应用A蛋白亲和层析法纯化单克隆抗体

应用Protein A亲和层析法,从采集的小鼠腹水中纯化出了抗凝血因子Ⅶ单克隆抗体,用SDS-PAGE和ELISA法分别检测了纯化后单克隆抗体的纯度及效价,结果显示,电泳为两条带,分别为免疫球蛋白G(IgG)的重链和轻链,纯化后的单克隆抗体纯度达到电泳纯,应用间接ELISA法测定腹水效价为1×10-7左右,与未纯化前无差异。结果表明,应用A蛋白亲和层析法能够得到纯度较高的单克隆抗体,适用于高纯度单克隆抗体的制备。     

高亲和力克伦特罗单克隆抗体的研制及免疫试纸检测方法的建立

重氮化法将克伦特罗（CL）偶联于BSA合成免疫抗原BSA-CL,戊二醛法（GA）合成包被抗原OVA-CL,用BSA-CL免疫Balb／C小鼠。细胞融合技术建立高亲和力CL单克隆抗体（CL mAb）杂交瘤细胞株,体内诱生腹水法制备CL mAb,并测定其亲和性。依据胶体金免疫层析试验（GICA）原理,应用CL mAb研制CL残留快速检测免疫试纸（CL-Srip）,并测定其性能。结果表明,筛选出16株杂交瘤细胞,其中亲和力最高的为3C12—6H6,亲和常数（Ka）为1．76×10^10L／mol。CL-Strip的标准曲线呈典型的S型,符合4参数logit曲线拟合,目测检测限为0．5μg／L;其敏感性与竞争ELISA试剂盒和GC／MS相当,符合率为100％。CL-Strip具有具有敏感、特异、快速、简便的特点,可推广应用于CL残留的快速检测。     

消减免疫法制备克伦特罗单克隆抗体

目的：制备克伦特罗（CL）单克隆抗体。方法：重氮化法制备克伦特罗完全抗原,消减免疫法免疫BALB／c小鼠,常规杂交瘤技术制备抗克伦特罗单克隆抗体。结果：消减免疫法使小鼠获得了对BSA的耐受,单抗筛选过程中获得了高达8．2％的阳性率。最后得到了针对CL的特异性抗体。结论：用消减免疫法制备针对小分子污染物的单克隆抗体,可减少在制备单克隆抗体时筛选的工作量,可增加获得预期抗体的机会。     

H5亚型禽流感病毒单抗-生物素捕获ELISA的建立

目的建立一种单克隆抗体介导的、经生物素—亲和素系统放大的H5亚型禽流感病毒捕获ELISA检测方法,为进一步研究检测试剂盒提供基础。方法用亲和层析法纯化抗禽流感病毒H5亚型血凝素单克隆抗体,包被微量反应板,用于捕获病毒抗原,再用生物素标记的单抗和酶标亲和素来检测病毒血凝素抗原,经方阵试验优化ELISA反应体系。用该方法检测H1—H15亚型AIV标准毒株和H5、H7、H9亚型AIV分离株,并与血凝和血凝抑制试验比较,评价其敏感性和特异性。结果纯化后的单抗具有良好的反应活性,生物素标记单抗工作浓度为1∶5000;ELISA对H5亚型AIV的检出限为025个血凝单位。该ELISA反应体系能检出H5N3标准株和所有20株国内H5亚型AIV分离株,而与其他14个血凝素亚型的AIV标准株、15个H9亚型AIV分离株和2个H7亚型AIV分离株均无交叉反应。结论初步建立了检测H5亚型禽流感病毒的单抗—生物素捕获ELISA方法,为研制试剂盒和进一步应用试验提供了基础。     

应用HTS-ELISA筛选方法制备抗黄曲霉毒素M1单抗

摘要：【目的】 确立基于高通量酶联免疫（HTS-ELISA）筛选方法制备高亲和力抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体的方法体系。【方法】 采用AFM1-BSA （Aflatoxin M1-bovine serum albumin）免疫Balb/C小鼠,利用HTS-ELISA方法筛选分泌抗黄曲霉毒素 M1单抗的杂交瘤细胞株,并分析抗体的特性。【结果】筛选到14株具有分泌高活性抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体的杂交瘤细胞株,纯化的最佳抗体的亲和力为5.5×10-10 mol/L。与黄曲霉毒素M1及其结构类似物黄曲霉毒素M2、B1、B2、G1、G2以及其他物质脱氧雪腐镰刀菌烯醇和BSA的交叉反应率分别为100%、4.5%、21.5%、1.0%、16.6%、1.0%、0%、0%。间接竞争ELISA检测最低检测限可达0.01 μg/L,线性范围为0.1-10 μg/L,竞争性抑制抗体反应50%的抑制浓度IC50为0.82 μg/L,添加0.25-5 μg/L黄曲霉毒素的牛奶间接竞争ELISA检测回收率在60.3%-152.8之间。【结论】HTS-ELISA方法可以制备具有高亲和力的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体,可为黄曲霉毒素M1免疫检测体系的建立提供优质抗体材料。     

肌酸激酶同工酶MB(CK-MB)单克隆抗体制备及检测方法的建立

该文通过制备出特异性高的单克隆抗体,初步建立了双抗夹心ELISA定量测定CK-MB的方法,为CK-MB试剂和原料的国产化奠定重要的基础。以购入的CK-MB抗原为免疫原,对随机选取的5只6～8周龄Balb/c健康雌性小鼠进行免疫。采用有限稀释法、间接ELISA、捕获ELISA方法,最终筛选出了3株能够稳定分泌抗体的细胞株,分别命名为2F6、2H3和2H9,其分泌的单克隆抗体亚型均为IgG3,腹水效价分别为1:102000、1:51200和1:102000。采用亲和层析法对3株杂交瘤细胞产生的小鼠腹水进行纯化,分光光度计测定纯化后的单克隆抗体2H3、2F6、2H9的浓度分别为5 mg/mL、6 mg/mL、6 mg/mL, SDS-PAGE结果表明,成功纯化了小鼠腹水,能够清晰地观察到轻链和重链两条带。Western blot结果表明,单克隆抗体2F6、2H3和2H9均能特异性识别CK-MB蛋白。间接ELISA及捕获ELISA方法检测显示,单克隆抗体2H3只与CK-MB及CK-BB发生捕获ELISA方法反应;单克隆抗体2H9只与CK-MB及CK-BB发生捕获ELISA方法反应;单克隆抗体2F6只与CK-MB及CK-MM发生捕获ELISA方法反应。稳定性实验表明, 3株杂交瘤细胞都能稳定分泌抗CK-MB单克隆抗体。高质量单克隆抗体的获得,为建立CK-MB检测方法奠定了基础。     

群特异性蓝舌病病毒单克隆抗体的制备和鉴定

目的：制备群特异性抗蓝舌病病毒（BTV）单克隆抗体,并对其特性进行鉴定,为建立检测BTV抗原及抗体的ELISA方法奠定基础。方法：用纯化的BTV颗粒为免疫抗原免疫BALB/c鼠,以大肠杆菌表达的VP7蛋白作为筛选抗原,用间接ELISA法筛选杂交瘤细胞株;选取抗体效价最高的一株制备BTV单克隆抗体,以该抗体为捕获抗体与8种不同血清型BTV进行ELISA反应,结果与细胞病变反应进行比对;以该抗体为竞争抗体,与12种不同血清型绵羊BTV抗血清进行竞争ELISA反应,并将结果与参比c-ELISA试剂盒结果进行比对。结果：筛选出5株稳定分泌BTV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并选其中一株（3E2）制备了高纯度的单克隆抗体;该单抗用于检测不同血清型BTV,与细胞病变反应结果完全相符;用于检测不同血清型绵羊BTV抗血清,其结果与参比c-ELISA试剂盒符合率为100%,与鹿流行性出血热病毒抗原和抗体均无交叉反应。结论：制备的BTV单克隆抗体具有良好的群特异性,可用于检测不同血清型BTV抗原及BTV抗体。     

抗微囊藻毒素单克隆抗体的制备与鉴定

构建了微囊藻毒素(Microcystin-LR , MC-LR)完全免疫原 MCLR-KLH, 免疫 BALB／ c 小鼠 , 采用杂交瘤技术制备抗 MCLR 单克隆抗体, 用间接竞争 ELISA 方法筛选抗体。经过 3 次克隆, 获得 2 株可稳定分泌抗 MCLR 单克隆抗体的杂交瘤细胞株, 腹水效价达 1:8×104; IC50 为 0.81 ng⋅mL−1, 最低检测限 0.10 ng⋅mL−1, 亲和常数 3.8×108 L⋅mol−1,电泳结果显示抗体由 1 条重链和 1 条轻链组成, 与 MC-LR 同系物 MC-RR、 MC-YR 有较强的交叉反应, 与 MC-LW 有弱交叉性反应, 与河豚毒素无交叉反应。实验结果表明该抗体质量较好, 将在微囊藻毒素的快速检测、产生机理等方面具有较大的科研和应用价值。     

牛血清白蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及鉴定

用牛血清白蛋白(BSA)免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,培养上清经过双抗体夹心法检测初步筛选分泌鼠IgG的杂交瘤细胞,将此种杂交瘤细胞注射小鼠产生的腹水用间接ELISA法筛选,获得4株能稳定分泌抗BSA单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为2A5、3A3、3G6、4A8。鉴定结果显示,2A5细胞分泌IgG2a/κ,其余3株细胞分泌IgG1/κ;纯化后4株腹水单抗的纯度达90%以上,对BSA的ELISA滴度均可达到1∶100000以上;4株单抗均不与人以及马、猪、羊、兔、豚鼠等血清发生交叉反应;W estern B lotting试验证明4株单抗均识别分子量为68000的BSA;用间接ELISA法测定4株单抗相对亲和力及相对敏感度大小依次为3A3>2A5>3G6>4A8;杂交瘤细胞株连续培养3个月以及冻存半年后复苏,细胞生长良好,杂交瘤细胞分泌的抗体效价稳定。     

人凝血因子Ⅶ单克隆抗体的制备与鉴定

目的：制备抗人凝血因子Ⅶ单克隆抗体并鉴定其特性。方法：应用杂交瘤融合技术,以重组人凝血因子Ⅶ为抗原免疫BALB／c小鼠;取免疫小鼠的脾细胞与Sp2／0骨髓瘤细胞融合,经间接ELISA法筛选、融合细胞有限稀释法克隆、克隆化杂交瘤细胞株的亚类鉴定等方法筛选出单克隆抗体杂交瘤细胞株,并对单克隆抗体的特异性进行鉴定;用杂交瘤细胞株诱生小鼠腹水,应用蛋白A亲和层析法进行单抗的纯化。结果：获得了3株可稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞3E8、3D2和1C5,诱生的腹水效价分别为1：1×10^7、1：1×10^6和1：1×10^6;亚类鉴定表明388为IgG2a,其余2株均为IgGl;特异性鉴定显示它们与多种血浆蛋白均无交叉反应,表明单抗是特异的;经过亲和层析,获得了纯化的单抗。结论：获得了特异性的人凝血因子Ⅶ单克隆抗体,为建立人凝血因子Ⅶ检测及纯化方法奠定了基础。     

河豚毒素中和性单抗的制备、鉴定及TTX检测方法的建立

目的研制河豚毒素中和性单抗,建立基于河豚毒素单抗的河豚毒素检测方法。方法用TTX-KLH免疫Balb/c小鼠,用TTX-BSA间接ELISA筛选,建立杂交瘤细胞系,腹腔接种Balb/c小鼠诱生腹水,Protein A Sepharose CL4B亲和柱纯化,SDS-PAGE、间接ELISA鉴定;用常规法确定TTX对昆明小鼠的LD50;将单抗和TTX混合物注入小鼠腹腔,检测单抗对TTX的中和能力;建立检测TTX的竞争ELISA法。结果获得了2株TTX中和性单抗,腹水用Protein A Sepharose CL 4B纯化后抗体纯度大于95%;常规间接ELISA检测,显示单抗5E7的结合能力高于5E4。单抗对2 LD50 TTX攻击昆明小鼠的保护率为50%,建立了基于中和性单抗的TTX检测方法,TTX的最小检出浓度为1.56μg/mL。结论获得了TTX中和性单抗,对致死剂量TTX攻击昆明小鼠的保护率为50%,建立了基于中和性单抗的TTX检测方法,TTX的最小检出浓度为1.56μg/mL。     

小鼠神经生长因子直接竞争酶联免疫检测方法的建立

目的:利用小鼠神经生长因子(mNGF)和纯化的兔抗mNGF IgG,建立mNGF直接竞争酶联免疫检测方法。方法:以亲和纯化兔抗mNGF IgG作为包被抗体,封闭、洗涤后加入用稀释液稀释的不同浓度的标准mNGF或样品液和生物素标记的mNGF混合液,于37℃孵育80 min或室温孵育120 min,洗涤后加入辣根过氧化物酶标记的链酶亲和素,洗涤后加入显色液显色,测定D450nm值,通过标准曲线计算待测样品中mNGF含量。结果与结论:建立了mNGF直接竞争酶联免疫检测方法;该方法的灵敏度约20 ng,变异系数为批内≤10%、批间≤15%,回收率为85%～115%;利用该方法检测了3批样品中mNGF的含量。     

Asia I口蹄疫vp2蛋白单克隆抗体的制备及单抗竞争ELISA方法的建立

制备Asia I口蹄疫病毒vp2单克隆抗体(mAb)并建立了单抗竞争ELISA方法。用纯化的Asia I型口蹄疫病毒vp2重组蛋白免疫BALB/c小鼠, 将免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤SP2/0细胞融合, 采用间接ELISA和有限稀释法筛选杂交瘤细胞。分别用ELISA、Western blotting检测mAb腹水的效价及其特异性。筛选到杂交瘤细胞2株, 腹水效价均在100×29以上; 以纯化后的Asia I型口蹄疫病毒vp2重组蛋白作为抗原, 利用Asia I型口蹄疫病毒vp2单抗酶标物建立了竞争ELISA方法用来检测Asia I型口蹄疫抗体。临床应用表明, 该方法与UBI公司的口蹄疫全病毒抗体检测试剂盒总符合率达89.0%, 和荷兰赛迪公司的口蹄疫病毒LPB-ELISA抗体检测试剂盒总符合率达86.5%。     

抗HCMV Pp65蛋白单克隆抗体的制备及性质研究

人类巨细胞病毒（Human cytomegalovirus,HCMV）是一种机会性感染疱疹病毒,在人群中感染比较常见,但在免疫缺陷个体与新生儿中可引起严重的疾病。HCMV Pp65是HCMV活动感染的主要标志,也是临床检验检测HCMV感染的重要靶标。为研发抗HCMV Pp65蛋白单克隆抗体作为临床免疫检测HCMV感染的关键原料,本研究采用重组表达的HCMV Pp65蛋白免疫BALB/c小鼠,将免疫小鼠淋巴结细胞与sp2/0细胞融合,采用间接ELISA法筛选阳性克隆与效价测定,再用Western blotting进行抗体特异性鉴定,最后用免疫捕获PCR和免疫荧光法评价其应用前景。最终获得了1株能稳定分泌高效价的抗HCMV Pp65单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为8D6。Western blotting及间接ELISA检测其效价分别达1∶4 000和1∶105;细胞免疫荧光与免疫捕获PCR实验结果说明,该杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体具有良好的亲和力和特异性,具有作为外周血细胞免疫荧光细胞化学和免疫捕获PCR检测HCMV临床感染的关键原料,也可作为双抗体夹心法检测HCMV临床感染的关键原料,为建立HCMV感染快速灵敏的临床诊断试剂打下了重要的基础。     

麦长管蚜ELISA检测体系的建立

应用麦长管蚜Macrosiphum avenae(Fabricius)单克隆抗体比较直接、间接和夹心ELISA方法。结果表明,间接ELISA的灵敏度高于直接ELISA,灵敏度分别为0.042μg/mL和0.083μg/mL,而双抗夹心ELISA灵敏度很差,无法使用。建立用于检测捕食性瓢虫肠道内麦长管蚜抗原的间接ELISA检测体系,为进一步应用单克隆抗体评价捕食性瓢虫对麦长管蚜的控制作用奠定可靠的基础。     

定量检测猕猴血清中重组人源化抗狂犬病毒单克隆抗体间接ELISA法的建立

目的：建立定量检测血清中重组人源化抗狂犬病毒单克隆抗体（HuMabs）NM57的间接ELISA法,为药代动力学研究提供一种简单快速的方法。方法：采用狂犬病毒糖蛋白包被酶标板、HRP标记的IgG-Fc段为标记抗体,建立定量检测HuMabsNM57的间接ELISA法,并对其特异性、灵敏度、精密度及准确度进行检测。结果：间接ELISA法检测HuMabsNM57的灵敏度为5ng／mL,组内及组间精密度分别为2．6％-6．0％、8．5％-11．3％。结论：建立了灵敏度高、特异性强的检测HuMabs NM57的间接ELISA法,精密度及准确度均符合药代动力学要求,可用于猕猴及人血清中HuMabsNM57的检测。     

Production and characterization of a monoclonal antibody cross-reactive with most group A trichothecenes

A monoclonal antibody cross-reactive with most group A trichothecenes was produced by fusion of P3/NS-1/1-AG4-1 myeloma cells with spleen cells isolated from a BALB/c mouse that had been immunized with 3-acetyl-neosolaniol-hemisuccinate conjugated to bovine serum albumin. One stable clone, H159B1D5, which produced monoclonal antibody that bound with both T-2 toxin and diacetoxyscirpenol (DAS) was obtained after subcloning. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) revealed that the antibody belongs to the immunoglobulin G1 (kappa chain) isotype and had binding constants of 2.81 x 10(9), 1.05 x 10(9), and 1.57 x 10(8) liters per mole for T-2 tetraol tetraacetate, T-2 toxin, and DAS, respectively. The relative cross-reactivities of the antibody with T-2 tetraol tetraacetate, T-2 toxin, and DAS were 200, 100, and 20, respectively, with tritiated T-2 toxin as the marker ligand. The relative cross-reactivities for the above toxins were 667, 100, and 73, respectively, with tritiated DAS as the marker ligand. No cross-reaction with HT-2 and deoxynivalenol triacetate was observed in either system. By using this monoclonal antibody, an indirect ELISA for analysis of T-2 toxin was also developed. The linear portion of the standard curve for analysis of T-2 toxin in each analysis by radioimmunoassay and ELISA was in the range of 0.1 to 2 ng and 0.05 to 1.0 ng, respectively.     

Production and characterization of a monoclonal antibody cross-reactive with most group A trichothecenes.

A monoclonal antibody cross-reactive with most group A trichothecenes was produced by fusion of P3/NS-1/1-AG4-1 myeloma cells with spleen cells isolated from a BALB/c mouse that had been immunized with 3-acetyl-neosolaniol-hemisuccinate conjugated to bovine serum albumin. One stable clone, H159B1D5, which produced monoclonal antibody that bound with both T-2 toxin and diacetoxyscirpenol (DAS) was obtained after subcloning. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) revealed that the antibody belongs to the immunoglobulin G1 (kappa chain) isotype and had binding constants of 2.81 x 10(9), 1.05 x 10(9), and 1.57 x 10(8) liters per mole for T-2 tetraol tetraacetate, T-2 toxin, and DAS, respectively. The relative cross-reactivities of the antibody with T-2 tetraol tetraacetate, T-2 toxin, and DAS were 200, 100, and 20, respectively, with tritiated T-2 toxin as the marker ligand. The relative cross-reactivities for the above toxins were 667, 100, and 73, respectively, with tritiated DAS as the marker ligand. No cross-reaction with HT-2 and deoxynivalenol triacetate was observed in either system. By using this monoclonal antibody, an indirect ELISA for analysis of T-2 toxin was also developed. The linear portion of the standard curve for analysis of T-2 toxin in each analysis by radioimmunoassay and ELISA was in the range of 0.1 to 2 ng and 0.05 to 1.0 ng, respectively.     

A→O血型转变制备通用型红细胞过程中残留a-N-乙酰半乳糖胺酶检测方法的建立

目的：建立一种检测血型转变过程中通用型红细胞及洗涤上清中残留a-N-乙酰半乳糖胺酶的方法。方法：利用a-N-乙酰半乳糖胺酶的特异性兔多抗和抗His的单抗,采用间接ELISA法,建立检测微量a-N-乙酰半乳糖胺酶的方法,并用此方法检测血型转变过程中通用型红细胞及洗涤上清中残留的仅一Ⅳ-乙酰半乳糖胺酶。结果：建立了检测微量a-N-乙酰半乳糖胺酶的方法,该方法的检测下限为1ng／mL;通过对洗涤后的红细胞和洗涤液中残留酶量的检测,确定经过4次洗涤后,残留酶量达到检测水平以下。结论：本方法的建立,为血型转变的通用型红细胞的安全性评价提供了检测方法,并为进一步的临床应用奠定了基础。