HCV5＇端非编码区cDNA的体外转录

采用逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）从广东省一例慢性丙型肝炎病人血清中获得丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）５＇端非编码区（５＇ＮＣＲ）３０２ｂｐ的ｃＤＮＡ片段,经补齐和提纯后插入ｐＵＣ１９质粒,获得的重组体ｐＵＮ进行序列测定。将ｐＵＮ的目的基因亚克隆进体外转录载体ｐＳＰＯＲＴＩ多克隆位点的ＥｏｏＲＩ和ＰｓｔＩ切点之间,所得重组体ｐＳＮ线性化后由Ｔ＿７ＲＮＡ多聚酶及ＳＰ６ＲＮＡ多聚酶引导体外转录反应,产物经凝胶电泳及特异引物ＲＴ－ＰＣＲ,证实ＳＰ６引导的是正义ＲＮＡ,Ｔ７合成的是反义ＲＮＡ,其大小分别力４２９ｂｐ和３６２ｂｐ。并证实所得ＲＮＡ力ＨＣＶ５＇ＮＣＲｃＤＮＡ转录而来。获得的ＨＣＶ５＇ＮＣＲｃＤＮＡ和ＲＮＡ在常规逆转录和ＰＣＲ步骤中用于设立有效的模板对照,对消除假用性及评估试剂有重要意义。同时,ＨＣＶ５＇ＮＣＲ体外转录载体的构建可用于制各ＲＮＡ探针和反义ＲＮＡ,改进后还可作为定量ＰＣＲ的竞争性模板。     

马铃薯卷叶病毒基因间隔区的克隆及序列分析

根据已报道的马铃薯卷叶病毒基因组序列．设计合成一对特异性引物,以马铃薯卷叶病毒中国分离株（ＰＬＲＶ－Ｃｈ）的ＲＮＡ为模板,反转录合成ｃＤＮＡ第一条链,经ＰＣＲ扩增后克隆于ｐＵＣ１９质粒中,进一步用ＰＣＲ鉴定、限制酶切分析和序列分析,结果表明：ＰＬＲＶ－Ｃｈ基因间隔区由１９７个核苷酸组成,与国外报道的荷兰ＰＬＲＶ－Ｎ加拿大ＰＬＲＶ－Ｃ,澳大利亚ＰＬＲＶ－Ａ,苏格兰ＰＬＲＶ－Ｓ各株系核苷酸序列具有很高的同源性,同源率依次为９９％、９８％、９３％、９８％。     

马铃薯卷叶病毒56kD蛋白基因及3‘端非编码区克隆和序列分析

根据已报道的马铃薯卷叶病毒基因组序列,设计合成一对特异性引物,以马铃薯卷叶病毒中国分离株的ＲＮＡ为模板,反转录合成了ｃＤＮＡ第一条链,经ＰＣＲ扩增后克隆于ｐＵＣ１９质粒中,进一步用ＰＣＲ鉴定,限制酶切分析用序列分析。结果表明,ＰＬＲＶ－Ｃｈ５６ｋＤ蛋白基因由１５２７个核苷酸组成,编码５０８个氨基酸,３‘端非编码区由１４１个核苷酸组成,与国外报道的苏格兰ＰＬＲＶ－Ｓ,荷兰ＰＬＲＶ－Ｎ,加拿大ＰＬＲＶ     

虹鳟鱼金属硫蛋白启动子的体外扩增、克隆及其序列分析

以含有虹鳟鱼金属硫蛋白基因的质粒ＤＮＡ为模板,以合成的两段３２个寡聚核苷酸为引物,经过ＰＣＲ扩增,合成了４３３ｂｐ的片段,把其克隆到ｐＢＬ－ＣＡＴ载体中,序列分析和限制酶切图谱表明所克隆的虹鳟鱼金属硫蛋白启动子含有４３３ｂｐ,含有ＴＡＴＡ和ＣＡＡＴ序列,与Ｈｏｎｇ报导的鳟鱼金属硫蛋白启动子的序列比较,其核苷酸泊同源率为１００％。     

抗人CD3单抗轻、重链可变区基因的克隆及序列分析

根据抗体基因可变区两端保守序列ＦＲ１和ＦＲ４,设计并化学合成轻重链ＰＣＲ扩增引物。从体外培养细胞ＵＣＨＴ１中提取总ＲＮＡ,反转录成Ｃｄｎａ,以Ｃｄｎａ为模板经ＰＣＲ扩增轻,重链可变区基因片段。将扩增片段克隆至Ｐｕｃ１９质粒,筛选阳性克隆并测序,序列分析结果为重链３６６ｐｂ,编码１２２个氨基酸,轻链３２７ｂｐ,编码１０９个氨基酸     

传染性法氏囊病病毒中国强毒株A节段cDNA基因的克隆和序列分析

以来自哈尔滨传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ） 强毒株（Ｈａｒｂｉｎ 毒株,Ｈ） 的基因组ＲＮＡ为模板,用反转录聚合酶链反应（ＲＴ－ ＰＣＲ） 的方法得到了其Ａ 节段的全长ｃＤＮＡ 片段,分５＇端（１ ６５９ｂｐ） 和３＇端（１ ４４４ｂｐ） 上下两段分别克隆到ｐＧＥＭＢ○Ｒ － Ｔ 载体上,测定了其核苷酸顺序,在长为３ １０１ ｂｐ 中含有两个阅读框ＯＲＦＡ１ 和ＯＲＦＡ２ ,分别编码１ ０１２ 个氨基酸的前体蛋白（ＶＰ２ － ４ －３） 和１４５ 个氨基酸的ＶＰ５,ＯＲＦＡ１ 和ＯＲＦＡ２ 有部分的重叠。将核苷酸序列及推测出的氨基酸序列与已报道的ＩＢＤＶ 血清Ⅰ型和Ⅱ型毒株的相应序列进行了比较,结果表明：Ｈ 毒株与其它血清Ⅰ型毒株之间,在核苷酸水平上存在２５ｂｐ － ２６７ｂｐ 的差异;在氨基酸水平上存在１７ ～４０ 个氨基酸的差异。在ＶＰ２ － ４ － ３ 内比较显示,Ｈ 毒株与Ｐ２ 、Ｃｕ－ １ 之间氨基酸的差异最小为１ ．７％ ,Ｈ 毒株与ＵＫ６６１ 之间氨基酸的差异最大为３ ．９ ％ 。变异主要发生在ＶＰ２ 的可变区（２０６ － ３５０ 位氨基酸） ,在Ｈ 毒株所特有的１２ 个氨基酸当中,该区就占５ 个,代表１ ．７６ ％ 的变异。ＶＰ４、ＶＰ３ 和ＶＰ５区各有     

甜菜坏死黄脉病毒内蒙分离物自然缺失突变体缺失区域的定位分析

以甜菜坏死黄脉病毒内蒙分离物（ＢＮＹＶＶ ＮＭ）总ＲＮＡ为模板,经ＲＴ－ＰＣＲ扩增,分别获得ＲＮＡ２、ＲＮＡ３和ＲＮＡ４自然缺失突变体ｃＤＮＡ克隆。序列分析结果表明,ＲＮＡ２自然缺失突变体在７５ｋＤ通读蛋白编码区Ｃ端缺失３４８个核苷酸（缺失位置ｎｔ１４８８￣ｎｔ１８３５）。ＲＮＡ３在其２５ｋＤ蛋白编码区内缺失３６０个核苷酸（缺失位置ｎｔ７２９￣ｎｔ１０８８）。ＲＮＡ４的自然缺失区域位于３１ｋＤ蛋白     

可溶性白细胞介素6受体基因在链霉菌的克隆表达研究

以分离提取的ＨｅＬａ细胞总ＲＮＡ为模板,通过ＲＴ－ＰＣＲ反应扩增得到了１０１７ｂｐ的人可溶性白细胞介素６受体（ｓＩＬ－６Ｒ）ｃＤＮＡ片段,将扩增片段克隆到ｐＵＣ１９质粒中进行序列测定。结果证明该片的序列与文献报道的ｓＩＬ－６ＲｃＤＮＡ的序列完全一致,将ｓＩＬ－６ＲｃＤＮＡ与链霉素信号肽ｍｅｌＣｌ的编码序列融合后得到的融合基因ｍｅｌ／ｓＩＬ－６Ｒ克隆到链霉菌质粒ｐＬＪ４５９中,构建成重组表达质粒ｐＬ     

利用PCR技术行反义寡核苷酸体外抗丁型肝炎病毒基因组RNA中核酶的研究

设计一对ＰＣＲ引物,其中上游引物的５’端除目的基因外,还加Ｔ７ＲＮＡ聚合酶启动子序列,以质粒（ｐＳＶＬＤ３）为模板,通过ＰＣＲ扩增出带有Ｔ７ＲＮＡ聚合酶启动子序列的１３９ｂｐ的ｃＤＮＡ片段,它含有丁型肝炎病毒（ＨＤＶ）基因组ＲＮＡ中核酶（Ｒｉｂｏｚｙｍｅ）区的ｃＤＮＡ该核酶具有自身裂解功能,经测序发现该ｃＤＮＡ有２个碱基变异,以此ＰＣＲ产物为模板,通过Ｔ７ＲＮＡ聚合酶,转录出核酶的前体,并观察到其     

水稻条纹病毒两个分离物RNA4基因间隔区的序列比较

通过ＲＴ－ＰＣＲ扩增了我国水稻秫纹病毒（ＲＳＶ）山东济宁（ＪＮ）、云南宜良（ＹＬ）两个分离物ＲＮＡ４基因间隔区（ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ ｒｅｇｉｏｎ,ＩＲ）序列,并克隆于ｐＧＥＭ－Ｔ ｅａｓｙ载体上。序列分析结果表明：ＪＮ、ＹＬ两分离物ＲＮＡ４ ＩＲ均由６５４个核苷酸组成,两者之间的同源率为９２％。ＪＮ、ＹＬ两个分离物ＲＮＡ４ ＩＲ在ＡＵ碱基富集处可形成上明显的结构,其中一个序列比较保守,形成的发夹     

人ZP3基因的RT-PCR cDNA克隆

目的：研究人ZP3基因的结构及构建人ZP3基因原核表达系统。方法：从人卵巢组织中分离出mRNA并以此作为模版,通过RT—PCR扩增出人ZP3基因cDNA片段,然后将其克隆在pUC18质粒上,并对克隆片段进行序列分析。结果：共克隆到ZP3-A（1300bp）、ZP3-B（1180bp）、ZP3-C（1200bp）和ZP3-D（1080bp）4种不同长度的人ZP3基因cDNA片段,对其中最长的ZP3-A片段的测序结果表明,它包含了人ZP3基因阅读框内的全部序列,与NCBI Sequence Viewer中公布的人ZP3 mRNA序列（NM-007155）相比较,在1275bp长的编码区内只有一个碱基不同,两者同源性达到99．92％。结论：本研究克隆到的ZP3-A cDNA片段确是人ZP3基因无疑。     

人脑内-含有ACP样结构域新基因的发现

为寻找脑内新基因,以正常成人全脑cDNA为模板,采用锚定PCR方法进行扩增,将经琼脂糖DNA电泳 鉴定获得的一约1200bp大小的特异性条带回收,并克隆入Teasy载体.用310 Genetic Analyzer进行自动测序. 所得序列进行生物信息学分析BLAST相似性分析结果证明所得序列为新序列,读框分析表明,该序列中存在 一完整编码区,编码含357个氨基酸的蛋白质.ProDom软件分析发现其含有酰基携带蛋白(ACP)样结构域. 随后,经3'RACE法克隆到该基因的全长cDNA,其全长为2024bp,染色体定位在14q11.2,含有16个外显子, 15个内含子,该基因已登录到GenBank.经设计编码区引物,从Teasy载体扩增出编码区后再克隆入pGEX-4T1 表达载体,经异丙基硫代-D-乳糖苷(IPTG)化学诱导表达.其编码区克隆人pGEX-4T1表达载体后,转入 JM109宿主菌,经IPTG诱导已得到表达.点杂交及RNA印迹表明,该基因在正常成人脑内广泛高表达.     

金黄色葡萄球菌肠毒素B基因的克隆和在大肠杆菌中高效表达

利用PCR方法从金黄色葡萄球菌TSTw基因组DNA中扩增出约700bp的DNA片段,将之克隆到pGEM7Zf(+)载体上并转化大肠杆菌 DH5α菌株。重组质粒的测序结果表明克隆到了seb基因,它含有717bp（不包括N端81bp的信号肽编码区）,其核苷酸序列与文献报道完全一致。将其连接于表达载体7ZTS上,转化到大肠杆菌JM109（DE3）内。表达的SEB占总蛋白33.5%。      

Inverse polymerase chain reaction mediated chromosome walking within the human glutamic acid decarboxylase gene

Using inverse polymerase chain reaction (PCR), we have cloned partial intronic sequences from human glutamic acid decarboxylase (GAD) gene. A small 153 bp core region was selected from the GAD cDNA sequence to design outward primers corresponding to its 3′ and 5′ ends. EcoRI digested human DNA which had been circularized by self-ligation and then linearized withSacII was used as a substrate to can.y out PCR. This gave a 900 bp long product which was cloned into pUC19. The sequence analysis of this fragment revealed the presence of introns in the region flanking the selected core DNA. In this work we used this technique to walk into the upsteam region of the GAD gene using sequence information from its cloned cDNA.     

节杆菌A．pascens DMDC12中SOD基因的克隆和序列分析

根据基因库中细菌SOD的基因保守序列和Arthrobacter pascens DMDC12的N-末端氨基酸序列设计引物,采用PCR技术,以A.pascens DMDC12基因组为模板,克隆了A.pascens DMDC12中Mn-SOD的567 bp的基因片段;再结合该基因片段和A.pascens DMDC12中SOD的N-末端氨基酸序列的有关信息,设计包含该sod完整ORF区域的引物,成功扩增了A.pascens DMDC12中Mn-SOD的基因序列,新sod序列(sodAP)已提交Gen-Bank(收录号DQ779150)。利用生物学软件对该序列进行分析表明,该sodAP序列的ORF区域全长651 bp,编码216个氨基酸;该序列和Arthrobacter sp.FB24的SOD基因序列同源性为86%。     

胚乳自主发生型龙须草FIE基因部分cDNA序列克隆和分析

根据拟南芥(Arabidopsis thaliana)、水稻(Oryza sativa)、玉米(Zea mays)等物种的FIE序列的保守区域设计简并引物,以龙须草(Eulaliopsis binata)的花序为材料,抽提RNA,用RT-PCR的方法扩增到800 bp左右的片断,将其克隆到pGEM-T载体上并测序。结果表明该片断与已报道的玉米、高粱(Sorghum halepense)和水稻等FIE同源基因具有较高的相似性,为龙须草FIE基因特异片断。     

酒类酒球菌苹果酸-乳酸酶基因的克隆

利用PCR方法从酒类酒球菌(Oenococcus oeni)基因组中扩增出651 bp的DNA片段,将之克隆到pUC19-T载体上并转化大肠杆菌(E.coli)JM109菌株.重组质粒的测序结果表明,克隆到了苹果酸-乳酸酶基因(mle),它含有527 bp的阅读框架,其核苷酸序列与文献报道相同.     

香蕉花叶病毒外壳蛋白基因克隆及表达载体的构建

从海南大田感染香蕉花叶病的香蕉叶片 ,获得香蕉花叶病毒 ,提纯其 RNA,在 AMV反转录酶作用下合成 c DNA第一链 ,经 PCR扩增 ,获得一约 70 0 bp的 DNA片段 ,测序结果显示所克隆的 DNA片段包含一完整的香蕉花叶病毒株系 ( CMV-BHI)外壳蛋白基因 ,长度为 6 5 7bp,然后将此 DNA片段 ,分别克隆到p BI1 2 1和 p KHG4质粒 ,构成两个含 Ca MV35 s启动子 ( 5 '-端 )、NOS终止子 ( 3'-端 )和分别含 NPT 标记基因和 NPT 及 HPT标记基因的植物表达载体 ( p TBB和 p TBK)。然后用 p AHC1 8中的 UBI promoter换下p BI1 2 1的 Ca MV35 s promoter,构成 p BIAH;再用 CMV-BHI外壳蛋白基因换下 p BIAH中 GUS基因 ,构成一含单子叶植物启动子 UBI和 NPT 标记基因的植物表达载体 ( p TBBU)。从而为 CMV-BHI外壳蛋白基因在香蕉中表达打下了基础     

Promoter analysis of tumor suppressor gene PTEN: identification of minimum promoter region

Mutations of PTEN, a tumor suppressor gene located on chromosome 10, which encodes a protein-tyrosine and lipid-phosphatase, are prevalent in various human cancers, including glioblastoma. Despite extensive characterization of PTEN mutations in human cancers and a relatively good understanding of the molecular roles of PTEN in the control of cellular processes, little is known about modes of PTEN regulation. To understand the regulation of expression of the tumor suppressor gene PTEN, we isolated a 2212 bp fragment from the human BAC clone 46B12 DNA. The 3' end of this fragment starts at the Not I site of -745 relative to the first translation codon ATG (+1) and ends at the Sal I site of -2957 at the 5' end. Using classical 5'RACE and primer extension techniques, nine start sites were observed between -817 and -984 upstream of the ATG start site. We located a 137 bp fragment (-958/-821) as the minimum promoter region using promoter deletion and luciferase assays. A 704 bp fragment (-33/-737) downstream of the 2212 bp fragment was also cloned. As indicated by luciferase assays, the data show that this region possesses no promoter function. Interestingly, a p53 binding sequence is located within the 599 bp fragment (-1344/-745), although p53 expression had a minimal effect on PTEN, demonstrating its insignificant role in PTEN gene expression.