ACC合成酶基因及其反义基因对西瓜的遗传转化

以2日龄西瓜(Citrullus lanatus(Thunb.)Mansfeld)无菌苗子叶为外植体,通过与根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)进行叶盘共培养建立了西瓜的遗传转化系统。所用根癌农杆菌中含有改建后分别携带嵌合NPTⅡ基因和番茄的ACC合成酶基因及其反义基因的质粒。外植体在MSA培养基(MS盐类、B_5维生素、1.0mg/L BA、0.2mg/L IAA)上预培养3～4d后,与根癌农杆菌共培养4d,随后转移外植体至附加100mg/L卡那霉素、300mg/L头孢菌素的MSA培养基上筛选转化芽。将带芽外植体移入含有100mg/L卡那霉素、300mg/L头孢菌素的伸长培养基(MS 0.2mg/L KT)上进行芽伸长,切取2～3cm高的伸长芽移入生根培养基(1/2MS 0.1mg/L NAA)生根。Southern blot结果证明获得转基因植株,乙烯释放指标表明转入的正义和反义ACC合成酶基因得到不同程度的表达。     

香石竹毛状根诱导、离体培养及其植株再生

为了探讨利用发根农杆菌遗传转化所产生的毛状根来创新香石竹种质的可能性,本文采用叶盘法,建立了发根农杆菌Agrobacterium rhizogenes对香石竹Dianthus caryophyllus L.叶片外植体的遗传转化及其植株再生体系。结果表明,发根农杆菌ATCC15834感染香石竹幼嫩叶片外植体12 d后,从叶片外植体切口中脉处产生白色毛状根,21 d后约90%的叶片外植体产生毛状根。所获得的无菌毛状根能在无外源激素的MS固体和液体培养基中快速自主生长。PCR扩增和硅胶薄层层析结果显示发根农杆菌Ri质粒的rol B和rol C基因以及冠瘿碱合成酶基因已在香石竹毛状根基因组中整合并得到表达。将毛状根置于MS+6-BA 1.0-3.0 mg/L+NAA 0.1-0.2 mg/L中培养15 d后产生淡黄绿色的疏松愈伤组织。愈伤组织不定芽分化的最适培养基为MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.02 mg/L,培养6周后不定芽分化率为100%;平均每个愈伤组织产生30-40个不定芽;将不定芽转至1/2 MS或1/2 MS+0.5 mg/L NAA的培养基中10 d后产生不定根,发育成再生植株。再生植株移植于栽培基质中20 d后,成活率达95%以上。     

PSAG12-ipt嵌合基因转化马铃薯体系的研究

以根癌农杆菌介导法将PSAG12-ipt嵌合基因导入马铃薯栽培品种,对影响马铃薯遗传转化的多种因素进行系统研究.结果表明:马铃薯茎段分化效率高于叶片,马铃薯愈伤诱导和芽分化最适培养基为MS+6-BA 0.25mg/L+NAA 0.25mg/L+2,4-D 0.25mg/L,添加1%Na2SO3能有效防止褐化;茎段愈伤诱导和分化苗生根最适的Kan浓度分别为50mg/L和75mg/L;外植体预培养2d,OD600为0.2～0.5的农杆菌浓度侵染8min、共培养3d后进行选择培养能有效地提高植株再生能力.用PSAG12和ipt双重PCR检测再生植株,阳性转化率为65.8%.Southern blotting结果表明,转基因植株多以单拷贝形式整合进马铃薯基因组中.     

‘红阳’猕猴桃叶盘高频直接再生体系的建立

以‘红阳’猕猴桃雌株幼叶为外植体,直接诱导产生不定芽,并对不定芽增殖以及生根体系进行优化,建立了高频再生体系。结果表明,在MS+3.0 mg/L BA+1.0 mg/L NAA培养基中,不定芽诱导率达100％,平均出芽数达18.67个/叶盘;在MS+2.0 mg/L BA+1.0 mg/L NAA+0.1 mg/L GA3培养基中,增殖率达100％,1~6代不定芽平均繁殖系数达8.63;不定芽在1/2 MS+0.8 mg/L IBA培养基中培养15 d,然后继代至含1/2 MS液体培养基的珍珠岩中培养15 d,生根率达100％,且其根系发育良好;98株试管苗移栽到土壤盆钵中,成活95株,成活率达96.94％。本试验成功建立了红阳猕猴桃叶片高频直接再生体系,该体系诱导产生不定芽周期短,出芽率高,不定芽增殖系数大,生根率高且根系发达,为红阳猕猴桃试管苗的工厂化生产和遗传转化奠定了基础。     

根癌农杆菌介导蓝猪耳转化的影响因素研究

研究了根癌农杆菌介导蓝猪耳转化的影响因子。结果表明,以蓝色花类型蓝猪耳5~6周的叶片为外植体,在OD₆₀₀为0.5~0.6的活化菌液中浸染5~10min,暗培养4d后,在愈伤组织诱导培养基(MS+BA 1.0mg/L+2,4-D 0.1mg/L)上生长14d,获得抗性愈伤组织;经芽诱导培养基(1/2MS+BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L)培养28d得到抗性芽;生根培养基(1/2MS)上培养14d得到抗性植株。经PCR检测证实外源基因已整合到蓝猪耳基因组中,转化率达13%~14%。Cef和Hyg浓度对转化影响较大,转化的不同阶段其适宜浓度不同。     

胡杨转基因体系的建立

胡杨(Populus euphratica)是唯一能在沙漠里生长的高大乔木树种, 建立其转基因体系可为胡杨抗逆分子机制与应用技术研究提供基本方法。通过研究农杆菌介导的胡杨转GUS基因的技术体系得出以下结论: (1) 胡杨再生植株体系, 叶片在附加1.0 mmol.L^-1 6-BA和5.0 mmol.L^-1 NAA的1/2MS培养基上不定芽诱导率较高; (2) 转基因体系, 胡杨叶片在含100 mmol.L^-1 乙酰丁香酮的OD600值为0.4-0.6的根癌农杆菌菌液中浸染15分钟, 共培养2天, GUS基因转化效率较高; (3) 转基因植株抗生素筛选, 转GUS基因胡杨叶片用300 mg.L^-1头孢霉素抑制农杆菌生长, 在含9 mg.L^-1 G418的培养基上诱导不定芽以获得转基因的抗性植株。     

根癌农杆菌介导B.t.基因和CpTI基因对花椰菜的转化

用根癌农杆菌介导的方法 ,将B .t.基因和Cp TI基因分别导入花椰菜“杂交 75天”的父本和母本的无菌苗下胚轴切段细胞 ,都获得了转基因植株。经过预培养的下胚轴切段用根癌农杆菌 (LBA44 0 4/ pG BI4A2B ,含B .t .基因 ;LBA44 0 4/pBRLC ,含CpTI基因 )进行感染后 ,共培养 48h ,继续培养 30d后 ,将分化芽转移至筛选培养基上。 10d后 ,大多数分化芽的顶端变成紫色 ,2 0d后紫色芽逐渐变白死亡 ,而转化芽在选择培养基上长成小植株。小植株移至大田能正常生长、开花、结籽。PCR和Southernblot分析表明B .t和CpTI基因已整合在植物基因组中     

中国传统菊花品种‘小林静’再生及转化体系的建立

以中国传统菊花品种‘小林静’叶片为外植体,建立了‘小林静’较好的再生体系及遗传转化体系.结果表明,‘小林静’叶盘最适不定芽分化培养基为MS+2.0 mg/L 6-BA+1.5 mg/L NAA,不定芽分化率为92.76％,平均再生不定芽数为2.3767个;试管苗最佳生根培养基为1/2MS,生根率达100％.移栽采用灭菌的蛭石,再生苗移栽成活率达90％以上.采用根癌农杆菌C58C1介导的叶盘转化法进行‘小林静’的遗传转化试验,农杆菌OD600=0.5-0.6,侵染10 min后,将叶片外植体接种到MS+2.0 mg/L 6-BA+1.5mg/L NAA的培养基中黑暗共培养2d,之后转接到附加10 mg/L硫酸卡那霉素和400 mg/L羧苄青霉素的分化筛选培养基中进行转化细胞的筛选,待长出抗性芽后转接至生根培养基中进行培养,最终建立了菊花品种‘小林静’的遗传转化体系.     

红阳猕猴桃遗传转化体系的建立

以红阳猕猴桃叶片和茎段为实验材料,通过优化培养基,建立了一个高效的红阳猕猴桃遗传转化体系,利用农杆菌介导转化法把猕猴桃ACO基因(ACC oxidase gene)的反义链导入红阳猕猴桃,共获得47株潮霉素抗性植株.随机挑选其中14株进行PCR鉴定,其中9株成功扩增到了目的条带,初步统计阳性植株为64.3%左右.此研究为利用分子遗传基因工程手段培育优质延熟保鲜的转基因猕猴桃新品种打下了基础.     

根癌农杆菌介导大花蕙兰遗传转化的研究

以大花蕙兰原球茎(PLBs)为外植体,采用EHA105和LBA4404 2种根癌农杆菌菌株与pCAMBIA1301质粒构建工程菌介导,以建立大花蕙兰遗传转化体系,并比较不同受体处理方式、菌液浓度和侵染方式等对大花蕙兰转化的影响.结果表明:(1)以切成3 mm左右的PLBs小块作为受体材料,用OD600值为0.6的LBA4404根癌农杆菌菌株,并用MS+1.0 mg/L BA+200μmol/L AS(乙酰丁香酮)的液体培养基将菌液等体积稀释侵染,转化率可达62.5%.(2)大花蕙兰对潮霉素(Hyg)十分敏感,5 mg/L Hyg对转化后的PLBs有较好的筛选效果,筛选后最高成活率为13.0%.(3)PCR检测初步证明,通过根癌农杆菌介导的方法获得了2株转基因大花蕙兰植株.     

2种菊苣再生体系及遗传转化效率的比较

以普那菊苣和将军菊苣子叶为材料,通过植物组织培养的方法,探讨了不同激素浓度配比对二者愈伤组织诱导、芽分化以及根再生的影响,并通过农杆菌介导法将编码獐茅液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因(AlNHX)导入菊苣中,比较普那菊苣和将军菊苣的遗传转化效率。结果表明:不同基因型的菊苣愈伤组织诱导和芽分化条件不同,普那菊苣最佳培养基为MS+1.5mg/L 6-BA+0.2mg/L IBA;将军菊苣最佳培养基为MS+1.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA;二者最佳生根培养基均为1/2MS+0.1mg/L NAA。获得的抗性芽经PCR检测,初步证实AlNHX已插入到菊苣基因组中,且普那菊苣转化效率为10.0%,将军菊苣转化效率为13.3%。     

串叶松香草高效再生体系的建立与兔出血症病毒YL株外壳蛋白基因VP60对其遗传转化

通过对串叶松香草(Silphium perfoliatumL.)不同激素浓度配比的诱导分化实验,建立了串叶松香草离体培养高效再生体系,结果表明MS 6-BA(2.0mg/L) NAA0.1(mg/L)培养基可高效诱导愈伤组织和芽的分化,1/2MS IBA(0.1mg/L)培养基可快速诱导根的生成,形成再生植株。构建了植物表达载体pBI121-VP60,利用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导叶盘法转化串叶松香草以研究高效的串叶松香草转化体系,结果显示以农杆菌LBA4404为介导菌株、以叶片为转化外植体、3d预培养时间和3～4d共培养时间、400mg/L羧苄青霉素和40mg/L卡那霉素筛选浓度转化效果较好,并已筛选到两株拟转基因植株,为利用串叶松香草生产兔出血症病毒动物可食用疫苗建立了初步的技术基础。     

根癌农杆菌介导转化水稻成熟胚及转Metr基因植株的获得

以粳稻品种广陵香糯为材料,用携带有双元载体pBB的根癌农杆菌EHA105为载体,研究了根癌农杆菌介导转化粳稻成熟胚愈伤组织的几个影响因素,建立了合适的粳稻成熟胚愈伤组织转化系统。一种基于MS为基本培养基的商品培养基(HRM)较适合于作为粳稻成熟胚愈伤组织诱导培养基,合适的愈伤组织诱导培养天数为7~8 d,合适的筛选培养基为CC培养基。在此基础上,将Metr基因导入粳稻品种广陵香糯中,获得了一批转基因水稻植株,PCR分析表明外源基因已经整合进了水稻的基因组中。部分转基因植株后代遗传分析表明外源基因的分离符合3∶1的理论比例。     

抗菌肽基因转化厚皮甜瓜的研究

以厚皮甜瓜FY1的子叶为试材,研究不同激素组合和配比对甜瓜植株再生的影响,并用农杆菌介导法将银杏抗菌肽基因Gnk2-1转化甜瓜。结果表明:(1)甜瓜子叶的最佳愈伤组织及不定芽诱导培养基为MS+2.0mg.L-1 6-BA+0.1mg.L-1 IAA,出愈率和出芽率均达95%以上;最佳芽伸长培养基为MS+0.2mg.L-1 KT;最佳生根培养基为1/2MS+0.1mg.L-1 IAA。(2)卡那霉素对甜瓜外植体的生长和分化有明显的抑制作用,适宜的筛选压力为100mg.L-1。(3)将子叶预培养2d,在农杆菌菌液浓度OD600值为0.5左右时,侵染外植体10min左右,共培养3d,转化效率最高。(4)经PCR鉴定获得了抗性植株,抗病性鉴定显示,转基因植株对枯萎病的抗性有所增强,发病迟缓。     

胡杨转基因体系的建立

胡杨（Populus euphratica）是唯一能在沙漠里生长的高大乔木树种,建立其转基因体系可为胡杨抗逆分子机制与应用技术研究提供基本方法。通过研究农杆菌介导的胡杨转GUS基因的技术体系得出以下结论：（1）胡杨再生植株体系,叶片在附加1.0μmol·L^-1 6-BA和5.0μmol·L^-1NAA的1/2MS培养基上不定芽诱导率较高;（2）转基因体系,胡杨叶片在含100μmol·L^-1乙酰丁香酮的OD600值为0.4-0.6的根癌农杆菌菌液中浸染15分钟,共培养2天,GUS基因转化效率较高;（3）转基因植株抗生素筛选,转GUS基因胡杨叶片用300mg·L^-1头孢霉素抑制农杆菌生长,在含9mg·L^-1G418的培养基上诱导不定芽以获得转基因的抗性植株。     

根癌土壤杆菌介导转化诸葛菜子叶获得转基因植株

采用诸葛菜子叶为材料。在MS+BA 3mg／l,+NAA O．2mg／L培养基上诱导芽的再生,1／2 MS+IBA 0．03mg／L．上诱导生根,获得完整再生植株,建立了诸葛莱组织培养高频再生系统,其再生率可达100％。采用土壤杆菌介导转化诸葛菜子叶．在附加一定量的氨苄青霉索、头孢霉素和卡那霉素的相应培养基上进行筛选,进而培养出再生成苗。获得完整植株,经GUS和NPTI酶活测定,以及Southern blot分析．证实为转基因植株。转化子叶的芽再生率为51％．获得完整转基因植株的转化率为5．53％。在国内外首次建立了以根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)为载体,诸葛菜子叶为受体的遗传操作系统。     

影响根癌农杆菌介导水稻转化的因素分析

根癌农杆菌与来自水稻成熟种子盾片的愈伤组织共培养,将GUS基因导入水稻愈伤组织,并获得了转基因植株。通过比较影响根癌农杆菌转化频率的各种因素,表明激素配比为2,4-D1mg/L、TDZ0.5mg/L、NAA1mg/L时,可以大大促进籼稻愈伤组织的分化能力;酚类化合物的加入使农杆菌的转化频率提高8.9%-23.5%;共培养时农杆菌的稀释方式及适当调整潮霉素（hygB）的使用浓度影响到农杆菌的转化频率。     

‘贵长’猕猴桃叶片高效直接再生体系的建立

以‘贵长’猕猴桃叶片为外植体,直接脱分化产生不定芽,并对不定芽增殖以及生根体系进行优化,建立了其高效直接再生体系。结果表明,叶片在MS+4. 0mg/L 6-BA+0. 4mg/L NAA培养基中,不定芽诱导率达95. 8%,平均出芽数达15. 7个/叶片;不定芽在MS+3. 0mg/L 6-BA+0. 3mg/L NAA+0. 2mg/L GA3培养基中,增殖率达100%,且1～6代平均繁殖系数达8. 15;不定芽先在添加1. 0mg/L IBA的1/2 MS固体培养基中诱导7d,然后再先后在1/2 MS固体培养基和充分吸附1/2 MS培养液的珍珠岩中各培养14d,生根率达98. 61%,且根系发育良好; 50株试管苗移栽到以珍珠岩和田间土壤(其体积比为1∶4)为基质的营养钵中,2周后成活49株,成活率达98%。该研究成功建立了‘贵长’猕猴桃叶片高效再生体系,该方法不定芽诱导周期短,出芽率高且数目多,不定芽增殖系数大,生根率高且试管苗根系发达,为‘贵长’猕猴桃离体快速繁殖和遗传转化奠定了基础。     

番茄ACC合酶反义基因对河套蜜瓜的转化

河套蜜瓜（CucumismeloLcvHetau）的子叶经预培养。芽诱导和生根培养,获得再生小植株,诱导率达58％。取带有番茄ACC合酶反义基因的双元载体pMQ6／JM109与农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens）LBA4404经三亲融合后,与在MS0上萌发5d、并在MS＋1mg／LNAA培养基上预培养3d的子叶共培养48h,然后转入含50mg／L卡那霉素的MS＋6mg／LZT的芽诱导培养基中,1l个月后诱导生芽,待芽长1．5－2cm时转入生根培养基中,1－2周后可诱导产生大量的根,形成完整的转基因小植株。经PCR和分子杂交检测证明,目的基因已整合入河套蜜瓜的基因组中。     

根癌农杆菌介导法获得烟草转人骨形成蛋白—3成熟肽基因植株

利用冻融法将质粒pCAMBIA-hBMP-3m直接转入根癌农杆菌LBA4404,以烟草无菌苗叶盘为外植体,通过农杆菌介导法进行遗传转化,获得了在含25mg/L潮霉素（Hy-gromycin,Hyg）的筛选培养基上再生的抗性植株,经PCR检测呈阳性,初步鉴定并筛选整合了人骨形成蛋白－3成熟肽基因的转基因植株。