用构建的新型BmNPV载体在家蚕高效表达人β-干扰素

家蚕核多角体病毒(Bombyx mori Nuclear Polyhedrosis Virus.BmNPV)和家蚕细胞已成功地用来大量生产具有生物活性的重组蛋白。但是BmNPV的通用载体的类型较少。因此,本实验构建了BmNPV新型载体pBm92,该载体将多角体蛋白基因的起始密码ATG改变为ATT,然后在多角体蛋白基因的 12位外连接有5个外源基因的克隆位点。将HuIFN-β基因克隆在多角体蛋白基因的 12位后,构建了pBmIFN 12;同时构建HuIFN-β克隆在-3位后的转移栽体pBmIFN-3。将两种转移载体DNA分别与BmNPV基因组DNA共转染Bm-N细胞。利用重组病毒不产生多角体蛋白的特征,筛选重组病毒。用HuIFN-β基因探针与重组病毒DNA进行杂交鉴定。重组病毒BmIFN 12感染Bm-N细胞,其上清IFN活性最高时可达2.0×10~6IU/ml,将BmIFN 12注射5龄家蚕虫体,表达水平为50×10~7IU/ml,是HuIFN-β基因克隆在多角体蛋白基因的-3位后获得的重组病毒的表达量的2～4倍。家蚕体生产的rHulFN-β为糖基化蛋白具有天然HuIFN-β的抗原性。     

BmNPV和AcNPV扩大寄主域杂交重组病毒表达载体的构建和改进

苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus, 简称AcNPV)和家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus, 简称BmNPV)表达系统是目前最主要的两类昆虫杆状病毒表达系统. 两者各具特点, 前者寄主昆虫个体较小, 但寄主范围广、适合较大规模的细胞悬浮培养生产体系; 而后者虽然寄主专一, 但以个体较大、易饲养的家蚕为寄主, 具有表达量高、 特别适合产业化水平开发的要求. 为了利用AcNPV和BmNPV各自的优势, 扩大昆虫杆状病毒的寄主范围, 以BmNPV为基础, 利用决定病毒寄主范围的DNA解旋酶基因及同源重组原理, 构建了介于BmNPV和AcNPV间的杂交重组病毒(hybrid baculovirus of AcNPV and BmNPV, 简称HyNPV). 这样构建的杂交重组病毒具有AcNPV和BmNPV的双重优点, 既能感染所有AcNPV的寄主, 又可以在家蚕中表达. 以人碱性成纤维细胞成长因子基因作为应用实例, 克隆构建了这样的一种重组杂交病毒, 可在Sf21, Tn-5, BmN培养细胞及家蚕个体中穿梭表达. 为了减少表达后重组蛋白的降解, 利用“基因敲除”法删除了杆状病毒本身的一种主要蛋白酶-半胱氨酸蛋白酶基因, 提高了重组蛋白的稳定性和表达效率.     

利用杆状病毒载体在棉铃虫血细胞中表达大肠杆菌β－半乳糖苷酶

用携带大肠杆菌β－半乳糖苷酶基因的杆状病毒转移载体pAc36O－B－gal与野生型的苜蓿丫纹夜蛾(AcNPV)DNA同时转染草地夜蛾细胞,经x—gal筛选和空斑纯化得到重组型杆状病毒AcNPV－β－gal。该重组病毒能有效地感染棉铃虫血细胞系,并高效表达出受AcNPV多角体蛋白启动子控制的、具有生物活性的外源基因产物－－β－半裂糖苷酶。80％以上的酶蛋白能分泌到细胞外,培养液中酶活可达每毫升50000单位以上,约相当于170μg酶蛋白。用要SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳分离表达产物和β－半乳糖苷酶在凝胶上的特异性显色反应分析,重组病毒在棉铃虫血细胞中表达的AcNPV多角体蛋白－－大肠杆菌β－半乳糖苷酶融合蛋白是以5种活性的多聚体或复合物形式存在的。     

杆状病毒转移载体的构建及绿色荧光蛋白在斜纹夜蛾幼虫中的表达

为构建斜纹夜蛾核型多角体病毒 （SpltMNPV）的重组病毒,以该病毒日本C3株基因组DNA为PCR扩增模板,根据GenBank SpltMNPV中国G2株基因序列,设计了两对引物分别扩增多角体蛋白基因的5′端侧翼序列（含启动子）和3′端侧翼序列（含终止子）,将这两个片段依次克隆于pUC18质粒载体后,再将绿色荧光蛋白(GFP)基因亚克隆到上述载体的多角体蛋白基因启动子和终止子之间,获得转移载体pSplt-gfp。将pSplt-gfp与野生型SpltMNPV 基因组DNA共转染Spli细胞,通过同源重组和有限稀释法筛选,获得了以gfp基因替代多角体蛋白基因的重组病毒SpltMNPV-gfp。SpltMNPV-gfp感染Spli细胞和斜纹夜蛾幼虫,分别在感染24h和48h后可发现绿色荧光蛋白的表达。该重组病毒的获得,为建立斜纹夜蛾核型多角体病毒表达体系奠定了基础。     

异源多角体蛋白对家蚕核型多角体病毒粒子的包装

利用PCR方法从AcMNPV基因组DNA中分离出多角体蛋白基因 ,将该扩增片段克隆到转移载体pBacPAK8中 ,得到重组转移载体pOAc。将该质粒DNA与线性化的Bm BacPAK6病毒基因组DNA共传染BmN细胞 ,得到了能形成多角体且不产生蓝色空斑的重组病毒hp BmNPV。纯化该重组病毒的多角体颗粒 ,并对多角体蛋白、病毒核酸及多角体病毒颗粒进行分析 ,发现AcMNPV的多角体蛋白能在家蚕细胞中大量表达且能在细胞内识别家蚕核型多角体病毒并组装成多角体颗粒 ;病毒基因组DNA因部分交换 ,其酶切行为发生了相应的变化 ;电镜观察发现经AcMNPV多角体蛋白包装的家蚕核型多角体病毒的多角体颗粒大小为1 2 μm～ 2 9μm ,明显小于野生型家蚕核型多角体病毒的多角体颗粒     

DNA错配修复基因mutS的高效表达及表达产物活性鉴定

将DNA错配修复基因mutS（2.56kb）克隆于分泌型原核表达载体pET32a（+）上,以N端融合6个组氨酸的形式在E.coliAD494(DE3) 中进行了IPTG诱导表达。SDSPAGE分析证实有一与预期分子量相应的诱导表达条带,其表达量占全菌蛋白质的35％左右,且表达蛋白以可溶形式存在。利用固定化金属离子（Ni²⁺）配体亲和层析柱纯化目的蛋白,其纯度为90％以上。与含有错配碱基DNA双链的结合反应证明该蛋白具有特异性识别、结合含有错配碱基DNA双链的生物活性。     

重组家蚕病毒表达系统转移载体的构建和β—半乳糖苷酶的表达

本文从中国农科院蚕业研究所提供的我国家蚕核多角体病毒镇江株中获得了多角体蛋白的强启动子,用此启动子构建了家蚕病毒表达系统的转移载体。外源基因能在此启动了控制下在家蚕细胞和虫体中进行高效表达。用此载体我们首先成功地在家蚕虫体中高效表达了β－半乳糖苷酶,表达量达到５８０μｇ／条蚕,从而证实我们构建的载体是可靠的,有效的,可用于家蚕重组病毒表达外源基因的研究。     

用构建的新型BmNPV载体在家蚕高效表达人β—干扰素

构建了家蚕核多角体病毒新型载体ｐＢｍ９２,该载体将多角体蛋白基因的起始密码ＡＴＧ改变为ＡＴＴ,然后在多角体蛋白基因的＋１２位后连接有５个外源基因的克隆位点。将ＨｕＩＦＮ－β基因克隆在多角体蛋白基因的＋１２位后,构建了ｐＢｍＩＦＮ＋１２;同时构建了Ｈｕ ＩＦＮ－β克隆在－３位后的转移载体ｐＢ－ｍＩＦＮ－３。     

失活 ChiA 和 v-cath 基因的重组BmNPV 表达 hGM-CSF

利用 DNA 同源重组技术使家蚕核型多角体病毒的多角体蛋白基因取代 v-cath 、 ChiA 两基因的部分编码区域和共同的启动子区域,获得了 v-cath 、 ChiA 两基因同时失活的、可形成多角体的、并能表达人粒细胞 - 巨噬细胞集落刺激因子的重组病毒 BmNPVpolh+CP－ChiA－GMCSF+. 研究结果显示： v-cath 、 ChiA 两基因的失活不影响病毒的复制及多角体的形成,但感染细胞的存活时间比野生病毒感染的多 2 天,可明显改善外源基因在培养细胞和家蚕中的表达水平;感染 BmNPV polh+CP－ChiA－GMCSF+的家蚕幼虫体表保持正常,无野生病毒感染后引起的破皮流脓现象 .     

双基因双重组AcNPV的构建及其杀虫活性

质粒pAcIEneo携带杆状病毒极早期基因IE1启动子驱动的新霉素抗性基因(neo),经酶切回收后插入到质粒pAc34DZ1的SacI位点上,构建成多角体外膜蛋白基因(pe)失活的转移载体pAc34DZ2。我们曾构建了一个多角体完整(ocu+)的表达苏云金杆菌(Bt)截短cryIab基因的重组病毒(1)vAcPhBtT。为了改进这一重组病毒的杀虫效率,将转移载体pAc34DZ2与重组病毒(1)vAcPhBtT DNA共转染Sf9细胞,进行第二次同源重组。由于neo基因的表达,用G418筛选得到重组病毒(2)vAcPhBtTPE^-;Southern blot证明vAcPhBtTPE-的构建是正确的,经SDS-PAGE分析,重组病毒(2)仍然能在昆虫细胞中表达80kD的Bt截短毒蛋白,但不表达34kD的多角体外膜蛋白。电镜观察重组病毒(2)无多角体外膜,碱解时病毒粒子释放的速度快于重组病毒(1)。以重组病毒(2)感染甜菜夜蛾三龄幼虫,LC₅₀比野生型病毒小了接近1倍,LT₅₀提前近2d。     

扣囊复膜孢酵母β-葡萄糖苷酶基因在毕赤酵母中的克隆与表达

利用PCR技术,从扣囊复膜孢酵母的总DNA中扩增得到β-葡萄糖苷酶（β-Glucosidase）基因 (BGL1),长度为2596 bp,连接到pGEMT载体上,用限制性内切酶切下目的基因,插入到巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC9K中,使之位于α-因子信号肽下游,且与之同框, 构建成重组质粒pSHL9K。 通过电转化将重组质粒pSHL9K插入到Pichia pastoris GS115菌株染色体中,获得高效表达BGL1基因的毕赤酵母重组工程菌株。重组酶的最适温度为50℃,最适pH为5.4。培养基中β-葡萄糖苷酶活性最高可达47U/mL。     

利用Red系统快速敲除家蚕核型多角体病毒orf60基因

用Red重组系统和最近构建的家蚕核型多角体病毒（BmNPV）bacmid在大肠杆菌BW25113中快速地敲除BmNPV orf60基因。从大肠杆菌BmDH10Bac中提取BmNPV bacmid,将其电转化到含有质粒pKD46（能表达Red重组酶）的大肠杆菌菌株BW25113中,获得了可用于BmNPV基因打靶的菌株BW25113-Bac。设计一对长63bp的引物（5′端为orf60基因的左右同源臂,长45bp;3′端长18bp,为氯霉素抗性基因（cat）的首尾序列）,以pKD3质粒（含cat）为模板,PCR扩增携带orf60左右同源臂的cat,即打靶线性化片段。将该线性化片段电转入BW25113-Bac菌株,在Red重组酶的作用下,线性化片段与BmNPV bacmid中的orf60基因发生同源重组。设计3对特异引物,用PCR方法证明cat成功地替换了BmNPV orf60基因。重组bacmid DNA转染BmN细胞后,Western blot分析未检测到orf60基因的表达。     

人β神经生长因子在大肠杆菌中的高表达

将编码人β神经生长因子(Huβ-HGF)的基因克隆到由T7噬菌体启动子控制的pET11c大肠杆菌表达载体中,重组质粒经鉴定含有Huβ-NGF基因,未解聚的表达产物经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),结果显示出二聚体27kD的蛋白带。而完全解聚的表达产物SDS-PAGE显示出一条13β5kD单体带。经凝胶电泳扫描,表达带占菌体总蛋白的14.5％。用兔抗鼠β—NGF的多克隆抗体进行的Western-Blot的结果表明,二聚体同单体都有免疫原性。在生物活性的鉴定中,菌体表达产物可以使小鸡鸡胚的背根神经节产生神经元突起,由此可以证明该表达产物有较高的生物活性。     

抗草甘膦抗虫植物表达载体的构建及其转基因烟草的分析

构建了含草甘膦抗性突变基因（aroAM12）和人工合成重组Bt抗虫基因（Bts1m）的植物表达载体pCM12_s1m。aroAM12基因的表达由CaMV35S启动子控制,Bts1m基因的表达由2E_CaMV35S启动子和Ω因子控制。通过农杆菌介导,将aroAM12和Bts1m基因转化到烟草中,转基因烟草通过在含草甘膦的MS培养基上筛选而获得。Southern blot分析表明所有经过草甘膦筛选出的转化植株都整合有aroAM12基因,约70%的转化植株同时整合有aroAM12和Bts1m基因。Northern blot、Immunodot blot分析进一步证明整合的两个基因在转录、翻译水平上均进行了表达,不同植株之间表达存在着差异。草甘膦抗性和虫试实验证明,获得的转基因烟草对草甘膦和烟青虫具有很强的抗性。     

利用Red系统快速敲除家蚕核型多角体病毒orf60基因

用Red重组系统和最近构建的家蚕核型多角体病毒（BmNPV）bacmid在大肠杆菌BW25113中快速地敲除BmNPV orf60基因。从大肠杆菌BmDH10Bac中提取BmNPV bacmid,将其电转化到含有质粒pKD46（能表达Red重组酶）的大肠杆菌菌株BW25113中,获得了可用于BmNPV基因打靶的菌株BW25113-Bac。设计一对长63bp的引物（5′端为orf60基因的左右同源臂,长45bp;3′端长18bp,为氯霉素抗性基因（cat）的首尾序列）,以pKD3质粒（含cat）为模板,PCR扩增携带orf60左右同源臂的cat,即打靶线性化片段。将该线性化片段电转入BW25113-Bac菌株,在Red重组酶的作用下,线性化片段与BmNPV bacmid中的orf60基因发生同源重组。设计3对特异引物,用PCR方法证明cat成功地替换了BmNPV orf60基因。重组bacmid DNA转染BmN细胞后,Western blot分析未检测到orf60基因的表达。     

利用杆状病毒表达系统表达金鱼生长激素I基因

以不含起始密码ATG的质粒Psxivvi⁺X3为转移载体,将编码金鱼生长激素I的Cdna插入粉纹夜蛾核型多角体病毒(TnNPV)基因组中,构建了形成多角体的重组病毒株TnNPV—SX⁺gfGHl21a。该毒株能利用合成多角体XIV串联启动子,在重组病毒感染的草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda,Sf)昆虫细胞及银纹夜蛾幼虫中表达金鱼生长激素I基因。感染离体细胞及虫俸后的蛋白SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳表明．所表达的蛋白分子量为22．5kDa,与理论计算值相符。Westem印迹证实。金鱼生长激素特异蛋白得到表达。     

含庚型肝炎病毒E2基因片段质粒DNA能诱发相当强烈的体液免疫应答

研究了庚型肝炎病毒E2(HGVE2 )基因片段作为DNA疫苗的可行性。将来自于质粒pThioHis-E2编码HGVE2的基因片段 (559bp)亚克隆到质粒pCMV-S中 ,使之和HBsAg基因位于同一阅读框 ,形成重组质粒pCMV-S-E2。用纯化的质粒pCMV-S-E2DNA注射到昆明小鼠后腿四头肌中来免疫小鼠 ,同时用pCMV-S作为对照。间隔 14天再加强一次免疫。在加强免疫后的第 8天眼眶取血。用E2-GST融合蛋白作为固定化抗原 ,通过ELISA检测受试小鼠的体液免疫应答。结果表明 ,用质粒pCMV-S-EDNA免疫的小鼠可以产生很强的体液免疫应答。     

鸡贫血病毒VP1和VP2蛋白在家蚕中的联合表达

将鸡贫血病毒vp1和vp2基因分别克隆入转移载体pBacPAK8中,获得重组转移质粒pBac-vp1和pBac-vp2。以上两质粒分别与Cvn Ⅰ酶切线性化的亲本病毒Bm\|BacPAK6 DNA共转染家蚕细胞,通过蓝白斑筛选,纯化得到重组病毒Bm-vp1和Bm-vp2。PCR分析表明vp1和vp2基因已整合进杆状病毒基因组中。将Bm-vp1和Bm-vp2共感染5龄家蚕,通过表达产物免疫SPF鸡产生的抗血清与CAV感染的MDCCMSB1细胞的间接荧光抗体分析,证明表达产物能诱导鸡产生相应的抗体,而且能够保护子代鸡免受CAV的攻击。该研究表明,表达VP1和VP2蛋白的重组家蚕杆状病毒(Recombinant BmNPV)是很有前途的CAV亚单位疫苗的生产系统。     

人α干扰素基因在家蚕细胞中的高表达

用家蚕核多角体病毒(NPV)为载体,使人α干扰素基因正确装配到NPV多角体蛋白基因启动子控制下,构成重组质粒,又与NPVDNA共转染家蚕细胞。反复病毒空斑纯化后,得到重组病毒。     

以核多角体病毒为载体在家蚕中生产外源蛋白

以家蚕核多角体病毒(BmNPV)为载体,在家蚕幼虫或家蚕培养细胞系中表达的外源基因越来越多,其表达的产物已涉及到医用药物、医疗诊断、疫苗生产、生物防治等诸多领域,文章就BmNPV的特性及其基因组构造,多角体蛋白基因的特性,重组BmNPV的构建及其在家蚕幼虫体内和细胞系中的表达,BmNPV-家蚕表达系统的外源蛋白生产效率及其应用等各个方面作了全面、系统的综述.