基于烟草脆裂病毒构建同时表达2种外源蛋白的载体及其应用

目的 构建在整个寄主植物中能同时表达两个非融合蛋白的病毒载体。方法 以烟草脆裂病毒（tobacco rattle virus，TRV）基因组RNA2的农杆菌侵染性克隆pYL156为材料，缺失TRV RNA2的2b基因5"端279 bp并将其起始密码子ATG改变为AGG、同时引入豌豆早枯病毒（pea early-browning virus，PEBV）外壳蛋白（coat protein，cp）基因启动子，获得pTRV2e²载体；在pTRV2e²载体的2b和PEBV的cp启动子下游插入不同的外源基因，测定病毒TRVe²表达外源蛋白的能力、携带外源基因后重组病毒的稳定性以及分析蛋白质的生物学功能。结果 病毒TRVe²能快速同时表达2个非融合的外源蛋白，且至少能表达70 ku外源蛋白，且该病毒携带~2.0 kb外源基因能稳定存活于寄主植物中；病毒TRVe²可用于分析蛋白质的生物学功能以及2个蛋白质间的相互作用。结论 本文构建的重组病毒TRVe²为快速有效地表达2个外源蛋白以及分析2个蛋白质间的相互作用提供技术工具。     

两种制备感染细胞DNA的内切酶图谱法用于单纯疱疹病毒分型的研究

用³²P标记单纯疱疹病毒Ⅰ型和Ⅱ型感染Vero细胞,抽提病毒DNA,然后以核酸内切酶BamHI酶切,电泳结果2个型别的病毒DNA的电泳图谱均不相同。用非同位素标记的疱疹病毒感染细胞DNA酶切,电泳与³²P-标记的病毒DNA图谱相比较,显示相同的结果。实验表明简单受染细胞DNA进行核酸酶切及电泳可用来进行疱疹病毒的分型。实验说明选择核酸内切酶进行酶切有重要的影响。     

大肠埃希菌不耐热肠毒素双突变体的表达及活性研究

为了使大肠埃希菌不耐热肠毒素(LT)的毒性丧失或减弱的同时仍保留其较强的免疫原性,通过PCR和重叠—延伸PCR扩增突变体LTK⁶³/G¹⁹²基因片段, IPTG诱导表达目的蛋白,经Western免疫印迹检测目的蛋白,在HPLC系统上纯化目的蛋白,经ADP-核酸转移酶试验及Patent-mouse毒性试验检测其酶活性与毒性,纯化的目的蛋白与鸡新城疫病毒弱毒疫苗联合一起经滴鼻免疫鸡。结果表明：制备的突变体LTK⁶³/G¹⁹²的基因片段经酶切和测序发现,所构建的表达载体pLTK⁶³/G¹⁹² 阅读框架正确,且相应位点氨基酸获得了替换;经SDS-PAGE电泳检测,野生型LT及双突变体均表达出约33.0 ku和13.0 ku的两条蛋白带,与LTA、LTB亚基分子质量相吻合;经Western bolt检测,两个蛋白亚基均可与His抗体发生特异性反应;双突变蛋白的酶活性和毒性与野生型LT相比酶活性和毒性都有所降低;突变体LTK⁶³/G¹⁹²能辅助新城疫疫苗在血清和黏膜中产生较高抗新城疫病毒的IgG和IgA。说明LTK⁶³/G¹⁹²是一个良好的免疫佐剂。     

腺病毒介导的uPAR反义核酸转移抑制肿瘤细胞的侵袭

为了观察尿激酶受体(uPAR)反义核酸对肿瘤细胞体外侵袭的抑制作用,用PCR方法扩增uPAR cDNA 5′端－46 bp～＋454 bp一段长500 bp的序列,利用DNA重组技术将其克隆到病毒载体pAdeno-X中, 构建出重组腺病毒载体pAdeno-X-uPAR(－)和pAdeno-X-uPAR(+).线性化后的重组腺病毒载体转染HEK293细胞7天后,可以获得滴度分别为1.5×10⁸ pfu/ml和0.5×10⁸ pfu/ml的uPAR反义和正义核酸表达重组腺病毒,分别命名为Ad-uPAR(－)和Ad-uPAR(+).以不同的病毒感染指数（MOI）感染人肺巨细胞癌高转移株95D肿瘤细胞,3天后用RNA印迹法可以检测肿瘤细胞uPAR正义和反义核酸表达水平,随着MOI的升高,Ad-uPAR(－)感染的肿瘤细胞uPAR蛋白水平逐渐下降,肿瘤细胞的体外侵袭能力也明显下降,而感染Ad-uPAR(+)的肿瘤细胞无明显变化.结果表明,重组腺病毒可以表达uPAR正义和反义核酸,uPAR反义核酸可以明显抑制人肺巨细胞癌高转移株95D肿瘤细胞在体外的侵袭能力.     

钙、镁离子在活化HL-60细胞核酸内切酶中的作用不同

EGTA ,EDTA抑制游离HL- 6 0细胞核中核酸内切酶的活化 .EDTA对游离HL -6 0细胞核中核酸内切酶活性的抑制可被外加Ca ²⁺逆转 ,而EDTA对该酶活性的抑制却不能被外加Mg ²⁺逆转 .用CHELEX 1 0 0去除游离核孵育缓冲液中存在的Ca2 ²⁺,Mg ²⁺后 ,外界Ca2 ²⁺( 1～ 1 0mmol/L)单独可诱导游离HL -6 0细胞核中的核酸内切酶活化 ,且强度一致 ;而外加Mg ²⁺则不能诱导该酶活性 .只有在钙存在( 0 1～ 1 0mmol/L)的条件下 ,该酶活性才随Mg ²⁺浓度增高而增高 .这说明HL- 6 0细胞中核酸内切酶的活化必须有Ca ²⁺存在 ,在Ca ²⁺存在的条件下 ,其活性可被镁增强 ,Ca ²⁺和Mg ²⁺在核酸内切酶活化中的作用是不同的 .     

杀蚊球形芽孢杆菌BS10的质粒限制图谱

本文报道一株国内分离的具有杀幼蚁活性的球形芽孢杆菌(Bacullus Sphaericus下文简称Bs)的大质粒(pFWl),其分子量为69．5×10⁶道尔顿,绘制了该质粒的xhol限制性核酸内切酶酶图。以苏云金芽孢杆菌以色列变种(Bacillus huringiensis israelensis下文简称BTI)75×10⁶道尔顿质粒为探针与泼菌株DNA进行核酸杂交,结果表明BTI与该菌株为毒素蛋白编码的基因序列之间无同源性,说明它们的进化来源是不相同的。     

人类免疫缺陷病毒-1进入细胞的分子机制及相关药物的研究

艾滋病（AIDS）是由人类免疫缺陷病毒（HIV）侵染表达CD4表面抗原（CD4⁺）的T淋巴细胞而引起的.艾滋病病毒进入CD4⁺T淋巴细胞首先是通过病毒与细胞膜的融合来完成的.该融合过程涉及到病毒表面膜蛋白（gp120和gp41）与细胞表面受体蛋白（CD4和CCR5等）之间的相互作用.根据对这些蛋白质分子结构及作用机制的认识,从破坏病毒与细胞的融合入手,设计新型的抗艾滋药物及疫苗,已成为目前药物开发的新热点.     

猪2型圆环病毒ORF1与ORF2基因和伪狂犬病毒基因的重组与表达的研究

根据GenBank发布的猪2型圆环病毒(PCV2 )序列(AY0 35 82 0 ) ,设计两对特异性引物,采用PCR方法,分别扩增了猪2型圆环病毒ORF1和ORF2基因。将ORF1和ORF2基因的PCR产物回收并酶切后,依次插入到伪狂犬病毒gE gI双缺失通用转移载体pIECMV中,构建了猪2型圆环病毒_伪狂犬病毒重组中间转移质粒pIEORF1-ORF2。采用脂质体介导法,将重组中间转移质粒pIEORF1_ORF2与伪狂犬病毒TK^- gE^- LacZ⁺ 基因组共转染IBRS_2细胞,待发生细胞病变后收集病毒液进行空斑纯化,利用检测PCV2ORF1基因和ORF2基因的PCR方法筛选重组病毒TK^- gE^- gI^- ORF1-ORF2⁺ ,用Southernblotting鉴定重组病毒,并用Westernblotting检测ORF1_ORF2融合蛋白的表达情况,在此基础上也测定了重组病毒在不同细胞上的增殖滴度。结果表明,外源基因ORF1和ORF2已成功插入到TK^- gE^- LacZ⁺ 亲本株的基因组中,并获得了表达,表达的蛋白可与PCV2阳性血清发生反应。同时发现ORF1和ORF2基因的插入不影响重组病毒的增殖特性,其毒力与亲本株相当。     

用构建的新型BmNPV载体在家蚕高效表达人β-干扰素

构建了家蚕核多角体病毒(Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus,BmNPV)新型载体pBm92,该载体将多角体蛋白基因的起始密码ATG改变为ATT,然后在多角体蛋白基因的+12位后连接有5个外源基因的克隆位点。将HulFN-β基因克隆在多角体蛋白基因的+12位后,构建了pBmIFN+12;同时构建了HuIFN－β克隆在－3位后的转移载体pB．mIFN－3。将两种转移载体DNA分别与BmNPV基因组DNA共转染Bm—N细胞。利用重组病毒不产生多角体蛋白的特征,筛选重组病毒。用HuIFN－β基因探针与重组病毒DNA进行杂交鉴定。重组病毒BmIFN+12感染Bm-N细胞,其上清IFN活性为2．0×10⁶Iu／ml,将BmIFN+12注射5龄家蚕虫体,表达水平为5．O×10⁷Iu／ml,是HulFN-β基因克隆在多角体蛋白基因的-3位后获得的重组病毒表达量的2—4倍。构建的新型BmNPv载体能够在家蚕高效地表达HuIFN-β。家蚕虫体生产的rHulFN-β蛋白具有天然HuIFN-β的抗原性。     

核酸内切酶在细胞凋亡中的作用

核酸内切酶在形成细胞凋亡的典型特征——DNA片段化中,发挥着直接的重要作用.介绍了已知的参与细胞凋亡的二价金属离子依赖性和非依赖性核酸内切酶种类,其中二价金属离子依赖性主要有nuc18、DNaseⅠ、Ca^2＋/Mg^2＋核酸内切酶、Ca^2＋/Mn^2＋核酸内切酶、DNaseγ、nuc58和nuc40;二价金属离子非依赖型主要有DNaseⅡ及类似核酸内切酶.此外,还初步探讨了核酸内切酶降解染色质DNA的过程及其作用机制.     

猪流行性腹泻病毒S蛋白胞内区线性B细胞表位最小基序鉴定

[背景] S蛋白是猪流行性腹泻病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV）的主要结构蛋白和免疫原性蛋白,在前期的研究中,本课题组在S蛋白的胞内区鉴定到2个包含线性B细胞表位的短肽。[目的] 鉴定PEDV S蛋白胞内区线性B细胞表位的最小基序。[方法] 原核表达2个短肽的每次后移1个氨基酸的系列8肽,以兔抗S蛋白血清为一抗,通过Western Blot筛选阳性反应8肽,鉴定S蛋白胞内区线性B细胞表位的最小基序。[结果] S蛋白胞内区的2个包含线性B细胞表位的短肽共享一个表位,该表位的最小基序为¹³⁷¹QPYE¹³⁷⁴。同源性分析显示该B细胞表位基序为保守性表位。[结论] 确定了S蛋白胞内区线性B细胞表位的最小基序为¹³⁷¹QPYE¹³⁷⁴;S蛋白抗原表位的鉴定有助于提高对其结构和功能的理解。     

病毒核酸和蛋白分析的原理

<正> 病毒是由核酸和蛋白质两种基本成份所构成的一类最简单的特殊生物。它们严格地寄生于细胞内,以基因复制的方式进行繁殖。因而又有“分子生物”或“寄生分子”之称。 病毒学作为一门相对独立学科的历史还不到40年,进展却比较迅速。这与现代分子生物学方法的运用是分不开的。由于核酸和蛋白是病毒的主要功能成份,所以,在病毒学研究中,对核酸和蛋白的分析显得特别重要。病毒学的各个研究领域都涉及病毒核酸和蛋白的分析。     

番木瓜环斑病毒复制酶(亚基)基因的克隆、序列分析及其植物表达载体的构建

近二年报道,在TMV^⑴、PVX^⑵、PEBV^⑶和CMV^⑷等病毒中,利用病毒编码的复制酶(亚基)基因或相关cDNA片段转化烟草,工程植株获得绝对或极高的病毒抗性。大量研究认为：马铃薯Y病毒组的核内含体大分子量蛋白(Nib)是依赖于RNA的RNA复制酶(或核心亚基),Nlb与上述病毒的复制酶有广泛的同源保守区^⑸。因此,Nib基因的克隆,不但在植物抗病基因工程方面,而且在马铃薯Y病毒组基因组的复制研究方面．均有重要的意义。本文以马铃薯Y病毒组的重要成员番木瓜环斑病毒的华南强株系(PRSV—sM)为材料,克隆了PRSV的Nib基因,并完成其全序列测定和植物表达载体的构建,为探索马铃薯Y病毒组复制酶可能介导的抗病性打下了基础。     

35S-α-dATP用于缺口转移标记探针DNA及蓖麻蚕核型多角体病毒(ArNPV)多角体蛋白基因的初步定位

本文用苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒的多角体蛋白基因mRNA的cDNA为探针,用 ³⁵S-α-dATP为标记化合物,经缺口转移体外标记探针DNA,用旋转柱层析法分离出标记探针,由膜上DNA-DNA杂交,将ArNPV的多角体蛋白基因定位,确定是在其EcoRⅠ-Ⅱ片段上。     

乙型脑炎病毒NS1′蛋白表达对小鼠毒力的影响

为探究乙型脑炎病毒NS1′蛋白表达对小鼠神经毒力和神经侵袭力的影响，以乙脑病毒疫苗株SA14-14-2为模板，对NS2A基因进行A66G定点突变，并构建全长感染性克隆。体外转录后，将病毒RNA导入BHK21细胞，获得突变病毒SA14-14-2（A66G）。同样以乙脑病毒野毒株SA14为模板，采用相同方法构建并获得突变病毒SA14（G66A）。经测序和间接免疫荧光鉴定，证明突变病毒构建成功。Western blot检测发现疫苗株SA14-14-2和SA14(G66A)不表达NS1′蛋白，而野毒株SA14和SA14-14-2（A66G）能表达NS1′蛋白。生长曲线显示突变病毒的生长特性无明显改变。蚀斑实验发现SA14(G66A)的蚀斑较SA14更小，SA14-14-2(A66G)的蚀斑较SA14-14-2更大。细胞增殖活性实验显示NS1′蛋白表达对BHK21细胞的增殖有明显抑制作用 (P＜0.01)。疫苗株SA14-14-2与SA14-14-2（A66G）对1周龄小鼠脑内接种的LD50分别为297.9 PFU(0.02 mL)和143.4 PFU(0.02 mL)，野毒株SA14和SA14(G66A)对3周龄小鼠脑内接种的LD50分别为0.8 PFU(0.03 mL)和2.3 PFU(0.03 mL)。疫苗株SA14-14-2与SA14-14-2(A66G)对2周龄小鼠腹腔接种的LD50分别为＞5.65×10⁶ PFU(0.5 mL)和＞1.46×10⁶ PFU(0.5 mL)。野毒株SA14和SA14(G66A)对3周龄小鼠腹腔接种的LD50分别为1.3×10³ PFU (0.5 mL)和1.2×10⁴ PFU(0.5 mL)。结果表明，乙脑病毒NS2A中第66位碱基是影响NS1′蛋白表达与否的关键位点，且NS1′蛋白表达能提高病毒对小鼠的神经毒力与神经侵袭力，其中对侵袭力的影响更为显著。     

人纤溶酶原激活剂的抑制物2在昆虫细胞中的表达

纤溶酶原激活剂（Plasminogen Activator,PA）对血液中蛋白水解酶的活性有重要的调节作用。纤溶酶原激活剂的抑制物（Plasminogen Activator Inhibitor,PAI）可物异地抑制PA（t-PA和u-PA）,其作用迅速,是PA活性的重要调节因子。很多证据表明,PAI、Pat和体内许多生理反应有密节的关系,如炎症^[1]、组织重塑^[2]、肿瘤生长及恶性细胞的转移^[3,4]等。目前已发现了四种类型的PAI,PAI-2是基中的一种,它可由人胎盘滋养层细胞合成,在孕妇血浆中大理存在^[5].该蛋白具有两种形式：一种分子量为43~47kDa的非糖基化形式：另一种分子量为58~60kDa的糖基化形式^[6,7].对其结构与功能深入的研究将有助于了解许多生于现象,但由于PAI-2基因在大肠杆菌和哺乳动物细胞中的表达都不理想,不能获得足够量的该活性蛋白,本文在以轩状病毒为载体在昆虫细胞中成功地表达了该基因。     

一株辣椒花叶病毒的生化特性研究

本文对辣椒花叶病毒的生化特性进行了研究。病毒蛋白的紫外吸收,最高280毫微米,最低为260毫微米;以SDS-PAGE测定其分子量为17500;病毒蛋白亚基由148个氨基酸组成。从病毒提纯的核酸为线状RNA;紫外吸收最高为260毫微米,最低230毫微米;经聚丙烯酰胺凝胶电泳测定,其分子量为2.0×10~6。根据形态结构、血清学试验、外壳蛋白亚基组成、核酸和蛋白的分子量等综合分析,我们认为这株辣椒花叶病毒是烟草花叶病毒组(TMV)中的一个毒株。     

钙调素结合蛋白参与调控植物逆境胁迫的研究进展

Ca²⁺是植物体内重要的第二信使,当植物受到各种环境刺激时,细胞内的Ca²⁺浓度瞬间产生变化,并被Ca²⁺信号效应器识别,通过与下游的靶蛋白结合并调节其活性,参与调控植物各种生理活动。钙调素结合蛋白以依赖Ca²⁺或不依赖Ca²⁺的方式结合钙调素。对目前已经鉴定的植物钙调素结合蛋白结构特点进行了综述,并着重介绍了钙调素结合蛋白是如何参与调节植物对生物胁迫和非生物胁迫的反应,为提高作物抗病抗逆能力研究提供理论基础。     

表达猪繁殖与呼吸综合征病毒修饰型GP5m蛋白的重组伪狂犬病毒的构建及其在小鼠的免疫反应

猪伪狂犬病毒（PRV）是一种良好的兽用活病毒疫苗载体。但以PRV基因缺失疫苗株TK^-/gE^-/LacZ⁺为载体表达PRRSV GP5的重组病毒TK^-/gE^-/GP5⁺免疫实验动物后难以激发抗PRRSV的中和抗体。为了进一步增强这种重组病毒的免疫效力,用具有更好免疫原性的修饰的ORF5基因（ORF5m）代替天然ORF5基因,构建了表达PRRSV的修饰型GP5m蛋白的重组伪狂犬病毒TK^-/gE^-/GP5m⁺。经PCR、Southern blot、Western blot 证实构建正确,并能表达具有活性的GP5m蛋白。将TK^-/gE^-/GP5m⁺与TK^-/gE^-/GP5⁺分别免疫Balb/c小鼠,结果TK^-/gE^-/GP5m⁺免疫小鼠不仅产生了较高水平的抗PRRSV的中和抗体(3/6只达到了1∶16),而且在诱导PRRSV特异性细胞免疫方面也显著优于TK^-/gE^-/GP5⁺,表明TK^-/gE^-/GP5m⁺是一种极有希望的PRRSV和PRV二价基因工程候选疫苗。