转Bt基因植物中外源基因时空动态表达的研究现状

在转Bt基因植株中 ,外源基因的时空动态表达对于害虫的防治和转基因安全评价管理具有重要意义。利用生物测定法和酶联免疫吸附测定法 (ELISA) ,对植物不同组织在同一发育阶段、同一组织在不同的发育阶段以及不同转基因植株的外源基因的时空动态表达进行研究。本文综述了转基因植物中外源基因时空动态表达的研究进展和现状。     

根癌农杆菌介导的转新城疫病毒融合蛋白基因水稻植株的获得

利用转基因植物作为生物反应器可以表达重组蛋白、生产外源蛋白质,也可以成为动物疫苗的廉价生产系统。以编码新城疫病毒融合蛋白(NDV-F)的基因为外源基因,以玉米泛素蛋白(Ubi)启动子为启动子,以潮霉素磷酸转移酶(HPT)基因作为选择标记基因,β-半乳糖苷酸酶(GUS)基因作为报告基因构建了适宜于农杆菌介导转化水稻的表达质粒pUNDV,并通过农杆菌介导转化水稻,获得了多株转基因植株。通过PCR分析和GUS活性检测,证实含有NDV-F基因的T-DNA已整合到水稻核基因组中,为研制廉价安全的转基因水稻新城疫基因工程疫苗奠定了基础。     

铁皮石斛DoSMT2基因的功能分析

为了揭示铁皮石斛(Dendrobium officinale)甾醇C-24甲基转移酶2基因(DoSMT2)在甾醇代谢过程的功能,该研究通过根癌农杆菌介导法将来源于铁皮石斛的DoSMT2基因转化烟草(Nicotiana tabacum),并采用qRT-PCR技术检测DoSMT2基因在转基因烟草叶片中的表达,采用气相色谱质谱法分析菜油甾醇和谷甾醇的含量。结果显示:(1)成功获得DoSMT2基因的开放阅读框(1 119 bp),并成功构建正义植物表达载体质粒pCXSN-DoSMT2,经农杆菌介导的烟草叶盘转化法转化烟草并鉴定,获得4株阳性转基因烟草植株。(2)Southern blot结果表明,4株转基因烟草植株都有1条杂交信号带,而非转基因烟草植株没有,说明外源DoSMT2基因都以单拷贝整合到4株转基因烟草基因组中。(3)qRT-PCR检测显示,非转基因烟草未检测到外源DoSMT2基因的表达,4株转基因烟草都能检测到DoSMT2基因的表达,且表达水平差异极显著,各株系表达量高低依次为P3P1P2(P4)。(4)气相色谱质谱分析显示,转DoSMT2基因烟草叶片的菜油甾醇含量均极显著低于非转基因烟草叶片,而谷甾醇含量均极显著高于非转基因烟草叶片。研究表明,DoSMT2具有催化24-亚甲基胆甾烯醇转化形成24-亚乙基胆甾烯醇活性。     

植物遗传转化表达载体研究进展

植物遗传转化表达载体是植物转基因研究中非常重要的一个环节,外源基因在转基因植物中的高效表达是转基因研究成功的关键。综述了植物遗传转化表达载体近年来的研究进展情况,着重介绍了在转基因植物中实现外源基因高效表达的多种途径和策略,旨在提高转基因植物中外源基因的表达水平和生物安全性,并展望了今后植物转基因研究及商业化发展方向。     

人地中海贫血β654基因作为外源基因用于转基因的制备方法

目的探讨人地中海贫血β654基因为外源基因用于转基因小鼠制作时,外源基因的制备方法,为进一步制作转基因小鼠打下基础。方法采用反向点杂交法确诊人地中海贫血β654纯合子DNA,以PCR法扩增获得人地中海贫血β654基因,分离纯化后,通过连接酶反应将其克隆入含βLCR调控序列的基础载体pBGT51质粒中,经PCR扩增、酶切、反向点杂交及DNA测序鉴定重组质粒,用EcoRⅤ酶切获得转基因所用的外源基因。结果将人地中海贫血β654基因作为外源基因克隆入基础载体pBGT51质粒中构建了重组质粒βBGT51,用EcoRV酶切获得含人β654基因及βLCR调控序列的6.5kb的DNA片段,制备了可用于显微注射转基因的外源基因。结论采用该方法构建的含人地中海贫血β654基因的重组质粒,可获得用于显微注射转基因的外源基因。     

clGH与EGFP基因融合表达载体的构建及其在斑马鱼胚胎发育阶段的表达

以模式动物斑马鱼(Danio rerio)为材料,研究了革胡子鲶生长激素(growth hormone of clarias lazera,clGH)基因的表达。以clGH基因为外源基因,以增强型荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因为报告基因,通过体外酶切和连接,构建了含有这两个基因的融合表达载体pCEGFP-clGH。通过显微注射方法,将pCEGFP-clGH转入斑马鱼受精卵进行表达。结果显示,成功得到了携带外源clGH基因的转基因斑马鱼,并可在胚胎发育的不同阶段(0-72h)观察到绿色荧光,荧光表达率分别为7.2%,45.7%,71.7%和8.5%;外源基因的表达特点为嵌合型、瞬时表达;外源基因最早在斑马鱼胚胎发育的囊胚期(3h)开始表达,在注射后24h达到最强,在仔鱼孵出前后(72h)表达水平降至最低。本试验构建的融合表达载体正确,为今后进一步研究clGH基因的功能及利用clGH基因进行快速生长转基因鱼的培育提供参考。     

外源基因在转基因油菜染色体上的定位及分析

原位杂交技术 ( in situ hybridization,ISH)是基因定位的主要技术之一。近来 ,随着植物细胞染色体制片技术的发展 ,以及酶联放大检测系统的采用 ,在植物中已有低拷贝和单拷贝甚至小于 1 kb的 DNA序列定位的成功报道 [1 ,2 ]。染色体原位杂交技术不仅可以用于基因的物理作图 ,而且可以用来对转基因植物中的外源基因进行染色体定位 [3 5] 。研究表明 ,外源目的基因在转基因植物中的表达与整合位点有关 [6] 。因而 ,进行外源基因在转基因植物染色体上的定位以及研究外源基因的整合位点与表达之间的关系 ,对于开发和利用转基因植物具有重要…     

提高转基因表达水平的策略

随着转基因相关技术的发展,转基因动物技术在许多方面得到了成功应用.但外源基因在体内的表达仍然难以预测,特别是大动物的转基因,由于制备效率低下,因而难以筛选出足够的高表达的阳性动物数.基因表达调控研究对提高外源基因在动物体内的表达水平提供了一些新手段,本就避免转基因的位置效应、控制外源基因在动物宿主基因组中的整合、提高转基因的表达效率、构建转基因载体和使用外源基因需要注意的问题等进行综述.     

大豆诱导型启动子驱动类受体蛋白激酶GmSARK转基因植物分析

植物LRR型类受体蛋白激酶在植物生命活动中发挥着重要作用。前期研究发现, 大豆(Glycine max)LRR型类受体蛋白激酶基因GmSARK可能参与调控大豆叶片的衰老过程。利用CaMV 35S启动子驱动组成型过表达GmSARK基因可导致转基因植株出现致死表型, 据此构建了可诱导型启动子GVG驱动GmSARK基因过表达的双元表达载体, 转化野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana)并获得了多株转基因植株。研究结果表明, 外源施加诱导物地塞米松可引起GmSARK基因在转基因植株中过表达, 并导致转基因植株出现叶片变黄下卷和生长受抑制等表型; 外源细胞分裂素处理可以抑制GmSARK的表达, 但是不能逆转GmSARK过表达所引起的上述变化。     

groESL启动子提高集胞藻6803外源egfp基因表达效率的研究

利用聚球藻7942中热激蛋白基因groESL的启动子(PgroESL)驱动外源egfp基因在集胞藻6803(Syn-echocystis sp.PCC6803)中的表达,通过蛋白免疫印迹技术研究不同温度条件下该外源基因的表达情况。结果表明,42℃诱导30min后,PgroESL启动子能显著提高转基因藻Pg中外源egfp基因的表达,使外源基因的表达量比正常温度条件下提高3.4倍。研究表明,聚球藻7942中groESL操纵子的启动子区域是一类可以受温度诱导的强启动子,能够显著提高宿主细胞中外源基因的表达效率。     

转基因植物外源基因的整合分析

外源基因表达的不稳定性和多样性是制约转基因作物育种研发进度的关键因素,外源基因的整合情况与外源基因的表达直接相关,充分了解外源基因的整合情况可为构建高效表达载体、获得外源基因稳定一致表达转基因材料提供参考,同时为转基因作物的安全利用提供保障.就外源基因整合情况的分析方法、不同转化方法外源基因的整合特点及利用定点整合技术提高外源基因表达稳定一致性的研究进展作一概述.     

人乳铁蛋白 (hLF) 转基因山羊的遗传背景分析

以随机整合方式获得的转基因动物外源基因的拷贝数、整合位点及染色体核型等遗传背景并不清楚,可能会存在外源基因的沉默整合、无效整合、毒性整合以及其表达水平不可预测等问题。文中选取了6只原代(F0)及其相对应的子一代(F1)的人乳铁蛋白(hLF)转基因山羊作为研究对象,分别颈静脉采血、提取DNA,通过染色体核型分析、实时荧光定量PCR(qPCR)、ELISA和Westernblotting等检测技术,研究其外源基因的遗传背景与表达水平。结果显示,6只F0代转基因山羊的染色体没有明显的形态变异、数量改变等异常情况。相对拷贝数高低不同(2–16),且能够稳定地遗传给下一代,F0和F1代hLF基因拷贝数一致。F1代转基因山羊表达hLF水平最高可达1.12 g/L(L3-1,拷贝数8)。结果表明,整合的外源基因能够稳定地遗传下一代,也没有对转基因山羊个体的生长发育造成障碍,而且拷贝数高低与hLF表达水平无明显的相关性,这为转基因山羊及其他转基因动物的新品种培育奠定了基础,解析了遗传背景。     

花粉介导法获得耐草甘膦玉米植株及其耐性研究

为获得耐草甘膦转基因玉米植株,进而研究其除草剂耐性及外源基因的遗传特性,以质粒p BI101-aroA-M12为外源基因供体,以玉米自交系昌‘7-2’为受体,采用花粉介导法将外源基因导入玉米自交系中。PCR扩增、Southern杂交分析的结果证明获得了54个转基因植株;对其后代株系的分子检测及田间生物学鉴定,结果证明目的基因可以稳定遗传给后代植株,且赋予和提高了转基因植株的除草剂耐性。目的基因在转化体中的遗传规律研究,结果显示导入的目的基因在F2受体植株中以3∶1的比例发生遗传分离,符合孟德尔单因子显性遗传分离规律。ELISA分析和蛋白质浓度测定的结果证实目的基因在转化植株中得到表达,表达量介于40.5-112.6 ng/g叶片鲜重之间,目的基因表达量与该植株的除草剂耐性性状间呈极显著相关,r=0.942 3(P0.01)。最终研究获得了4个高草甘膦耐性的转基因纯合株系。     

NaCl胁迫对转基因杨树外源基因表达的影响

以具高抗虫性的转抗虫基因‘741杨’及在此基础上转入了发根农杆菌Ri质粒T-DNA株系的组培苗为材料,研究了转基因株系BtCrylAc抗虫基因和发根基因的表达及其对NaCl胁迫的反应。结果表明,转入Ri质粒T- DNA上的rol基因后,导致苗木根系数目增加,根系长度减小,IAA和GA含量显著提高,抗虫BtCrylAc基因编码的毒蛋白的表达量降低;随着NaCl胁迫强度的增加,苗高、根系数量、叶绿素含量及IAA、GA含量逐步降低,而根系的长度加大,Bt毒蛋白含量显著提高,表明NaCl胁迫使转基因杨外源Bt毒蛋白基因的表达增强,而发根农杆菌Ri质粒T-DNA的表达下降。     

小鼠金属硫蛋白在聚胞藻中的金属诱导表达与纯化

应用蓝藻类金属硫蛋白基因启动子(smt O-P)的金属诱导性,在单细胞的聚胞藻PCC 6803中表达小鼠金属硫蛋白结构基因(mMT-1 cDNA)。在大肠杆菌HB 101中构建含有smt O-P和mMT1 cDNA的穿梭表达载体pKT-MRE,经质粒转移,链霉素筛选,Southern和Western杂交分析鉴定得稳定的转基因工程藻落。同时,做小批量锌诱导表达,并纯化了外源蛋白,5L培养液含鲜藻重5.0g,得到3.5mg mMT-1;转基因藻在高金属浓度下的耐受性测定表明,外源基因的表达提高了蓝藻对金属离子的抗性,约为野生藻的2倍。     

转座子介导的多角体基因表达及提高病毒粒子的感染效率

现行的杆状病毒表达外源基因的方法是将外源基因取代病毒中的多角体基因,因而得到的重组杆状病毒感染活体时不能经口感染,只能进行针刺注射,效率低且易引起活体感染其他疾病。将家蚕核型多角体病毒(Bombyx mor inucleopolyhedrovirus,BmNPV)中的多角体基因(polyhedrin,poly)及其启动子片段克隆到转座子载体pigA3GFP中,将其与辅助质粒pHA3PIG利用脂质体介导法导入家蚕细胞中,经过多次筛选获得稳定的转基因家蚕细胞。之后先将BmPAK6(含LacZ)及BmGFP(含GFP)重组病毒分别感染转基因细胞,再将得到的重组病毒经口感染5龄家蚕幼虫。结果显示,重组杆状病毒可以经口感染家蚕幼虫。这些研究表明来自于转基因家蚕细胞的poly基因表达产物可以提高重组杆状病毒经口感染家蚕率,为解决杆状病毒表达系统中重组病毒不能经口感染家蚕幼虫的问题提供新思路。     

基于逆转录病毒载体的外源基因表达系统的评价和应用

逆转录病毒表达系统是基因治疗研究和RNA干扰技术广泛采用的外源基因表达系统。文中以增强型绿色荧光蛋白 (EGFP) 基因的表达水平和稳定性为指标,比较逆转录病毒表达载体pQCXIN和pcDNA3.1(+) 表达质粒介导的外源基因在HEK293细胞和CHO-K1细胞的表达效率。病毒感染HEK293细胞和CHO-K1细胞的相对荧光强度 (Relative fluorescence intensity,RFI) 均约为对应的质粒转染细胞的2倍。多轮反复感染逆转录病毒表达载体能有效提高HEK293细胞表达EGFP的效率。HEK293细胞经4轮病毒感染后的RFI值较1次病毒感染HEK293细胞的RFI值约提高2倍。此外,逆转录病毒表达载体介导的外源基因表达的稳定性优于质粒转染的外源基因表达。采用携带人重组活性蛋白C (Recombinant human activated protein C,rhAPC) 基因的pQCXIN和HEK293细胞进一步验证了逆转录病毒载体介导的外源基因表达效率,构建了rhAPC表达水平为10~15 mg/(106 cells·d) 的HEK293细胞系。研究结果表明,逆转录病毒表达系统是有应用价值的介导外源基因在哺乳动物细胞高效表达的技术途径。     

酵母α因子表达系统的构建

 我们提取了酵母(Saccharomyces cerevisiae)的α因子基因,并组建了一系列含有α因子引导肽编码序列的质粒。这些质粒可用于外源基因在酵母中表达的研究。     

核基质结合区在转基因烟草中对转基因表达的影响

为研究核基质结合区 (matrixattachmentregions,MARs)在转基因植物中对外源转基因 (transgene)表达的影响 ,将来源豌豆 (PisumsativumL .)的MARs序列构建在报告基因 β_葡糖醛酸酶 (β_glucuronidase ,GUS)基因 (uidA)的两侧形成植物表达载体。将此载体与不包含MARs序列的植物表达载体经根癌土壤杆菌 (Agrobacteriumtumefaciens(SmithetTownsend)Conn)介导转化烟草 (NicotianatabacumL .)。GUS活性检测表明 ,MARs可以提高外源uidA基因的表达水平。和不包含MARs的转化植株相比 ,MARs序列的存在可以使uidA基因的平均表达水平提高 2倍 ,最高的可达 5倍     

芪合酶基因Fm-STS在何首乌毛状根中的过量表达分析

目的:通过过量表达探究在何首乌中得到的芪合酶基因Fm-STS的功能.方法:由含CaMV 35S启动子驱动以及荧光标记蛋白(Green fluorescent protein,GFP)基因的植物转基因基础表达质粒pBIN-35S-GFP构建过量表达质粒pBIN-35S-STS-GFP(阳性),并同空白表达质粒pBIN-35S-GFP(空白)均导入野生型发根农杆菌ATCC15834中,转化何首乌外植体(无菌苗叶片),诱导生成毛状根并培养,对毛状根进行高效液相色谱分析芪合物二苯乙烯苷含量变化以及实时荧光定量检测基因Fm-STS表达差异.结果:在过表达组和空白组中毛状根中发根农杆菌Ri质粒中的rolB基因和外源基因GFP均有表达,芪合物二苯乙烯苷含量依次为4.67 mg/g和2.18 mg/g(干重),在mRNA水平上检测基因Fm-STS表达量:过表达组是空白组的2.41倍.结论:基因FM-STS是何首乌中芪合物二苯乙烯苷生物合成过程中的酶基因,过量表达在基因功能研究中有良好的应用.