一种改进的快煮制备质粒DNA和噬菌体DNA的方法

质粒DNA和噬菌体DNA的提取,是基因操作过程中最基本的、也是比较重要的一个步骤。而制备纯度高的制品,缩短操作时间,又是人们普遍感兴趣的。提取闭合环状共价DNA(cccDNA)(包括质粒DNA和噬菌体DNA)的基本原理是利用大分子染色体DNA片段与环状共价DNA的理化性质差别来进行的,方法多种:SDS法,酸酚法,PEG法,煮     

用硫酸铵沉淀法从液体培养物中纯化噬菌体λDNA

噬菌体是近年来DNA克隆最常用的载体之一。因此高质量的λDNA的制备是DNA重组的一项关键性技术。所谓高质量的λDNA制品应不被宿主菌的DNA所污染,DNA链必需完整而不被折断成碎片,并能被工具酶所加工。迄今制备λDNA的方法的主要差别在于对噬菌体颗粒的纯化步骤并存在一些缺点:PEG沉淀结合CsCI梯度离心法费用大。得率低,而且费时,不适合于多个样品DNA的快速提纯。纤维素酶DE-52层析法的缺点是大量的溶菌物过柱后,DE-52会结块,而且要有多套层析设备。直接从PEG沉淀的噬菌体颗粒提取的DNA往往纯度不高,需要有亚精胺存在时才能被限制性内切酶所切割。1989年,Ziai等首先用(NH_4)_2SO_4从平板培养法制备的噬菌体溶菌物中沉淀λgtll颗粒。用RNase处理去除污染的宿主菌RNA后,先用蛋白酶K,再用NaOH处理使λ噬菌体颗粒裂解,再用酚抽     

利用平板法获得高效价λ噬菌体悬液

我们研究了在平板上获得高效价λ噬菌体的方法,并将平板增殖的高效价λ噬菌体用于λDNA的简易制备。材料与方法1.菌株:λ噬菌体用E.Coli w1485(cI85757)经热诱导获得;指示菌为E.Coli 266 YMC Lac~-。由中国科学院微生物研究所提供。2.培养基:(1)BPY培养基:用于斜面     

大肠杆菌O157:H7中编码vt2基因的噬菌体的分离与鉴定

根据GenBank中VT1、VT2毒素的基因序列设计合成2对引物,以大肠杆菌O157H7菌株DNA为模板,扩增vt1、vt2.诱导只扩增出vt2的菌株释放噬菌体,利用多种指示菌经双层琼脂平板法来分离纯化VT2噬菌体,观察噬菌斑的特征,提纯病毒粒子进行电镜观察,并对噬菌体中vt2基因检测、克隆和序列分析.结果显示VT2噬菌体感染MC1061在双层琼脂平板上形成的噬菌斑小而混浊,多呈磨玻璃样;而首次感染大肠杆菌CC118(λpir),此后用MC1061分离的噬菌体,再以MC1061为指示菌,在双层琼脂平板上形成小而清晰透明的噬菌斑.电镜下噬菌体头部呈六边形外廓,尾部细长无尾鞘结构.以噬菌体DNA为模板进行PCR扩增,检测到vt2特异性DNA带,克隆的vt2基因序列与GenBank中编码VT2毒素的核苷酸序列(X07865,NC_002655,BA000007,AF291819)的同源性分别达到99%,确定编码VT2毒素的基因位于噬菌体上,并获得VT2噬菌体()HY.     

大肠杆菌O157：H7中编码vt2基因的噬菌体的分离与鉴定

根据GenBank中VT1、VT2毒素的基因序列设计合成2对引物,以大肠杆菌O157:H7菌株DNA为模板,扩 增vt1、vt2。诱导只扩增出vt2的菌株释放噬菌体,利用多种指示菌经双层琼脂平板法来分离纯化VT2噬菌体,观 察噬菌斑的特征,提纯病毒粒子进行电镜观察,并对噬菌体中vt2基因检测、克隆和序列分析。结果显示VT2噬菌 体感染MC1061在双层琼脂平板上形成的噬菌斑小而混浊,多呈磨玻璃样;而首次感染大肠杆菌CC118(λpir),此 后用MC1061分离的噬菌体,再以MC1061为指示菌,在双层琼脂平板上形成小而清晰透明的噬菌斑。电镜下噬 菌体头部呈六边形外廓,尾部细长无尾鞘结构。以噬菌体DNA为模板进行PCR扩增,检测到vt2特异性DNA 带,克隆的vt2基因序列与GenBank中编码VT2毒素的核苷酸序列(X07865,NC_002655,BA000007,AF291819) 的同源性分别达到99％,确定编码VT2毒素的基因位于噬菌体上,并获得VT2噬菌体(?)HY。     

利用噬菌体快速鉴定沙门氏菌的研究

用肠杆菌科7个组合噬菌体对培养不同时间的60株肠杆菌科细菌进行平板法和液体法裂解,观察其裂解效果,并与生化鉴定进行比较。结果表明:平板法裂解培养2h、6h、10h和≥18h的沙门氏菌(生化鉴定为45株)裂解率分别为91.1%、93.3%、97.8%和88.9%,其余菌株几乎不被沙门氏菌特异噬菌体裂解;液体法裂解培养10h的菌液效果较佳。对150份食品样品检测也获得相似结果。说明肠杆菌科7个组合噬菌体对培养10h的沙门氏菌有较高的敏感性和特异性,这对实现沙门氏菌实时、快速而准确的检测有重要意义。     

一株副溶血弧菌噬菌体的分离鉴定及生理特性

为了探寻有效的控制副溶血弧菌的方法, 从水产品市场的污水中分离出来一株烈性噬菌体qdvp001。采用双层平板法分离纯化噬菌体qdvp001, 电镜观察其形态特征, 并利用双层平板法测定其生理特性, 包括热稳定性试验、最适pH、最佳感染复数及一步生长曲线, 然后提取基因组进行酶切和序列分析。结果显示该烈性噬菌体qdvp001头部直径大约为79 nm, 尾长大约118 nm, 属于肌尾噬菌体科。它对60 °C以下的温度耐受力较强, 最适pH为7.0?8.0左右, 最佳感染复数是0.000 1, 感染宿主菌的潜伏期约20 min, 裂解期约70 min, 并获得部分DNA片段的序列。将获得的DNA序列在NCBI上进行比对, 结果显示, qdvp001与其他噬菌体的同源性较低。该噬菌体很可能是一种新发现的噬菌体。     

DNA重组技术(Ⅱ) 小量制备噬菌体DNA的方法

从噬菌体包装的全基因文库中克隆目的基因,是重组DNA基本技术之一。对筛选到的噬菌体进行DNA扩增和酶切分析,以确定克隆的正确性是必要的步骤。 下面介绍两种常用的小批量制备噬菌体DNA的方法。     

从小鼠胎儿基因文库中筛选分离免疫球蛋白重链C_ε基因

本文阐述了以缺口翻译制备的pIge DNA为探针(4.4×10~6cpm/μg DNA),用吸印法从小鼠胎儿基因文库中筛选分离出免疫球蛋白重链C_ε基因克隆。同时,从扩大培养的噬菌体中提取出DNA,并用EcoRI酶消化,0.7％琼脂糖凝胶平板电泳分离,分离的DNA片段转移至硝酸纤维素滤膜上,以pIgs DNA探针杂交,进而确证有两条阳性带,为免疫球蛋白重链C_s基因。电泳法测定其大小分别约为3.5 kb和3.0 kb。也显示出在小鼠胎儿中的未分化型免疫球蛋白重链C_g基因内有一个限制性内切酶Eco RI位点。     

一株弗氏链霉菌噬菌体的分离及其分子特性研究

鉴定一株从泰乐菌素异常发酵液中分离出的烈性噬菌体SF1并研究其分子特性。采用双层平板法分离纯化弗氏链霉菌的噬菌体SF1,通过负染法电镜观察噬菌体SF1的大小和形态;测定噬菌体SF1对氯仿和异丙醇的敏感性分析其包膜结构;通过SDS-PAGE分析噬菌体的结构蛋白;提取噬菌体基因组DNA进行限制性片段长度多样性分析。噬菌体SF1的噬菌斑直径约11-15 mm,边缘整齐透明,为烈性噬菌体;SF1为长尾型,头部为多面体,直径约24-30 nm,尾长约52-64 nm,尾宽约为3-5 nm;对氯仿和异丙醇不敏感,无包膜;基因组为双链DNA,大小约为35 kb;至少含有14种相对分子量为14.8-59.5 k D的结构蛋白。     

用粘粒载体克隆霍乱弧菌染色体基因方法的建立

本文采用我国 El Tor 型霍乱弧菌805菌株(稻叶血清型,噬菌体-生物型 ld)为实验菌株,对粘粒载体(Cosmid)基因克隆的方法,进行了探索.首先从感染噬菌体λ突变体的溶原菌(HB 2688,HB2690)制备包装抽提物。制备方案有二:一是直接制备 HB2688,HB2690混合包装抽提物;另一是用超声波处理制备 HB2690抽提物;用冻融法制备 HB2688抽提物.包装时再将两者混合.本文认为以 pHC79为载体进行包装时,两方案效果一样,第一方案操作较简便些.在核酸操作中,从805菌株提取染色体 DNA,要求 DNA 的长度约为100kb;进行染色体 DNA部分消解时,应使大部分 DNA 片段在30～40kb 之间;连接时,碱性磷酸酶处理过的载体量应为30～40kb DNA 的10倍.本文以 pHC79为载体,建立805菌株染色体 DNA 无性繁殖系,得到500多个克隆子。     

λ噬菌体及其在遗传工程中的应用(三)

五、DNA繁殖载体的设计由于对λ噬菌体的遗传学和生物化学进行了较为广泛、深入的研究,人们目前已能比较得心应手地将λ噬菌体作为基因移植的运载体。这是因为,在λDNA分子中,大约有1/3的片     

诺卡氏菌烈性噬菌体vB_Ncarnea_KYD1的分离纯化与基因组分析

【背景】诺卡氏菌是一种广泛分布的好氧放线菌,可在人体内引起局部或播散性感染,尤其是在免疫功能低下的个体中。诺卡氏菌感染在临床上较难鉴定,而且不断有新型诺卡氏菌种被发现。不同类型、不同地域的诺卡氏菌具有流行差异和抗生素敏感性差异,阻碍了适当治疗方式的选择。利用病灶处的宿主菌分离得到噬菌体来控制诺卡氏菌感染的这种方法在近年来受到了各界的关注。【目的】尝试从环境中分离出能够用于临床治疗的针对诺卡氏菌的烈性噬菌体,并研究其基因组学特征。【方法】利用双层平板法分离得到目标噬菌体,观察其噬菌斑形态,并对噬菌体进行分离纯化,在透射电镜下鉴定其特征。提取噬菌体DNA进行全基因组测序与注释,并与数据库内已知噬菌体基因组进行比较,同时构建系统进化树以进行遗传进化分析。【结果】本文以肉色诺卡氏菌为宿主,从环境样本中分离出一株烈性噬菌体vB_Ncarnea_KYD1,在双层平板上可形成直径<2 mm的透亮均匀的噬菌斑。基因组分析表明,vB_Ncarnea_KYD1DNA为环状,大小为66 621 bp,共发现102个蛋白质编码区(coding sequence,CDS)及一个tRNA-Ser编码序列。透射电镜观察与系统进化树综合分析可以确定,vB_Ncarnea_KYD1为长尾噬菌体科的一个新属。其在进化过程中经历了复杂的基因重组过程。暂未发现毒力因子相关基因与抗性基因,具备实用价值。【结论】从环境水体中分离出一株烈性肉色诺卡氏菌噬菌体vB_Ncarnea_KYD1,通过电镜观察与基因组分析可知,此株噬菌体为长尾噬菌体,基因组中暂未发现不利于临床应用的相关基因,是一株相对安全的烈性诺卡氏菌噬菌体。研究结果丰富了国内噬菌体资源库,并为后续诺卡氏菌感染疾病的治疗提供支持。     

测定λ原噬菌体诱导频率的新方法

本文报道两种测定λ原噬菌体紫外诱导频率的新方法—菌落计数法和平板诱导法。将溶源菌液经紫外诱导暗培养稀释后直接涂布在平板上培养 ,根据平板上菌落形成单位数计算λ噬菌体紫外诱导频率。另一种是将溶源菌与指示菌混合制备的平板用紫外线诱导 ,根据平板上噬菌体形成单位确定λ噬菌体紫外诱导频率。这两种方法不仅能准确测定噬菌体紫外诱导频率 ,而且操作简便 ,节省时间和用具 ,重复性好。本研究还将冬虫夏草浸出汁与溶源菌混合后进行紫外辐射 ,通过几种方法进行比较 ,结果证明建立的新方法确实可行 ,易操作 ;同时也表明冬虫夏草具有较强的抗紫外辐射作用     

碘化钾梯度离心在制备噬菌体DNA中的应用

通过氯化艳梯度离心除去细菌DNA及细 菌残渣来分离纯化噬菌体颗粒是一种方便而有 效的方法〔ZJ。其唯一缺点是氯化艳价格昂贵。 Blin等人〔13报道说,可用碘化钾梯度离心法从 琼脂糖电泳凝胶中回收DNA, Smith 13,发展了 Blin法,在碘化钾溶液中加人I MM Na2S20,以 防止碘离子的氧化,使DNA稳定不受干扰。 最近,我们把该法应用于分离纯化兄噬菌体的 重组体DNA,结果表明在噬菌体颗粒的梯度 离心纯化过程中,完全可以用碘化钾替代氯化 艳。     

一株奥奈达希瓦氏菌烈性噬菌体的分离、纯化及鉴定

【目的】从环境中分离获得希瓦氏菌烈性噬菌体,并对其性质进行研究。【方法】以4株希瓦氏菌为宿主菌,采用双层平板法从污水样品中分离得到奥奈达希瓦氏菌MR-1烈性噬菌体M1;观察噬菌斑特征;利用超速离心法浓缩M1颗粒,进一步用氯化铯密度梯度离心纯化;采用透射电子显微镜观察纯化的M1颗粒;提取M1核酸,通过核酸酶处理分析其核酸类型及结构;绘制一步生长曲线。【结果】噬菌体M1在双层平板上形成圆形的噬菌斑,清晰透明,边缘光滑,直径为2.3 mm-2.5 mm;经电镜观察,噬菌体M1头部呈二十面体,直径约为55 nm,尾长约为170 nm,尾部可收缩,属于肌尾噬菌体科(Myoviridae);通过酶切分析表明噬菌体M1核酸为线形双链DNA;一步生长曲线显示该噬菌体感染后完成一个复制循环所需要的时间约为15-20 min。【结论】噬菌体M1属肌尾噬菌体科,研究结果为后续研究病毒在地球微生物成岩过程中所起的作用提供了实验材料。     

阪崎肠杆菌噬菌体的分离及其生物学特性

[目的]以阪崎肠杆菌模式菌株及分离菌株为指示菌,从污水中分离出该菌噬菌体,并对其基本生物学特性进行研究.[方法]以双层琼脂法从污水中分离噬菌体,通过同属和同科参考菌株测定噬菌体的特异性和宿主谱;电镜观察噬菌体颗粒形态;随机扩增多态性DNA(RAPD)实验分析噬菌体的分子生物学特性.[结果]从污水中分离得到5株噬菌体,表现出较窄的宿主范围,仅裂解阪崎肠杆菌,以ATCC 51329分离的噬菌体SK2可裂解27株阪崎肠杆菌中的24株(89%),负染经电镜观察,5株噬菌体都是由多面体头部和尾部组成;随机引物(5′-GAAACGGGTG-3′)扩增DNA分析,5株噬菌体DNA明显不同.[结论]分离出的5株噬菌体仅对阪崎肠杆菌敏感,在阪崎肠杆菌的分型、预防、治疗、以及生态环境的净化等方面具有潜在用途.     

测定λ原噬菌体诱导频率的新方法

本文报道两种测定λ原噬菌体紫外诱导频率的新方法 - 菌落计数法和平板诱导法.将溶源菌液经紫外诱导暗培养稀释后直接涂布在平板上培养,根据平板上菌落形成单位数计算λ噬菌体紫外诱导频率.另一种是将溶源菌与指示菌混合制备的平板用紫外线诱导,根据平板上噬菌体形成单位确定λ噬菌体紫外诱导频率.这两种方法不仅能准确测定噬菌体紫外诱导频率,而且操作简便,节省时间和用具,重复性好.本研究还将冬虫夏草浸出汁与溶源菌混合后进行紫外辐射,通过几种方法进行比较,结果证明建立的新方法确实可行,易操作;同时也表明冬虫夏草具有较强的抗紫外辐射作用.     

一株产L-天冬氨酸酶大肠埃希氏菌的噬菌体分离和生物学特性

【目的】从大肠埃希氏菌CICC 11021S发酵液中分离一株噬菌体,对其生物学特性进行研究。【方法】采用双层平板法分离噬菌体CICC 80003;利用透射电镜观察噬菌体形态;提取噬菌体基因组,核酸内切酶处理并进行凝胶电泳;分析噬菌体最佳感染复数、一步生长曲线、p H和温度稳定性、宿主谱。考察CICC 80003对CICC 11021S生长和L-天冬氨酸酶活力的影响。【结果】CICC 80003噬菌斑圆形透明,有明显晕环;头部规则,直径约50-60 nm,尾部长约120-130 nm;基因组能被核酸内切酶Bam H I和Mlu I切开;最佳感染复数0.1,潜伏期5 min,裂解期25 min,平均裂解量约86个;最适p H值8.0;90°C温育15 min,噬菌体全部失活;能裂解大肠埃希氏菌和沙门氏菌的部分菌株。发生噬菌体污染时,CICC 11021S无法正常生长,基本检测不到L-天冬氨酸酶活力。【结论】CICC 80003属于长尾噬菌体科ds DNA噬菌体,液体环境中能够彻底裂解大肠埃希氏菌CICC 11021S。     

以温和噬菌体pll为载体克隆α-淀粉酶基因

温和噬菌体p11 DNA和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168染色体DNA用BamHl酶消化和T4 DNA连接酶连接,转化到被噬菌体p11溶源化了的501菌株中,经过体内交换整人到染色体上,培养48小时后,从1020个菌落中挑出含Arol+一Amy+基因的3个转化子,分别命名为p11Amy1、p11Amy2和p11Amy3。取p11Amy1进行繁殖和丝裂霉素c诱导,诱导后的重组噬菌体用于测定噬斑形成能力和转导活性,提取其DNA再用于转化,均证明构建成了含淀粉酶基因的重组特异性转导噬菌体。