云南传统发酵豆豉中高产豆豉纤溶酶菌株的筛选及其酶谱分析

从云南昆明、元阳、玉溪、昭通地区采集豆豉样品26个,通过琼脂-纤维蛋白平板试验,SDS-fibrin-PAGE蛋白电泳结合Zymography活性染色对相应酶谱进行分析;同时采用茚三酮法测定其豆豉纤溶酶活性,筛选得到5株豆豉纤溶酶活性较高的菌株,其中尤以ZT-13茵株纤溶酶活性达到97.09 U/mL,是工业化生产豆豉纤溶酶的潜在优良菌株.     

内生多粘类芽胞杆菌纤溶酶基因PPFE-Ⅰ在大肠杆菌中融合表达及活性分析

以内生多粘类芽胞杆菌EJS-3基因组DNA为模板,PCR扩增PPFE-Ⅰ基因,并克隆到pMD19-T载体上,构建克隆载体pMD-PPFE-Ⅰ,经测序正确后,将PPFE-Ⅰ基因克隆至表达载体pET-DsbA上构建重组表达质粒pET-DsbA/PPFE-Ⅰ,将其转化至E.coli BL21(DE3),在IPTG诱导下实现了融合蛋白DsbA-PPFE-Ⅰ的表达,表达产物酶活性达228 IU/mL.表达产物用SDS-PAGE和Western blotting进行鉴定.SDS-PAGE电泳检测表明融合蛋白主要以可溶形式表达,占菌体总蛋白的18.4%.Western blotting结果表明在相应分子量处有一条特异性条带,证实该蛋白为DsbA-PPFE-Ⅰ融合蛋白.表达产物通过Ni亲和柱、凝血酶酶切及Scphadex G-100等步骤进行分离纯化,并用MALDI-TOF质谱对重组酶进行了鉴定.纯化后的表达产物在纤维蛋白平板上表现出明显的纤溶活性.     

内生多粘类芽胞杆菌纤溶酶基因PPFE-I在大肠杆菌中融合表达及活性分析

以内生多粘类芽胞杆菌EJS-3基因组DNA为模板,PCR扩增PPFE-I基因,并克隆到pMD19-T载体上,构建克隆载体pMD-PPFE-I,经测序正确后,将PPFE-I基因克隆至表达载体pET-DsbA上构建重组表达质粒pET-DsbA/PPFE-I,将其转化至E. coli BL21(DE3),在IPTG诱导下实现了融合蛋白DsbA-PPFE-I的表达,表达产物酶活性达228 IU/mL。表达产物用SDS-PAGE和Western blotting进行鉴定。SDS-PAGE电泳检测表明融合蛋白主要以可溶形式表达,占菌体总蛋白的18.4％。Western blotting结果表明在相应分子量处有一条特异性条带,证实该蛋白为DsbA-PPFE-I融合蛋白。表达产物通过Ni亲和柱、凝血酶酶切及Sephadex G-100等步骤进行分离纯化,并用 MALDI-TOF 质谱对重组酶进行了鉴定。纯化后的表达产物在纤维蛋白平板上表现出明显的纤溶活性。     

响应面法优化解淀粉芽孢杆菌发酵产豆豉纤溶酶的工艺条件

纤溶酶是指能专一降解纤维蛋白凝胶的蛋白水解酶,可用于治疗脑梗死、高凝血状态及血栓性脉管炎等外周血管疾病。解淀粉芽孢杆菌JXNUWX-1是一株从豆豉中分离得到的高产纤溶酶菌株,并保存于中国典型培养物保藏中心(CCTCC No.M2014638)。本研究利用单因素试验和响应曲面法对JXNUWX-1菌株产纤溶酶的发酵条件进行了优化。在单因素试验的基础上通过Design-Expert软件对玉米淀粉、牛肉粉、初始p H这三个较显著的因素进行响应面试验设计,最终获得最佳发酵条件为:玉米淀粉浓度为2.91%,牛肉粉的浓度为1.76%,最适p H为7.47,在此条件下,酶活力为346.62 IU/m L,较优化前纤溶酶活力提高了8.9倍。本研究为解淀粉芽孢杆菌JXNUWX-1大规模生产纤溶酶提供理论依据。     

内生多粘芽孢杆菌EJS-3纤溶酶基因在毕赤氏酵母中的表达

以自构建的重组质粒pET-DsbA/PPFE-I为模板,扩增内生多粘芽孢杆菌纤溶酶基因PPFE-I,构建Pichia pastoris表达载体pPICZαA/PPFE-I,通过电击转化,pPICZαA/PPFE-I 被整合到Pichia pastoris SMD1168基因组中,抗性筛选得到的阳性转化子,用终浓度为1%甲醇诱导72 h,酶活达到286 IU/ml,是野生菌的2.6倍,表达产物用SDS-PAGE进行分析,在相对分子质量63 kDa处出现明显的蛋白条带,降解人血纤维蛋白试验中rPPFE-I最先降解人血纤维蛋白原的α链,其次是β链,而对γ链降解最缓慢。实现了多粘类芽孢杆菌纤溶酶基因在毕赤酵母中的表达,为植物内生菌来源溶栓药物的开发提供了新的途径。     

棉花咖啡酸-O-甲基转移酶基因的原核表达及蛋白纯化鉴定

为获得大量高纯度的GhCOMT2蛋白以便研究其功能和性质,以pMD18-GhCOMT2质粒为模板,PCR扩增GhCOMT2基因的cDNA编码区,构建原核表达载体pET-28a-GhCOMT2,经酶切鉴定并测序后转化到大肠杆菌BL21 (DE3)中进行诱导表达,并采用Western blotting方法鉴定表达产物.结果表明:在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中成功表达了与标签蛋白融合的GhCOMT2蛋白,大小约为40.062 kD,浓度为0.62 mg/mL.重组蛋白的最佳诱导条件为:0.2 mmol/L IPTG在16℃诱导12 h.重组蛋白以可溶形式高效表达,用蛋白标签亲和层析柱(His TrapTM HP)获得纯化重组蛋白,Western blotting分析表明其能与His多克隆抗体起特异性反应.     

重组纤溶酶原激活剂抑制剂－2基因在HT1080亚克隆中的表达

重组纤溶酶原激活剂抑制剂－２基因在ＨＴ１０８０亚克隆中的表达曹祥荣（南京师范大学生物学系,２１００２４）关键词纤溶酶原激活剂,基因重组,纤溶酶原激活剂抑制剂活性表达目前认为纤溶酶系统是肿瘤细胞浸润和转移蛋白水解过程中重要的酶,纤溶酶能直接水解细胞外间...     

枯草杆菌DC-2纳豆激酶基因的克隆及其融合蛋白在E.coli中的表达

纳豆激酶是一种纤维蛋白溶解酶 ,有望开发成为新型的溶栓药物 .从中国豆豉中分离的具有较强纤溶活性的枯草杆菌DC 2中提取总DNA ,根据纳豆激酶 (NK)基因序列设计引物 ,用PCR法扩增NK基因 .序列分析表明 ,NK基因成熟肽编码区含有 82 5bp ,编码 2 75个氨基酸残基 ,与文献报道的序列分别有 93 4 %和 94 5 %同源性 .将NK基因插入载体pGEX 4T1构建表达质粒pGEX NK ,转化大肠杆菌JM10 9后 ,经 1mmol LIPTG诱导 4h ,发现大量NK融合蛋白表达 ,并形成包涵体 .SDS PAGE分析表明 ,NK融合蛋白作为包涵体的分子量为 5 3kD .凝胶自动扫描结果显示 ,NK融合蛋白约占菌体可溶性蛋白的 2 6 % .     

Pfu酶原核的高效表达及其活性分析

目的:在大肠杆菌中高效表达重组Pfu酶.方法:将pfu基因构建于载体pET28a上,重组质粒pET28a-pfu转化DH5α,获得了含pET28a-pfu重组表达菌株.在重组菌株OD600为0.2时,经终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导表达10～12 h后,菌体超声波破壁后,80℃条件下热变性30 min去除部分杂蛋白;粗酶液再经Ni离子亲和层析进一步纯化.结果:获得了高纯度的重组Pfu酶,利用该酶成功扩增出目的基因片段.结论:纯化的Pfu酶具有较高的活性,比活性为62 500 U/mg,该研究表达的重组酶完全可以替代商用Pfu酶.     

尿激酶原-RGDS双功能分子——构建、表达及性质研究

利用定点突变及DNA重组技术 ,构建了在尿激酶原K区C 端的β 发夹区插入了精氨酸 甘氨酸 天冬氨酸 丝氨酸 (RGDS)片段的尿激酶原嵌合体基因 ,并利用昆虫杆状病毒表达系统通过感染Sf9细胞对嵌合体尿激酶原进行了高效表达 .用尿激酶原单抗亲和柱纯化表达产物 ,获得初步纯化的嵌合体蛋白 .对嵌合体蛋白进行血小板膜结合实验表明 ,此嵌合体具有依赖于钙离子的结合活化血小板膜的活性 .用生色底物Chromozym U测定嵌合体的酰胺解活性 ,结果显示 ,纤溶酶激活后的嵌合体比活为 62 0 0 0IU/mg,与文献报道的纤溶酶激活的尿激酶原比活 65 3 5 5IU/mg相近 .纤溶酶激活后的嵌合体激活纤溶酶原的反应符合米氏方程 ,其Km 值为 0 .97μmol/L ,与天然尿激酶的Km 值 1.64μmol/L相近 .嵌合体还显示了较强的体外抑制血小板聚集活性 .这些结果表明 ,此尿激酶原 RGDS嵌合体有可能成为一种新的双功能溶栓药物 .     

豆豉纤溶酶的研究现状

豆豉纤溶酶是从中国传统风味食品豆豉中分离得到的一种由杆菌产生的丝氨酸蛋白酶,具有极强的纤溶活性.综述了豆豉纤溶酶的产生菌种、发酵工艺、酶学性质、分离纯化、作用机理以及分子生物学特性等研究现状.豆豉纤溶酶在溶栓的过程中有着溶栓能力强,无毒副作用,原材料丰富,在体内半衰期长等优点,因此该酶有着广阔的应用发展前景.     

Gene expression and characteristics of a novel fibrinolytic enzyme (subtilisin DFE) in Escherichia coli

AIMS: The objective of this study is to actively express a novel fibrinolytic enzyme, subtilisin DFE (douchi fibrinolytic enzyme), in Escherichia coli. METHODS AND RESULTS: The DNA fragments encoding pro-subtilisin DFE was amplified and cloned into the vector pET32a to obtain N-terminal Trx fusion expression plasmid. The recombinant subtilisin DFE was successfully expressed and processed in the soluble fraction of E. coli BL21(DE3) in a similar fashion as the endogenous one of Bacillus amyloliquefaciens DC-4, resulting in an active enzyme. Moreover, active enzyme can also be refolded from inclusion body. CONCLUSIONS: Active subtilisin DFE can be expressed and processed in E. coli. SIGNIFICANCE AND IMPACT OF THE STUDY: This study provides evidences that subtilisin DFE can be actively expressed in E. coli and the pro-peptide is essential for guiding the proper folding into the active conformation. As such, large quantities of recombinant subtilisin DFE can be produced for pharmacological and clinical research.     

Purification and characterization of a fibrinolytic enzyme produced by Bacillus amyloliquefaciens DC-4 screened from douchi,a traditional Chinese soybean food

Bacillus amyloliquefaciens DC-4, which produces a strongly fibrinolytic enzyme, was isolated from douchi, a traditional Chinese soybean-fermented food. A fibrinolytic enzyme (subtilisin DFE) was purified from the supernatant of B. amyloliquefaciens DC-4 culture broth and displayed thermophilic, hydrophilic and strong fibrinolytic activity. Subtilisin DFE was demonstrated to be homogeneous by SDS-PAGE and isoelectric focusing electrophoresis, and has molecular mass of 28000 Da and a pI of 8.0. The optimal reaction pH value and temperature were 9.0 and 48 degrees C, respectively. Subtilisin DFE not only hydrolyzed fibrin but also several synthetic substrates, particularly Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA, and phenylmethylsulfony fluoride can completely inhibit its fibrinolytic activity. These results indicated that subtilisin DFE is a subtilisin-family serine protease, similar to nattokinase from Bacillus natto. The first 24 amino acid residues of the N-terminal sequence of subtilisin DFE were AQSVPYGVSQIKAPALHSQGFTGS, which is identical to that of subtilisin K-54, and different from that of NK and CK. Results from subtilisin DFE gene sequence analysis showed that subtilisin DFE is a novel fibrinolytic enzyme.     

全基因组重排育种技术提高产豆豉纤溶酶菌产酶量

枯草芽孢杆菌DC-12 是从豆豉里面筛选出来的,具有纤溶酶活性的菌株。本论文采用了全基因组重排技术提高DC－12的产酶量,首先通过对DC－12进行紫外诱变和亚硝酸诱变构建重组突变库,在研究其原生质体制备和再生的基础上,以其中4株诱变菌株作为直接亲本,采用电融合的方法进行两次多亲本的全基因组重排,结合双灭活的筛选方法,共筛选出2株酶活大大提高并能稳定遗传的菌株,使亲本菌株的酶活提高了4~5倍,最高达2710 IU/ml。     

重组黄杆菌肝素酶Ⅲ的纯化、表征及培养条件对酶生产的影响

肝素酶Ⅲ是一种特异性地裂解乙酰肝素的酶,在大肠杆菌中表达时容易形成包涵体.为实现肝素酶Ⅲ的可溶性表达,利用谷胱甘肽-S-转移酶(GST)与肝素酶Ⅲ融合性能,通过构建相应的表达质粒pGEX-heparinaseⅢ,在大肠杆菌中实现了肝素酶Ⅲ的可溶性表达.粗酶通过一步亲和纯化其纯度可达95%以上.通过对LB培养基摇瓶培养Escherichia coli BL21的诱导时机,诱导剂用量、诱导时间等培养条件的优化,确定了该可溶性肝素酶Ⅲ融合蛋白的最适生产条件.通过对纯酶的最适反应温度、pH、Ca~(2+)浓度等一系列性质研究,确定了该酶的最适反应条件.     

bla_(TEM-116)型超广谱β-内酰胺酶的表达、纯化及其应用

为大量获取低成本的TEM-116超广谱β-内酰胺酶,并分析其降解环境中β-内酰胺类抗生素残留物的可行性,本研究在Escherichia coli BL21(DE3)菌株中表达了重组TEM-116超广谱β-内酰胺酶,经亲和层析纯化、柱复性与分子筛层析纯化,得到了高纯度的目的蛋白,对其理化性质进行了分析。结果表明,重组TEM-116超广谱β-内酰胺酶的分子量、比活性分别为30kDa和476IU/mg,与天然酶性质相近。重组酶在体内外对多种青霉素、头孢菌素类药物均具有较高降解效率:10IU酶可清除1L发酵液中7000mg的青霉素G;320IU酶可清除1L尿液中各200mg的青霉素G、氨苄青霉素和头孢唑林混合抗生素;1.0～2.5IU的酶可在4℃～37℃温度范围内清除1L牛奶中80U的青霉素G;2.0×104～2.3×104IU/(kg·bw)的酶能够清除小鼠体内8.0×104～9.1×104μg/(kg·bw)的青霉素G。     

S-腺苷甲硫氨酸合成酶的组成型表达、产物纯化及鉴定

将大肠杆菌(E.coli K12) S 腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)基因克隆至质粒pBR322中,获得的重组质粒pBR322-SAMS转入大肠杆菌JM109菌株,构建了能高效组成型表达SAMS的重组菌E.coli JM109 (pBR322-SAMS)。将重组大肠杆菌破碎后上清液经20%~40%硫酸铵分级盐析、Phenyl-Sepharose Fast Flow疏水层析和Q Sepharose Fast Flow离子交换层析,即可得到纯度提高5倍,比活为48.7 μ/mg的SAMS,三步纯化的总回收率为62%,纯度达到92%。SAMS表达量为1 176μ/L,占到菌体可溶性总蛋白的20%。重组酶的最适反应pH为8.5,4℃下在pH 7.5的缓冲液中保温10h酶活性几乎不改变。重组酶反应的最适温度为55℃ ,酶活性稳定的温度范围为20~35℃。重组酶的KmL Met为0.22mmol/L,Vmax L-Met为1.07mmol/(L·h),Km ATP为0.52 mmol/L,Vmax ATP为1.05 mmol/( L·h)。     

Highly efficient gene expression of a fibrinolytic enzyme (subtilisin DFE) in Bacillus subtilis mediated by the promoter of α-amylase gene from Bacillus amyloliquefaciens

Subtilisin DFE is a fibrinolytic enzyme produced by Bacillus amyloliquefaciens DC-4. The promoter and signal peptide-coding sequence of alpha-amylase gene from B. amyloliquefaciens was cloned and fused to the sequence coding for pro-peptide and mature peptide of subtilisin DFE. This hybrid gene was inserted into the Escherichia coli/Bacillus subtilis shuttle plasmid vector, pSUGV4. Recombinant subtilisin DFE gene was successfully expressed in B. subtilis WB600 with a fibrinolytic activity of 200 urokinase units ml(-1).