内生多粘类芽胞杆菌纤溶酶基因PPFE-Ⅰ在大肠杆菌中融合表达及活性分析

以内生多粘类芽胞杆菌EJS-3基因组DNA为模板,PCR扩增PPFE-Ⅰ基因,并克隆到pMD19-T载体上,构建克隆载体pMD-PPFE-Ⅰ,经测序正确后,将PPFE-Ⅰ基因克隆至表达载体pET-DsbA上构建重组表达质粒pET-DsbA/PPFE-Ⅰ,将其转化至E.coli BL21(DE3),在IPTG诱导下实现了融合蛋白DsbA-PPFE-Ⅰ的表达,表达产物酶活性达228 IU/mL.表达产物用SDS-PAGE和Western blotting进行鉴定.SDS-PAGE电泳检测表明融合蛋白主要以可溶形式表达,占菌体总蛋白的18.4%.Western blotting结果表明在相应分子量处有一条特异性条带,证实该蛋白为DsbA-PPFE-Ⅰ融合蛋白.表达产物通过Ni亲和柱、凝血酶酶切及Scphadex G-100等步骤进行分离纯化,并用MALDI-TOF质谱对重组酶进行了鉴定.纯化后的表达产物在纤维蛋白平板上表现出明显的纤溶活性.     

棉花GhCOMT1基因原核表达载体构建及蛋白纯化和Western鉴定

为进一步研究GhCOMT1基因的功能,构建了原核表达载体pET-28a-GhCOMT1,酶切鉴定并测序后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,在0.2mmol/L IPTG浓度条件下分别进行不同温度梯度诱导,用蛋白标记亲和层析柱(His TrapTM HP)对重组蛋白进行纯化,并用SDS-PAGE和Western blotting方法鉴定表达产物。结果表明:16℃诱导12h、30℃诱导3h和37℃诱导3h后融合蛋白均以包涵体的形式表达,其中16℃诱导12h的蛋白表达量最大;SDS-PAGE检测目的蛋白相对分子量约为39.748kD;Western blotting分析表明,目的蛋白能与His多克隆抗体起特异性反应。     

pGEX-4T-3-MFGF21表达载体的构建、表达与纯化

目的:构建小鼠FGF21(fibroblast growth factor 21,FGF21)重组表达载体pGEX-4T-3-MFGF21,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,纯化后获得小鼠FGF21融合蛋白。方法:提取小鼠肝脏总RNA后,经RT-PCR扩增获得目的片段,将其克隆至pMD19-T进行保存。以T载体为模板,扩增MFGF21 mat-peptide,构建重组原核表达载体pGEX-4T-3-MFGF21。将重组质粒转化至大肠杆菌菌株BL21(DE3)中,在不同IPTG浓度、温度及转速下对表达载体进行诱导表达,优化表达条件,表达产物经SDS-PAGE电泳以鉴定是否为可溶性表达,采用亲和层析法纯化各表达产物后,进行Western blotting鉴定。结果:成功构建重组表达载体pGEX-4T-3-MFGF21,对其进行可溶性表达后成功纯化出GST-MFGF21,经Western-blotting鉴定为目的蛋白。结论:成功构建pGEX-4T-3-MFGF21,得到纯化的GST-MFGF21蛋白。     

山羊Klf4基因克隆、原核表达和His-Klf4融合蛋白纯化北大核心CSCD

旨在克隆山羊Klf4基因,构建重组质粒pET30a-Klf4,通过原核表达技术获得纯化的His-Klf4融合蛋白。从山羊的生殖脊中提取总RNA,用RT-PCR的方法扩增Klf4基因编码区序列,通过TA克隆构建pMD18-T-Klf4重组质粒。酶切鉴定与测序分析后将Klf4的cDNA亚克隆至pET-30a载体,构建重组质粒pET30a-Klf4。酶切鉴定后将其导入大肠杆菌BL21中,用IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blotting检测确认,镍离子金属螯合亲和层析法纯化His-Klf4融合蛋白。结果表明:(1)从山羊生殖脊中克隆了Klf4基因,其开放阅读框由1 434个核苷酸组成,编码478个氨基酸,而且该序列与绵羊的同源性最高,达到98.5%;(2)经过SignalP 4.0在线分析,Klf4的编码蛋白不存在信号肽;(3)经SDS-PAGE和Western blotting分析表明,重组质粒pET30a-Klf4在大肠杆菌中得以表达;在变性条件下纯化,获得了His-Klf4融合蛋白。     

雪莲类PEBP基因在大肠杆菌中的表达及鉴定

本实验旨在构建雪莲类PEBP基因原核表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化类PEBP基因所编码的蛋白,为进一步研究奠定基础.将雪莲类PEBP基因开放阅读框序列克隆到原核表达载体pET30( )上,转化感受态表达菌株BL21(DE3),低浓度IPTG低温诱导融合蛋白的表达,纯化产物,Western blotting鉴定目的蛋白.IFTG低诱导PEBP,经SDS-PAGE分析,其相对分子量约为28 kD,与预期相符,表达量约占菌体蛋白的26.8%,并且通过亲和层析纯化了重组融合蛋白,Western blotting鉴定为阳性.成功构建了原核表达载体pET-PEBP,获得了高效表达产物,并为进一步研究雪莲类PEBP基因的抗冻功能打下基础.     

GST-HRB融合蛋白的表达与纯化

构建GST-HRB重组质粒,进行融合蛋白的表达、纯化及鉴定.利用PCR扩增及基因重组技术,以pcDNA-3.1-HRB为模板扩增出HRB全基因序列,并将其插入带有GST(谷胱甘肽巯基转移酶)标签的原核表达载体pGEX-6P-1中,构建GST-HRB融合蛋白表达质粒.然后,将重组质粒GST-HRB转化至大肠杆菌Rosseta进行融合蛋白的表达.利用GST琼脂糖珠进行融合蛋白的纯化,最后应用SDS-PAGE电泳和Western blotting鉴定纯化的融合蛋白.结果表明,成功构建pGEX-6P-1-HRB原核表达载体,表达及纯化了GST-HRB融合蛋白.     

结核杆菌DnaA蛋白在耻垢分枝杆菌中的同源表达

目的：在耻垢分枝杆菌中表达重组结核杆菌DnaA蛋白并对表达产物进行鉴定。方法：用PCR的方法扩增结核杆菌dnaA基因并克隆至表达载体pMF406中,构建重组大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒pMF-dnaA。经双酶切及测序鉴定后,用电转化的方法将重组质粒转至耻垢分枝杆菌mc2155中。用0.02%乙酰胺诱导重组耻垢分枝杆菌,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blotting检测和鉴定。结果：重组耻垢分枝杆菌构建成功,SDS-PAGE及Western blotting结果显示该重组耻垢杆菌可以实现结核杆菌DnaA蛋白的同源高效表达。结论：结核杆菌DnaA蛋白的同源表达为结核杆菌DNA复制机制的研究奠定了基础。     

拟南芥转录因子NF-YC的原核表达及多克隆抗体制备

采用PCR方法扩增NF-YC基因得到其全长cDNA序列,并将其克隆至原核表达载体pET-48b中,在大肠杆菌BL21中用IPTG诱导出分子量约为45 kD的融合蛋白,SDS-PAGE和Western blotting检测鉴定表达产物。利用亲和层析技术对融合蛋白进行纯化,纯化后的目的蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体。间接ELISA检测抗体效价大于1 62 500,Western blotting结果显示,该抗体可特异性识别NF-YC蛋白。     

细粒棘球蚴FABP基因的原核表达及蛋白鉴定

构建原核表达载体pET-FABP,优化表达条件,采用免疫学方法鉴定纯化的FABP融合蛋白。载体pMD19-T-FABP和pET-44a(+)经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切,将回收的FABP片段与pET-44a(+)连接,构建原核表达载体pET-FABP并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,优化表达条件,纯化FABP融合蛋白,Western blotting鉴定。成功构建了原核表达载体pET-FABP并在大肠杆菌中高效表达。纯化后的蛋白经SDS-PAGE和Western blotting鉴定正确。构建的表达载体pET-FABP可以在大肠杆菌中大量表达Nus-FABP融合蛋白,为进一步研制FABP亚单位疫苗奠定了基础。     

人巨细胞病毒编码蛋白pUL23在E.coli BL21(DE3)中的表达和纯化

大肠杆菌中高效表达携带组氨酸标签的人巨细胞病毒皮层蛋白pUL23,并进行纯化以及鉴定.提取感染HCMV Towne病毒株的HFF细胞的总RNA,逆转录为cDNA作为模板,经PCR获得UL23的基因片段,将此片段插入表达载体pET-28a(+),构建pET28a(+)-UL23重组质粒.将pET28a(+)-UL23转化至大肠杆菌BL21( DE3),进行IPTG诱导表达.表达产物经Western blotting分析后进行发酵,再用Ni sepharose亲和层析纯化,纯化产物进行SDS-PAGE和Western blotting检测.结果表明,成功构建pET28a(+)-UL23原核表达载体,表达及纯化了His-pUL23融合蛋白.为进一步研究pUL23奠定基础.     

内生多粘芽孢杆菌EJS-3纤溶酶基因在毕赤氏酵母中的表达

以自构建的重组质粒pET-DsbA/PPFE-I为模板,扩增内生多粘芽孢杆菌纤溶酶基因PPFE-I,构建Pichia pastoris表达载体pPICZαA/PPFE-I,通过电击转化,pPICZαA/PPFE-I 被整合到Pichia pastoris SMD1168基因组中,抗性筛选得到的阳性转化子,用终浓度为1%甲醇诱导72 h,酶活达到286 IU/ml,是野生菌的2.6倍,表达产物用SDS-PAGE进行分析,在相对分子质量63 kDa处出现明显的蛋白条带,降解人血纤维蛋白试验中rPPFE-I最先降解人血纤维蛋白原的α链,其次是β链,而对γ链降解最缓慢。实现了多粘类芽孢杆菌纤溶酶基因在毕赤酵母中的表达,为植物内生菌来源溶栓药物的开发提供了新的途径。     

豆豉纤溶酶基因在大肠杆菌中的可溶性表达及纯化(英文)

豆豉纤溶酶是从豆豉中发现的新型纤溶酶.从枯草杆菌DC-12中提取总DNA,PCR法扩增pro-DFE基因.将pro-DFE基因插入载体pET-32a,构建表达质粒pET-pro-DFE,转化大肠杆菌BL21(DE3),对重组菌株进行变温诱导表达,重组菌株于37℃培养至OD600为0.6时,加入终浓度为0.4mmol/L的IPTG于24℃进行诱导,SDS-PAGE显示可溶性重组融合蛋白约占重组蛋白的60%.且少量融合重组蛋白发生自切割,形成成熟的豆豉纤溶酶,破菌上清中含有成熟的豆豉溶栓酶,纤溶活性为200IU/mL.重组酶经纯化后比酶活为1280IU/mg.     

3α-羟类固醇脱氢酶基因的质粒载体构建和表达

目的 实现3α-羟类固醇脱氢酶基因在大肠埃希菌中的高可溶性表达.方法 从土壤中分离睾丸酮丛毛单胞菌,提取其基因组DNA,PCR扩增3α-羟类固醇脱氢酶(3α-HSD)基因,将它克隆到原核表达载体上进行诱导表达.提取细菌总蛋白进行SDS-PAGE分析并测定酶活性.结果 经核苷酸序列测定和酶切鉴定结果表明,成功地构建了重组质粒,IPTG诱导表达后,获得融合蛋白,SDS-PAGE初步测定目的蛋白的相对分子量约为29kDa,与预期理论值一致;酶活性测定结果表明菌体可溶性总蛋白HSD酶比活性为142.81 U/mg,是对照BL21的12.97倍.结论 该研究成功地构建了3α-羟类固醇脱氢酶基因高效原核表达系统,为利用基因工程手段大量制备3α-HSD的工作奠定了基础.     

The DEXH protein product of the DHX36 gene is the major source of tetramolecular quadruplex G4-DNA resolving activity in HeLa cell lysates

G4-DNA is a highly stable alternative DNA structure that can form spontaneously in guanine-rich regions of single-stranded DNA under physiological conditions. Since a number of biological processes create such single-stranded regions, G4-DNA occurrence must be regulated. To date, resolution of tetramolecular G4-DNA into single strands (G4-resolvase activity) has been observed only in recombinant RecQ DNA helicases. We previously reported that human cell lysates possess tetramolecular G4-DNA resolving activity (Harrington, C., Lan, Y., and Akman, S. (1997) J. Biol Chem. 272, 24631-24636). Here we report the first complete purification of a major non-RecQ, NTP-dependent G4-DNA resolving enzyme from human cell lysates. This enzyme is identified as the DEXH helicase product of gene DHX36 (also known as RHAU). G4-DNA resolving activity was captured from HeLa cell lysates on G4-DNA affinity beads and further purified by gel filtration chromatography. The DHX36 gene product was identified by mass spectrometric sequencing of a tryptic digest from the protein band on SDS-PAGE associated with activity. DHX36 was cloned within a His(6)-tagging vector, expressed, and purified from Escherichia coli. Inhibition and substrate resolution assays showed that recombinant DHX36 protein displayed robust, highly specific G4-DNA resolving activity. Immunodepletion of HeLa lysates by a monoclonal antibody to the DHX36 product removed ca. 77% of the enzyme from lysates and reduced G4-DNA resolving activity to 46.0 +/- 0.4% of control, demonstrating that DHX36 protein is responsible for the majority of tetramolecular G4-DNA resolvase activity.     

重组鲁西黄牛α干扰素融合蛋白的表达及其抗病毒活性研究

通过PCR从鲁西黄牛(Yellowcattle)基因组DNA中克隆了α干扰素(BoIFN-α)基因,并插入到pET32a 中,构建成重组原核表达质粒pET32a /BoIFN-α,进行测序和诱导表达。测序结果表明,鲁西黄牛IFN-α基因全长498个核苷酸,含一个开放阅读框(ORF),编码166个氨基酸的成熟蛋白,与已报道的牛α干扰素C亚型氨基酸组成同源性为97.6%。表达产物经SDS-PAGE分析,表达出40kD的融合蛋白,表达量占菌体总蛋白的26.7%。表达产物经镍离子螯合次氨基三乙酸(Ni-NTA)亲和层析纯化,纯化产物进行复性后在MDBK/VSV上的活性为5×105u/mg。重组牛IFN-α(rBoIFN-α)对牛轮状病毒(BRV)有一定的抑制作用,抗BRV病毒活性为1.5×105u/mg。结果显示从鲁西黄牛中克隆了IFN-α基因的一种新亚型,即BoIFN-αC2,并实现了高效表达,获得了具有较高抗病毒活性的重组干扰素产物,为重组牛干扰素的开发奠定了基础。     

死亡肽基因的合成及在大肠杆菌中的表达

将人工合成的寡核苷酸片段,通过PCR扩增得到死亡肽（thanatin）基因,并将其克隆到表达载体pGEX-3X中,序列分析结果正确。经IPTG诱导,在大肠杆菌BL21中进行高效可溶性表达,表达量可达20%以上。融合蛋白通过GST亲和层析纯化,用肠激酶酶解表达产物,用Sephadex G-25初步纯化得到具有抗菌活性的死亡肽。     

重组高原鼠兔瘦素原核表达载体的构建、蛋白表达及纯化

瘦素(leptin)由ob 基因编码,对调节能量代谢起着重要作用。本研究建立了高原鼠兔瘦素的原核表达系统,并对其进行了原核表达。研究中作者从高原鼠兔瘦素基因的cDNA 文库中,扩增编码高原鼠兔瘦素的核酸序列,并利用DNA 基因重组技术将其克隆到原核表达载体pET30a(+ )中,构建了高原鼠兔瘦素原核表达载体pET30a(+ )/ ppleptin。对目的片段进行测序确认后,将其转化到大肠杆菌BL21 中,并利用IPTG 诱导外源性目的蛋白表达。表达的包涵体蛋白经溶解及变性后上柱纯化。重组质粒经测序检测后,表明原核载体构建正确。同时,SDS - PAGE 凝胶电泳结果显示,重组菌在16KD 处有明显新增条带,纯化后的目的蛋白条带纯度较高。该结果为高原鼠兔瘦素的后续基础研究提供了基础资料。     

蚯蚓纤溶酶基因(Efp-Ⅰ)在大肠杆菌中的克隆、表达及活性分析

从GenBank查询到的蚯蚓纤溶酶(earthworm fibrinolyti cenzyme,EFE)基因序列中,只有AY438624翻译的蛋白质序列与天然EfP-Ⅰ在N-端具有较高的相似性。根据该基因的5′与3′序列设计引物,通过RT-PCR从赤子爱胜蚓(Eisenia fetida)获得一个完整的基因(GenBank,DQ418454)。序列分析证明,由该基因编码蛋白质的N-末端与天然EfP-Ⅰ的N-末端的氨基酸顺序完全相同。ScanProsite prediction programs分析显示,该基因与AY438624相似性极高,二者均属于胰蛋白酶家族;不同的是,该基因编码蛋白质的序列中含有N-糖苷键的结构域,所以DQ418454是EfP-Ⅰ中的一个新基因。在此基础上,构建了该基因的原核表达载体pMAL-c2X-Efp-Ⅰ,并进行了转化、诱导和表达。Western blotting证明,表达产物同时具有MBP和EfP-Ⅰ的抗原特异性,是MBP和EfP-Ⅰ的融合蛋白(MBP-EfP-Ⅰ)。经亲和层析分离纯化的MBP-EfP-Ⅰ,在酪蛋白平板和纤维蛋白平板上表现出明显的纤溶酶活性。     

Identification and characterization of a novel bacterial sulfite oxidase with no heme binding domain from Deinococcus radiodurans

An open reading frame (draSO) encoding a putative sulfite oxidase (SO) was identified in the sequence of chromosome II of Deinococcus radiodurans; the predicted gene product showed significant amino acid sequence homology to several bacterial and eukaryotic SOs, such as the biochemically and structurally characterized enzyme from Arabidopsis thaliana. Cloning of the Deinococcus SO gene was performed by PCR amplification from the bacterial genomic DNA, and heterologous gene expression of a histidine-tagged polypeptide was obtained in a molybdopterin-overproducing strain of Escherichia coli. The recombinant protein was purified to homogeneity by nickel chelating affinity chromatography, and its main kinetic and chemical physical parameters were determined. Northern blot and enzyme activity analyses indicated that draSO gene expression is constitutive in D. radiodurans and that there is no increase upon exposure to thiosulfate and/or molybdenum(II).     

Cloning of phosphatase I gene from a psychrophile, Shewanella sp., and some properties of the recombinant enzyme

Psychrophilic phosphatase I from Shewanella sp. is a cold enzyme that was found as a novel protein-tyrosine-phosphatase (PTPase, EC 3. 1.3.48) with a histidine as its catalytic residue [Tsuruta and Aizono (1999) J. Biochem. 125, 690-695]. Here, we determined the nucleotide sequence of a DNA fragment (2,004 bp) containing the phosphatase I gene by cloning with polymerase chain reaction (PCR) and inverted PCR techniques. The deduced amino acid sequence, of the enzyme contained a conserved region of protein-serine/threonine-phosphatase (PPase). The 38.5 kDa-recombinant protein expressed in Escherichia coli was purified to homogeneity by glutathione-Sepharose 4B column chromatography, treatment with endoproteinase and Mono-Q column chromatography. The recombinant enzyme had a specific activity of 49.4 units and, like native psychrophilic phosphatase I, exhibited high catalytic activity at low temperature and PTPase activity.