不依赖甲硫氨酸的翻译起始

Ｓａｓａｋｉ等在ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ 2 0 0 0年第 4期上报道了一种不依赖甲硫氨酸的翻译起始方式[1] 。ＰＳＩＶ (Ｐｌａｕｔｉａｓｔａｌｉｉｎｔｅｓｔｉｎｅｖｉｒｕｓ)是一种昆虫ＲＮＡ病毒 ,属蟋蟀麻痹样病毒组 (Ｃｒｉｃｋｅｔｐａｒａｌｙｓｉｓ ｌｉｋｅｖｉｒｕｓｅｓ) ,为正链ＲＮＡ病毒。属于该组的还有ＤＣＶ、ＲｈＰＶ、ＨｉＰＶ等。该组病毒的理化性质与哺乳动物的小ＲＮＡ病毒 (ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｕｓ)相似 ,但基因图 1　 (Ａ)ＰＳＩＶ基因组结构 ;(Ｂ)预测的外壳蛋白编码区上游的茎环结构组织不同。…     

丙型肝炎病毒中国株非结构蛋白2~3部分基因cDNA克隆序列分析及表达

丙型肝炎病毒 (ＨｅｐａｔｉｔｉｓＣｖｉｒｕｓ,ＨＣＶ)是输血后和许多社区获得性非甲非乙肝炎的主要致病因子。ＨＣＶ为单股正链ＲＮＡ病毒 ,其基因组长约 9.5Ｋｂ ,编码区含一个大开放读码框架 ,编码 30 1 0 30 33氨基酸残基的多蛋白前体 ,经宿主蛋白酶和病毒蛋白酶加工成具有生物学功能的成熟蛋白。ＨＣＶ各区域的分布顺序是 :Ｃ Ｅ1 Ｅ2 ｐ7 ＮＳ2 ＮＳ3 ＮＳ4Ａ ＮＳ4Ｂ ＮＳ5Ａ ＮＳ5Ｂ[1] 。本文我们应用ＲＴ ＰＣＲ方法从ＨＣＶ患者血清中扩增编码病毒蛋白酶的非结构蛋白 (ＮＳ2 ＮＳ3)部分基因 ,对其核苷酸序列进行了分析 ,…     

草鱼出血病病毒多肽的基因定位

用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离纯化的草鱼出血病病毒ＧＣＨＶ８７３的基因组ｄｓ－ＲＮＡ的１１个片段,分别在麦胚无细胞翻译体系中进行翻译。其翻译产物经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ系统分析。结果表明,基因组片段１、２、３、４、５、和１０分别编码病毒核心衣壳的结构多肽ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４、ＶＰ５和ＶＰ１０,片段６和７分别编码病毒外层衣壳的结构多肽ＶＰ６和ＶＰ７。片段８和９分别编码５２ｋＤ和４１ｋＤ的多肽,片段１１编码两种多肽,分子量分别为２９ｋＤ和１９．５ｋＤ,它们与病毒结构多肽无明显对应关系。病毒基因组与多肽大体是一一对应的关系。     

HCV NS5A基因表达及其在血清学检测中的应用评估

人丙型肝炎病毒 (ＨＣＶ)感染可引起丙型肝炎、肝硬化和肝细胞癌[1] 。丙型肝炎病毒是单股正链ＲＮＡ病毒 ,基因组约长 9.5ｋｂ ,仅有一个开放阅读框 ,编码一个大的聚蛋白前体 ,由宿主蛋白酶和病毒编码的蛋白酶加工成多个成熟蛋白。非结构蛋白ＮＳ5Ａ分子量为 56ｋＤ/ 58ｋＤ。目前对ＮＳ5Ａ蛋白的功能尚不清楚 ,ＮＳ5Ａ蛋白可降低干扰素治疗效果[2 ] ;ＮＳ5Ａ蛋白含核定位序列 ,因此人们推测它在ＨＣＶＲＮＡ复制过程中可能起一定的作用[3～ 4 ] 。本研究在大肠杆菌中表达全长ＮＳ5Ａ蛋白 ,提纯后ＮＳ5Ａ蛋白能与大多数丙肝阳性血清起强烈…     

寄主防卫过程中病毒的维管积集与传播

长期以来 ,对病毒侵染的研究 ,在病毒复制及病毒的细胞间转移方面相对要深入一些[1] ,但对病毒的组装、依赖于维管系统的长距离运输等的认识非常有限[2 ] 。对寄主防卫系统及其机制的认识则主要限于一些抗性因子的证实 ,如抗ＴＭＶ的烟草上分离的Ｎ基因 ,抗ＰＶＡ的马铃薯上分离的Ｒ基因 ,以及一些病程相关蛋白因子 ,如几丁质酶Ａ(ＣｈｔＡ)和ＰＲ 1 0ａ等[2～4 ] 。借助于一些标记蛋白 ,如β ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ(Ｇｕｓ)、Ｌｉｃｉｆｅｒａｓｅ(Ｌｉｃｉ)和ｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ(ＧＦＰ)等 ,通过跟踪嵌…     

HCV5＇端非编码区cDNA的体外转录

采用逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）从广东省一例慢性丙型肝炎病人血清中获得丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）５＇端非编码区（５＇ＮＣＲ）３０２ｂｐ的ｃＤＮＡ片段,经补齐和提纯后插入ｐＵＣ１９质粒,获得的重组体ｐＵＮ进行序列测定。将ｐＵＮ的目的基因亚克隆进体外转录载体ｐＳＰＯＲＴＩ多克隆位点的ＥｏｏＲＩ和ＰｓｔＩ切点之间,所得重组体ｐＳＮ线性化后由Ｔ＿７ＲＮＡ多聚酶及ＳＰ６ＲＮＡ多聚酶引导体外转录反应,产物经凝胶电泳及特异引物ＲＴ－ＰＣＲ,证实ＳＰ６引导的是正义ＲＮＡ,Ｔ７合成的是反义ＲＮＡ,其大小分别力４２９ｂｐ和３６２ｂｐ。并证实所得ＲＮＡ力ＨＣＶ５＇ＮＣＲｃＤＮＡ转录而来。获得的ＨＣＶ５＇ＮＣＲｃＤＮＡ和ＲＮＡ在常规逆转录和ＰＣＲ步骤中用于设立有效的模板对照,对消除假用性及评估试剂有重要意义。同时,ＨＣＶ５＇ＮＣＲ体外转录载体的构建可用于制各ＲＮＡ探针和反义ＲＮＡ,改进后还可作为定量ＰＣＲ的竞争性模板。     

水稻牺叶枯病毒基因产物在水稻和昆虫体内的Western印迹分析

将ＲＳｔＶ基因组组分３编码的ＮＳ３和ＮＣ蛋白基因以及组分４编码的ＮＣＰ和ＮＳｖｃ４蛋白基因分别克隆于大肠杆菌表达载体ｐＧＥＸ３Ｘ,在ＩＰＴＧ诱导下,表达出４种融合蛋白。这些表达产物用于免疫动物产生多克隆抗血清,以制备的多克隆抗血清为探针,Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹分析了宿主植物和介体昆虫体内ＮＳ３,ＮＣ,ＮＣＰ和ＮＳｖｃ４种基因表达的产物。     

利用脊髓灰质炎病毒5‘NCR和RNA聚合酶基因可提高外源基因表达

将含脊髓灰质炎病毒（ＰＶ）ＲＮＡ聚合酶的不同长度基因片段克隆到载体ｐＳＧ５质粒上,分别构建了４个表达ＲＮＡ聚合酶的质粒。体外转录实验证明,ｐＳＧ５－ＰＯＬ１．９９和ｐＳＧ５－ＰＯＬ２．０３质粒转染细胞的提取物促进了特异的ＲＮＡ转录,表明两质闰可表达ＲＮＡ聚合酶。将ＰＶ的５’ＮＣＲ序列插在载体ｐＧＲＥＥＮ ＬＡＮＴＥＲＮ－１的ＣＭＶ启动子下游,构建了ｐＧＲＥＥＮ ＬＡＮＴＥＲＮ－１－５’ＮＣＲ质粒;     

甜菜坏死黄脉病毒内蒙分离物RNA3序列分析及编码25kD蛋白基因在大肠杆菌中的表达

以甜菜坏死黄脉病毒（ＢＮＹＶＶ）内蒙分离物的总ＲＮＡ为模板,通过反转录－ＰＣＲ扩增获得ＢＮＹＶＶＲＮＡ３全长ｃＤＮＡ。将其克隆到ｐＧＥＭ－７Ｚｆ（＋）上,得到重组质粒ｐＧＢＹ５６。序列分析结果表明,内蒙分离物ＲＮＡ３基因组全长为１７７５ｎｔ,其中包含３个开放阅读框架,分别编码２５ｋＤ蛋白、４．６ｋＤ蛋白和一种由５９个氨基酸组成的Ｎ蛋白。与法国Ｆ２分离物、德国Ｇ１分离物和日本Ｓ分离物相比,其核苷酸序列的同源性分别为９６．４％、９６．８％和９７．３％。将２５ｋＤ蛋白编码基因克隆到ｐＪＷ２上,构建了该基因的原核表达载体。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ分析结果表明,２５ｋＤ蛋白基因在Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）中经温度（４２℃）诱导后,可特异地表达２５ｋＤ蛋白     

猪繁殖和呼吸综合征病毒膜蛋白和核衣壳蛋白基因在大肠杆菌中的表达

以 Ｐ Ｒ Ｒ Ｓ Ｖ 弱毒株膜蛋白（ Ｍ） 和核衣壳（ Ｎ） 蛋白基因为模板,设计的一对含有 Ｅｃｏ Ｒ Ｉ 和 Ｂａｍ Ｈ Ｉ酶切位点的引物,通过 Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ 扩增出一约９００ ｂｐ 的 Ｍ Ｎ 基因片段,将此基因片段成功克隆于高效表达载体ｐ Ｂ Ｖ２２０ ,构建成重组质粒ｐ Ｂ Ｖ Ｍ Ｎ,导入大肠杆菌 Ｄ Ｈ５α,经温敏诱导,成功地表达了 Ｍ Ｎ 基因。表达产物经 Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ 电泳和 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 印迹分析,其分子量约３４ ｋ Ｄ,与兔抗 Ｐ Ｒ Ｒ Ｓ Ｖ 高免血清发生反应,经光密度扫描分析,表达产物量占菌体总蛋白的１２ ％ 。该研究为 Ｐ Ｒ Ｒ Ｓ 基因诊断抗原的研制奠定了基础     

水稻草矮病毒NS6基因在大肠杆菌中的表达及植物表达载体的构建

Large amount of disease-specific protein(SP) accumulated in the rice plant cells infected by rice grassy stunt virus(RGSV). It was deduced that the protein was encoded by NS6 gene on genomic vRNA6 and thus referred to as NS6 protein.But its function is unknown. In an effort to prove the above deduction and to elucidate the function of NS6 protein of RGSV, we constructed a bacterial expression plasmid pGTNS6 producing a fusion protein of glutathione S-transferase (GST) and NS6 protein, and a plant expression vector pCBTNSv6 containing NS6 gene. A recombinant plasmid pTNSv 6 containing the coding region of NS6 gene and the non-coding region at its 5' terminus, cloned by RT-PCR from purified RNAs of Shaxian isolate of RGSV, was used as the start point. Western blot analysis showed that the fusion protein reacted strongly with antisera raised against RGSV-SP, which served as evidence of the deduction.EHA105 of Agrobacterium tumefasciens containing pCBTNSv6 has been obtained and the transformation of rice is underway.     

组织因子膜外区融合蛋白基因的表达及产物的分离纯化与活性分析

 为构建表达组织因子 (TF)膜外区的融合载体 ,制备组织因子膜外区 ,抽提人胎盘组织的总RNA,通过 RT- PCR法扩增出 TF的 c DNA克隆至 p UC1 8并测定全序列 .然后以此为模板 ,再次PCR扩增出 TF膜外区 (soluble TF,s TF) c DNA,并将其插入到谷胱甘肽巯基转移酶融合表达载体 p GEX4T- 1 ,构建了 tac启动子控制下的 GST- s TF融合蛋白的表达载体 .表达的融合蛋白经亲和层析、凝血酶切得到纯化的 s TF.表达产物经 ELISA验证 ,能特异性地与 TF抗体结合 .重新脂化后 ,该产物具有较大凝血活性 .以上说明采用融合蛋白表达系统可以大量制备组织因子膜外区 ,为研制国产重组凝血活酶试剂和研究 s TF的结构和功能创造条件 .     

可溶性HLA-A*0203-BSP原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的高效表达

目的：构建HLA-A*0203重链胞外域羧基端融合生物素化酶BirA底物肽(BSP)的融合蛋白（HLA-A*0203-BSP）的原核表达载体并在大肠杆菌中进行表达。方法：以RT-PCR方法从HLA-A2+ 供者外周血单个核细胞(PBMC)中克隆HLA-A*0203重链基因的cDNA并测序鉴定,然后以PCR方法构建HLA-A*0203-BSP的原核表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中诱导表达并以免疫印迹鉴定。结果：DNA测序显示,从3名HLA-A2+ 供者PBMC中克隆的cDNA中,只有从供者2获得编码HLA-A*0203重链基因的cDNA。将编码重链胞外域1-276的序列和编码BSP的序列融合,构建HLA-A*0203-BSP融合蛋白的原核表达载体并经测序验证。该融合蛋白在BL21(ED3)中获得高效表达,约占菌体总蛋白的30％;产物相对分子质量约为34 kD,与理论大小一致。Western印迹分析显示融合蛋白完全存在于包涵体中。结论：成功克隆HLA-A*0203重链基因的cDNA,构建HLA-A*0203-BSP融合蛋白的原核表达载体,并在大肠杆菌中获得高效表达,为制备HLA-A*0203四聚体打下基础。     

水稻齿叶矮缩病毒Segment 9 dsRNA的序列分析及其在大肠杆菌DE3中的表达

通过有机试剂抽提,ＣＦ－１１纤维素柱层析,从感染水稻齿叶矮缩病毒菲律宾分离株（ＲｉｃｅＲａｇｇｅｄＳｔｕｎｔＶｉｒｕｓ,Ｐｈｉｌｉｐｐｉｎｅｉｓｏｌａｔｅ,简称ＲＲＳＶ－Ｐ）的水稻植株中获取该病毒的全基因组,即获得从Ｓｅｇｍｅｎｔ１到Ｓｅｇｍｅｎｔ１０（Ｓ１－Ｓ１０）的１０条双链ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）,然后设计合适的引物,用ＲＴ－ＰＣＲ方法得到Ｓ９的ｃＤＮＡ并将其克隆到ｐＵＣ１１９质粒上扩增,以双链测序法测定该ｃＤＮＡ的全序列。同时又将此ｃＤＮＡ克隆到大肠杆菌表达质粒ｐＧＥＸ－３Ｘ上,在大肠杆菌菌株ＤＥ３中用ＩＰＴＧ诱导表达,经超声波破菌、离心、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ－ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲和层析,得到纯化的分子量为６４ｋＤ的融合蛋白。     

人ob基因克隆及其亚细胞定位的研究

目的:旨在克隆人肥胖(obese,ob)基因的全长cDNA序列,与EGFP重组构建融合蛋白表达载体,并分析其亚细胞水平的定位.方法:提取人脂肪细胞总RNA,采用RT-PCR方法扩增出人ob基因cDNA,并克隆至真核表达载体pEGFP-CI,重组质粒转染NIH-3T3细胞,荧光显微镜分析EGFP-ob融合蛋白的亚细胞定位.结果:克隆的ob基因cDNA为501bp,共编码167个氨基酸,与GenBank公布的人ob基因序列一致,荧光显微镜分析表明,重组的EGFP-ob融合蛋白主要分布于NIT-3T3的细胞质中.结论:成功克隆了人OB基因的cDNA序列,构建人OB基因的真核表达载体pEGFP-CI-ob,融合蛋白EGFP-ob定位于NIH-3T3细胞质中.     

Cloning and Expression of a New Gene Encoding an Antifungal Protein in Phytolacca americana

protein (Pa-AFP) with molecular weight about 4 kD was purified from the seeds of Phytolacca americana L. , which obviously inhibits the growth of Rhizoctonia solani Kiihn in vitro. The authors isolated mRNA from the seeds of pokeberry and designed a degenerate PCR primer according to the N-terminal sequence of the purified protein. The full-length cDNA encoding Pa-AFP was cloned by RT-PCR and 5'-RACE and sequenced. The deduced amino acid sequence indicates that a preprotein with 65 amino acid residues is firstly translated and then processed to a mature protein with 38 amino acids. The DNA encoding the mature protein was subcloned into expression vector pGEX-4T1, and expressed efficiently in E. coli BL21 as a GST- Pa-AFP fusion protein. The fusion protein was purified by glutathione-Sepharose 4B affinity colmnn chromatography. The purified fusion protein was specifically digested by thrombin and the Pa-AFP was further purified by filtration column chromatography.     

G蛋白Rab3a cDNA的克隆与表达

利用PCR法 ,从人胎盘总cDNA中扩增得到Rab3acDNA的全编码区 .序列分析表明 ,扩增得到的Rab3acDNA有 5个核苷酸发生了变异 ,但翻译的氨基酸与发表的完全一致 .将扩增得到的Rab3acDNA克隆于原核融合表达载体pGEX 4T 1中 ,在E .coliBL2 1中经IPTG诱导表达 .为了进一步鉴定表达产物 ,对纯化后的Rab3a蛋白进行了SDS PAGE、N端氨基酸测序、质谱分子量测定及氨基酸组成分析鉴定 .结果显示 ,表达蛋白的分子量约 2 5kD ,N端氨基酸序列为MASATDSR ,氨基酸组成分析表明 ,Rab3a蛋白获得了正确表达     

水稻cDNA c73片段在大肠杆菌中的表达及其产物的纯化

曾以水稻蜡质基因５’调控区内一段３１ ｂｐ 片段为探针,用酵母单杂交法从水稻ｃＤＮＡ 文库中筛选出若干个其编码的蛋白可能与此３１ ｂｐ 片段结合的ｃＤＮＡ克隆,现将其中的ｐＣ７３ 克隆中的插入片段ｃ７３ 连接到含Ｈｉｓ６ 的表达载体ｐＥＴ２８ｃ（ ＋ ） 上,在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３） 中进行诱导表达,并用ＮｉＮＴＡ 树脂纯化得到预期的融合表达产物。在合适的诱导表达条件下,融合表达产物主要以可溶形式存在于大肠杆菌细胞内;表达量占到大肠杆菌总蛋白的１０ ％ 左右;经ＮｉＮＴＡ 树脂亲和层析纯化得到的产物纯度达９５ ％ ,可供进一步研究之用。     

地鳖虫纤溶活性蛋白cDNA序列克隆与毕赤酵母表达

依据已报道的地鳖虫成熟肽cDNA序列设计引物,通过RT-PCR法从地鳖虫(Eupolyphage sinensis Walker)中克隆得到675 bp地鳖虫纤溶活性蛋白 (fibrinolytic protein,EFP)成熟肽编码序列.将此片段克隆到表达载体pPICZα-A中,转化毕赤酵母GS115,甲醇诱导表达得到重组表达蛋白,经SDS-PAGE电泳和活性鉴定,表明重组EFP在毕赤酵母中均获得表达,重组表达蛋白相对分子质量为28.2 kD,表达产物分子质量与理论分子质量相符.重组蛋白在毕赤酵母中以分泌形式表达,具有纤溶活性.