体难以分离。测试了包括Fungase、Funcelase、Novozyme、Glucanex、Driselase、Uskizyme、Kitalase在内的7种细胞壁降解酶及其组合、病原菌菌株和培养基对原生质体分离效果的影响。结果表明菌株的培养形态和菌丝的生长状态显著影响原生质体的分离效率;酶组合Kitalase Glucanex Driselase,Kitalase Glucanex和Kitalase Uskizyme能够有效地分离玉米大斑病菌的原生质体。初步的转化试验表明,质粒pAN71可以用于该病原菌的转化。这些结果将为E．turcicum和Exserohium属其它真菌的基因克隆提供一些有用的信息。     

基于PEG介导原生质体转化构建粉红聚端孢荧光标记

粉红聚端孢是多种植物的重要病原菌。本研究通过酶解粉红聚端孢幼嫩菌丝细胞壁获得原生质体,用PEG介导原生质体转化将携带GFP基因和博来霉素抗性基因的外源DNA随机插入粉红聚端孢基因组,共获得博来霉素抗性菌株90株,转化效率达18个/μg。选取22株转化子荧光观察,发现均可表达荧光,菌株间荧光强度不同,其中10株转化子荧光表达较强。与野生型相比,突变菌株TR45的菌落生长、产孢量和致病力等生物学特性均未改变,在不含博来霉素的培养皿中继代培养10代荧光仍能稳定表达。本研究构建的高效原生质体制备和PEG介导粉红聚端孢遗传转化方法,可用于该菌基因功能研究,绿色荧光标记菌株可用于病菌侵入、田间监测、侵染循环等发生规律研究。     

电击法诱导的欧白英原生质体转化和转化植株再生

本研究使用电击法成功地将带有标记基因NPTⅡ的质粒pCaMVNEO转入欧白英的原生质体,并获得了再生转化植株。通过用pDW2质粒进行的CAT基因短暂表达研究,确定了欧白英原生质体转化的电击条件为：电容30nF、电场强度l 500V／cm、时间衰变常数59．4微秒;质粒DNA浓度为20μg／2×10⁶原生质体。在以上条件下,欧白英原生质体的相对转化率为12．4％,绝对转化率为2.4×10^-4在大多数抗性愈伤组织和从抗性愈伤组织再生的植株中检测到新霉素磷酸转移酶活性。分子杂交结果也证明了在转化植株中存在NPTⅡ基因序列,而未转化的对照植株则没有。     

新疆不同来源金黄壳囊孢的多样性

为明确新疆不同寄主及地理来源的金黄壳囊孢(Cytospora chrysosperma)的多样性, 探讨种内亲缘关系和多样性差异。作者通过记录菌株在PDA培养基上的菌落颜色、形状、子实体形态等特征, 并应用Biolog-FF技术及ISSR分子标记技术, 比较了来自新疆5个地区5种寄主上的47株金黄壳囊孢的培养特征、生理生化特征及遗传多样性。结果表明47株金黄壳囊孢依据培养特征可划分为15种类型。不同类型菌株在碳源利用及代谢能力上存在差异, 各菌株对碳源的利用数量随着培养时间的增长逐渐增多。菌株882利用的碳源数量最多, 培养120 h可利用28种不同碳源, 碳源代谢能力中等; 菌株812-1利用的碳源数量最少, 培养120 h仅利用7种碳源, 代谢能力较低; 菌株1074-2、847、934、891-1、896、740具有单独利用碳源的能力。基于遗传相似性系数进行聚类分析, 结果显示遗传相似性系数为0.58时, 47个菌株被划分为两大类群, 其中第二类群菌株的培养特征为: 菌落白色、子实体较小且分布密集。供试金黄壳囊孢的多样性主要受自身遗传结构的影响, 不同寄主种类和地理来源对多样性的影响不显著。     

鹅膏菌抑真菌活性及其活性物质的提取工艺优化(英文)

通过鹅膏菌抑菌活性物质对杨树烂皮病病原菌金黄壳囊孢菌的菌丝生长及其孢子抑制效果的研究,分析鹅膏菌的抗真菌活性。将培养15 d的鹅膏菌液体发酵物分成培养液和菌丝体两部分,然后分别将培养液、菌丝体提取物和发酵液本身对金黄壳囊孢菌菌丝生长和孢子萌发抑制效果进行检测。结果表明:培养液对金黄壳囊孢菌菌丝生长的抑制率最高,为68.90%;三者对孢子萌发都有明显的抑制效果,即在处理后10 d孢子都没有萌发。菌丝体在超声波、加热和浸泡的条件下,利用乙醇,丙酮、乙酸乙酯和正丁醇进行提取,其提取物用于病原菌的抑制效果检测,结果表明:用乙醇和丙酮提取时,超声波、浸泡及加热处理,对金黄壳囊孢菌的抑制效果都与对照有显著差异(a=0.01),而正丁醇的提取物的抑制效果较差,与对照没有显著差异。通过不同提取物对金黄壳囊孢菌菌丝生长和孢子萌发的抑制效果进行分析,并对抑菌活性物质提取工艺进行筛选,得到抑菌活性物质提取的最佳方法为摇床培养,乙醇是最适提取溶剂,处理方式(超声波、浸泡或者加热)相互间差异不显著。     

金黄壳囊孢菌侵染过程中银中杨锌指蛋白基因的表达

研究了银中杨接种金黄壳囊孢菌后锌指蛋白基因的表达;为林木抗病遗传育种工作奠定基础。从杨树上分离得到了一株杨树烂皮病菌（CHH001）;测定其对银中杨的致病力;并采用形态学和ITS-PCR鉴定方法鉴定该菌株为金黄壳囊孢菌。采用实时定量荧光PCR技术对银中杨接种金黄壳囊孢菌后锌指蛋白基因的表达进行了研究。实验结果显示;ZFP1和69-Ⅳ-2-4在接种后表达水平持续上升;ZFP1在48 h的基因表达量分别为烫伤对照和空白对照的4.21倍和3.11倍;69-Ⅳ-2-4在48 h为烫伤对照和空白对照的9.56和7.06倍。ZFP1和69-Ⅳ-2-4在接种前期高表达;表明可能参与了植物与病原物的识别过程和防御反应。     

香蕉生物技术研究进展

近50年来香蕉的生产得到了稳步的发展,同时正遭受越来越严重的病虫、霜冻和台风的侵害。鲜食蕉雌雄性高度不育的特性,使得传统的育种方法难以进行香蕉的遗传改良。这些现状迫切要求香蕉生物技术的不断发展和深入。近10年来,在香蕉体细胞胚胎发生、原生质体培养、基因克隆和序列分析以及基因转化等方面都取得了可喜的成果,并预计于2006年完成香蕉基因组的测序 。     

Genetic diversity of Valsa malicola isolates assessed by microsatellite-primed PCR (MP-PCR)

Genetic diversity of 40 isolates of Valsa malicola in Iran was investigated by MP-PCR. Isolates were obtained from different host plants in diverse regions during 2004–2010. Of the six microsatellite primers tested, only four primers; (ACTG)₄, (GACA)₄, (AC)₈ and (CGA)_5, were able to amplify DNA fragments. With these four primers, 120 loci were identified; of which eight were monomorphic (6.7%) and 112 were polymorphic (93.3%). Approximate size of amplified DNA fragments ranged from 0.2 to 3?kb. Observed high genetic diversity in isolates of V. malicola indicates the eligibility of the marker to investigate ranks below the species level. The results of cluster analysis indicated that isolates are related to each other with 45.63% similarity and four groups (1, 2, 3 and 4) were identified in the dendrogram. Group 3 included 37 isolates that were obtained from different hosts and geographical regions and each of groups 1, 2 and 4 only had one isolate. Some correlations between identified groups and host origins or geographic distributions of the isolates were found.     

绿色荧光蛋白基因作为报告基因在水稻基因转化中的应用研究

本研究中 ,构建了含有编码绿色荧光蛋白的改进型基因质粒pJPM5。用基因枪法分别把pJPM5和另一带有绿色荧光蛋白基因的质粒pSBG70 0转入水稻TNG6 7愈伤组织。用South ern杂交法证实了转基因的存在 ,而且表明多数转基因植株含有 1到 8个拷贝的转基因。取 2个月的转基因植株上的叶片用于分析绿色荧光蛋白基因表达。用SLM - 80 0 0荧光分析仪定量测定绿色荧光蛋白。多数转基因植株具有很高的绿色荧光蛋白信号。虽然水稻植株有少量自发荧光 ,但是绿色荧光蛋白基因表达出的绿色荧光蛋白信号比植株的自发荧光强得多 ,其测定不会受自发荧光的太大影响。在荧光显微镜下观察到了绿色荧光蛋白基因的表达。借助观察分析绿色荧光蛋白基因的瞬时表达 ,本研究还发现基因枪法转化中 ,如果两枪的气压为90 0psi& 135 0psi,比两枪的气压都为 90 0psi或者 135 0psi更好 ,因其能使质粒进入更多的细胞。研究结果表明 ,绿色荧光蛋白基因可以作为水稻 (甚至小麦、玉米 )转基因研究中的报告基因。研究还显示 ,MAR序列能明显增强绿色荧光蛋白基因的表达能力 (这一结果在另文讨论 ) .     

果树遗传转化及基因组转移研究进展

果树遗传转化及基因组转移研究进展邓秀新,刘继红（武汉华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室武汉４３００７０）关键词果树,遗传转化,原生质体融合,体细胞杂种ＡＤＶＡＮＣＥＳＩＮＧＥＮＥＴＩＣＴＲＡＮＳＦＯＲＭＡＴＩＯＮＡＮＤＧＥＮＯＭＥＴＲＡＮＳＦＥＲ...     

绿色荧光蛋白(ZsGreen)基因在长石莼细胞中的表达

主要研究绿色荧光蛋白(ZsGreen)基因在长石莼(缘管浒苔)细胞中的表述.应用绿色荧光蛋白基因、抗除草剂bar基因、CMV 35S启动子和SV40双启动子构建了质粒载体PSV-bar-ZsGeen,采用改进的PEG法将质粒载体PSV-bar-Zs-Geen导入到缘管浒苔原生质体中,经过细胞培养发育再生藻株,通过除草剂筛选出阳性藻株,且转化率达38.58％,进一步PCR分子检测和显微荧光检测表明,绿色荧光蛋白基因在转基因植株中得到表达,为今后转基因浒苔研究奠定基础.