| 杨树腐烂病菌(Cytospora chrysosperma)原生质体遗传转化体系的构建 |
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| 引用本文： | 刘玲玲,王永林,熊典广,徐鑫,田呈明,梁英梅.杨树腐烂病菌(Cytospora chrysosperma)原生质体遗传转化体系的构建[J].微生物学通报,2017,44(10):2487-2497. |
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| 作者姓名： | 刘玲玲 王永林 熊典广 徐鑫 田呈明 梁英梅 |
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| 作者单位： | 1. 北京林业大学林学院 北京 100083,1. 北京林业大学林学院 北京 100083,1. 北京林业大学林学院 北京 100083,1. 北京林业大学林学院 北京 100083,1. 北京林业大学林学院 北京 100083,2. 北京林业大学标本馆 北京 100083 |
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| 基金项目： | 国家林业公益性行业科研专项项目(No. 201204501)；高等学校博士学科点专项科研基金项目(No. 20130014110004)；北京市支持中央在京高校共建项目(No. 2050205) |
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| 摘 要： | 【目的】通过分析不同酶解条件对金黄壳囊孢菌Cytospora chrysosperma(Pers.)Fr.]原生质体释放的影响,建立高效制备原生质体及其遗传转化体系的方法,为开展杨树腐烂病菌的致病分子机制研究奠定基础。【方法】以杨树腐烂病菌菌株CFCC 89981为受体,在细胞壁降解酶作用下产生用于转化所需的原生质体,通过PEG(Polyethylene glycol)介导将g GFP DNA导入杨树腐烂病菌的原生质体中获得转化子。经PCR扩增、Southern blot和荧光观察验证g GFP DNA插入到杨树腐烂病菌基因组中并表达出GFP(Green fluorescent protein)蛋白。【结果】以p H 5.5的1.2 mol/L KCl为稳渗剂,杨树腐烂病菌菌丝经Driselase和Lysing enzymes共同酶解4 h可获得1.2×108个/m L原生质体,再生率可达63.74%±9.73%,FDA(Fluorescein diacetate)溶液染色结果显示98%左右的原生质体具有较高的活力。利用PEG介导的遗传转化方法,转化效率可达76个/μg DNA。PCR检测和Southern blot均可在转化子基因组中检测到GFP基因片段,且荧光检测转化子的菌丝均呈绿色荧光,表明GFP基因在杨树腐烂病菌中表达。此外,GFP转化子在无潮霉素抗性的PDA培养基中多代转接后仍稳定遗传并表达GFP蛋白。【结论】通过筛选酶解条件,获得高质量、高活性的杨树腐烂病菌原生质体,并利用PEG介导的转化方法建立了高效稳定的原生质体遗传转化体系。该体系的建立为杨树腐烂病菌的后续研究奠定了技术基础。
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| 关 键 词： | 杨树腐烂病，金黄壳囊孢菌，原生质体，遗传转化，GFP基因 |
Genetic transformation system of Cytospora chrysosperma, the causal agent of poplar canker |
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| LIU Ling-Ling,WANG Yong-Lin,XIONG Dian-Guang,XU Xin,TIAN Cheng-Ming and LIANG Ying-Mei.Genetic transformation system of Cytospora chrysosperma, the causal agent of poplar canker[J].Microbiology,2017,44(10):2487-2497. |
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| Authors: | LIU Ling-Ling WANG Yong-Lin XIONG Dian-Guang XU Xin TIAN Cheng-Ming and LIANG Ying-Mei |
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| Institution: | 1. College of Forestry, Beijing Forestry University, Beijing 100083, China),1. College of Forestry, Beijing Forestry University, Beijing 100083, China),1. College of Forestry, Beijing Forestry University, Beijing 100083, China),1. College of Forestry, Beijing Forestry University, Beijing 100083, China),1. College of Forestry, Beijing Forestry University, Beijing 100083, China) and 2. Museum of Beijing Forestry University, Beijing Forestry University, Beijing 100083, China |
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| Abstract: | |
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| Keywords: | Poplar canker Cytospora chrysosperma Protoplast Genetic transformation GFP gene |
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