小分子G蛋白Rapl shRNA表达载体的构建和鉴定

应用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术抑制Rapl基因的表达,构建Rap1 shRNA(small hairpin RNA,shRNA)表达载体,观察其对小鼠肝脏细胞中Rap1 mRNA和蛋白表达的干扰作用.根据小鼠Rap1 mRNA的全序列.设计了3种Rap1 siRNA序列(Rap1 siRNA1、Rap1 siRNA2、Rap1 siRNA3)和阴性对照序列(HK);采用克隆技术,将其插入带有报告基因绿色荧光(ECFP)的pGenesil-3栽体,构建Rap1 shRNA表达载体:经双酶切和测序证实Rap1 siRNA表达载体克隆构建成功,插入片段测序结果与合成的siRNA结果一致;昆明小鼠40只,体重18～20 g,随机分成4组: Ⅰ组(转染HK组)、Ⅱ组(转染Rapl shRNAl组)、Ⅲ组(转染Rap1 shRNA2组)、Ⅳ组(转染Rapl shRNA3组).于0、16、24 h腹腔内注射Rapl shRNA 2.0～2.5 mg/kg(用PBS稀释至1 mL);48 h后收集小鼠肝脏.用显微荧光、定量RT-PCT、免疫组化检测小鼠肝细胞中Rap1shRNA的转染率、Rap1基因表达以及蛋白质表达水平.Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组小鼠肝脏细胞体内转染率均大于60%,Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组的Rap1 mRNA表达、Rap1蛋白表达均降低,其中Rap1 shRNA1干扰效果最佳.     

Smad4基因siRNA表达载体的构建与鉴定

目的:以Smad4基因为靶标构建小干扰RNA(siRNA)真核表达载体.方法:根据GenBank公布的人Smad4核酸序列及SiRNA设计原则,用AmbionRNAi在线软件,筛选得到2个19 bp片段为靶序列,合成两端带有Bam H Ⅰ、HindⅢ酶切位点的发夹结构寡核苷酸序列,经过退火,将此序列克隆到真核表达质粒pSilencerTM3.1-H1 neo vector中,构建成重组质粒,酶切及测序验证.脂质体介导转染人原代增生性瘢痕成纤维细胞,经G418筛选细胞克隆,并用RT-PCR检测Smad4基因的表达.结果:成功构建了pSilencerTM3.1.H1 neo-Smad4 shRNA表达载体克隆,插入片段测序结果与合成的siRNA序列一致.RT-PCR结果显示转染shRNA1、shRNA2重组质粒的成纤维细胞内Smad4 mRNA水平均降低,其中以pSilencerTM3.1-H1-Smad4 shRNA1更为明显(P＜0.01).结论:构建P-Smad4 shRNA袁达载体成功,为进一步研究Smad4基因的RNA干扰奠定了基础.     

针对核因子-κBP65基因的短发夹干扰RNA逆转录病毒载体构建与鉴定

目的：构建针对人核因子κB亚基P65基因mRNA的短发夹干扰RNA（shRNA）逆转录病毒表达载体,并探讨小干扰RNA（siRNA）靶向抑制NF—κB P65基因表达的作用。方法：根据shRNA设计原则,在人NF-κB P65全长序列中选取含19个核苷酸靶序列,设计形成siRNA的DNA模板并克隆到shRNA表达载体pSUPER．retro．neo中,构建针对NF—κB P65基因的shRNA表达载体。经293A细胞包装,并感染NIH3T3细胞进行病毒滴度测定后,感染THP-1细胞。分别采用RT—PCR和Western blot从mRNA和蛋白水平检测干扰效果。结果：限制性酶切和基因测序证实针对人NF-κB P65亚基的shRNA表达逆转录病毒载体成功构建;其感染THP-1细胞后,NF—κB P65的mRNA和蛋白表达明显抑制。结论：成功构建了NF-κB P65 shRNA逆转录病毒表达载体,该载体能高效感染THP-1并明显抑制NF—κB P65的表达。     

核磷蛋白NPM1的RNA干扰慢病毒载体的构建及鉴定简

目的：构建高效抑制核磷蛋白NPMl基因的短发夹RNA（shRNA）干扰载体。方法：以人NPM1基因为靶序列,设计并合成shRNA序列,将其连入RNA干扰慢病毒载体p113．7;酶切鉴定插入shRNA序列片段的质粒,经测序正确后转染293T细胞;Western印迹检测得到抑制效果好的载体pll-shRNA,将其-9慢病毒载体共转染293T细胞,进行病毒的包装,将得到的病毒感染HTl080细胞,通过RT-PCR、Western印迹等方法验证其抑制效果。结果：酶切证实构建的载体pll-shRNA中已插入外源基因片段,转染293T细胞后都有抑制效果,其中pll-shRNA2的抑制效果最好;用pll-shRNA2病毒感染HTl080细胞,RT-PCR和Western印迹检测分别在RNA和蛋白质水平证实NPMl的表达显著降低。结论：构建的RNA干扰载体pll-shRNA2能有效抑制NPMl的表达,为NPMl功能的研究提供了有力工具。     

泛素C端水解酶L1的RNA干扰载体的构建及效果评价

目的:获得抑制效果好的泛素 C 端水解酶 L1(UCH-L1)基小干扰 RNA(siRNA)干扰载体.方法:根据 Gen?Bank 中大鼠 UCH-L1基序列设计并合成4对 siRNA 寡核苷酸序列,将4对寡核苷酸序列退火成双链后分别插入siRNA 表达载体 pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR 中构建4个 siRNA 表达质粒,测序鉴定后将4个 siRNA 表达质粒分别转染 HEK293细胞,利用 Western 印迹和 qPCR 方法检测干扰效果;将干扰效果最好的质粒包装成腺病毒,感染大鼠血管平滑肌细胞(VSMC),并采用 TNFα干预诱导 UCH-L1表达升高,Western 印迹验证干扰效果.结果:测序分析证实4对 siRNA 寡核苷酸序列分别插入 siRNA 表达载体 pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR;qPCR 检测与 Western 印迹均表明第3号 siRNA 表达载体对 UCH-L1表达的抑制程度最高,将其包装成腺病毒并转染 VSMC 能显著抑制 TNFα诱导的UCH-L1表达升高.结论:构建并筛选出干扰效果好的 UCH-L1 siRNA 干扰载体.     

LOX-1特异性小发夹RNA 表达载体的构建及其对巨噬细胞源性泡沫细胞形成的影响

[摘　要]　目的：靶向血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体-1基因的发卡样siRNA(shRNA)表达载体及其对巨噬细胞源性泡沫细胞形成的影响。方法：(1)采用DNA重组技术,将LOX-1 shRNA双链与线性化pGenesil-1质粒表达载体连接,脂质体法转染小鼠单核巨噬细胞（RAW264.7）,半定量逆转录聚合酶链反应法检测LOX-1 mRNA的表达,Western blot法检测LOX-1蛋白的表达。(2) Ox-LDL诱导巨噬细胞建立泡沫细胞模型, LOX-1-shRNA进行干预,干预组使用脂质体法进行细胞转染,转染24小时后,再加入Ox-LDL作用24小时,用油红O染色法及细胞内游离胆固醇及总胆固醇测定法观察对泡沫细胞形成的影响,倒置荧光显微镜观察转染LOX-1 shRNA后RAW264.7细胞对Dil-ox-LDL的摄取率。结果：测序鉴定发现插入的发卡样序列正确,成功合成了发卡样LOX-1基因RNA干扰表达载体;靶向LOX-1基因的发卡样shRNA表达载体转染RAW264.7细胞后,其LOX-1基因和蛋白表达显著下调, 同时可抑制巨噬细胞源性泡沫细胞形成及对Dil-ox-LDL的摄取。结论：成功构建了能有效抑制LOX-1 mRNA表达的发卡样LOX-1基因RNA干扰表达载体,并在一定程度上能抑制巨噬细胞源性泡沫细胞的形成,为进一步利用RNA干扰技术防治动脉粥样硬化提供理论基础。     

绿色荧光蛋白标记的TGF-β1shRNA真核表达载体的构建及鉴定

目的：构建小鼠转化生长因子β1（TGF-β1）短发夹RNA（shRNA）真核表达载体,探讨TGF-β1在血管发育中的调控作用。方法：根据GenBank小鼠TGF-β1mRNA序列,设计合成三对短链寡核苷酸,退火后形成双链DNA并克隆至入门载体DEN_mH1c。将插入目的基因片段的入门载体与带有绿色荧光蛋白（GFP）标签的shRNA真核表达载体pDS_hpEy进行LR重组反应,完成三个TGF-β1shRNA表达载体的构建,分别命名为pDS_Ta,pDS_Tb和pDS_Tc。经测序确认后,转染小鼠成纤维细胞（NIH／3T3）,筛选稳定表达的细胞克隆,以RT-PCR及Westem blot方法检测转染后TGF-β1mRNA和蛋白表达。结果：RT-PCR和Western blot显示pDS_Tc可明显下调NIH／313细胞TGF-β1的mRNA和蛋白表达,mRNA下调约为70％,蛋白表达减少约65％。结论：GFP标签TGF-β1shRNA表达载体能够阻断TGF-β1基因表达,可作为研究TGF-β1调控血管发育机制的一个工具,为阐明TGF-β1信号传导通路奠定基础。     

小鼠RNA干扰基因RelA慢病毒载体的构建与鉴定

目的：构建小鼠RelA 基因的RNA 干扰慢病毒载体,转染小鼠成骨样细胞并鉴定。方法：针对小鼠RelA 基因序列,设计特异 性的shRNA 序列,应用基因重组技术插入慢病毒载体GV-248。得到的重组质粒转化感受态大肠杆菌DH5-alpha,筛选得到阳性克隆 并扩大培养。所得质粒进行测序分析确定载体构建成功。重组质粒载体及包装辅助质粒转染293T 细胞,得到目的病毒并测定相 应病毒滴度。慢病毒转染MC3T3-E1 细胞后,Real-time PCR 及Western blot 检测MC3T3-E1 细胞RelA 基因及成骨相关基因 ALP、OCN、RANKL的表达。结果：成功构建小鼠RelA 基因的RNA干扰慢病毒载体,感染MC3T3-E1 细胞后,RelA 基因的表达 明显受到抑制,同时RANKL基因表达水平明显下降,ALP、OCN基因表达水平明显上升。结论：成功构建了小鼠RelA 基因的 RNA 干扰慢病毒载体。当小鼠成骨细胞RelA基因表达被干扰,NF-资B 通路被抑制后,小鼠成骨细胞成骨相关基因ALP、OCN的 表达明显上升,成骨功能增强;同时RANKL 的表达明显下降,其介导的破骨细胞骨吸收功能减弱。     

乙酰肝素酶重组慢病毒转基因和siRNA干扰质粒的构建及鉴定

目的：构建乙酰肝素酶重组慢病毒转基因和siRNA干扰质粒,为探讨HPSE在在肿瘤浸润转移过程中的分子机理奠定基础。方法：乙酰肝素酶cDNA全长扩增和最佳siRNA干扰片段筛选分别采用PCR和Real-time PCR方法,慢病毒系统载体分别使用pWPI和siRNA pSico系统,采用限制性内切酶快速连接方法联接目的基因和最佳最佳siRNA干扰片段,表达载体鉴定均采用核苷酸序列测定,HPSE重组慢病毒表达质粒和siRNA片段细胞转染采用脂质体转染法。结果：成功扩增乙酰肝素酶全长并连接入pWPI载体构建成重组表达载体HPSE-pWPI,重组质粒测序结果显与HPSE基因的同源性达99%。转染293T后有HPSE基因的表达。筛选出最佳siRNA干扰片段为HPSE-1222并成功插入pSico载体,构建成重组表达载体HPSE-siRNA pSico,重组载体测序显示与构建的shRNA结构序列完全一致。结论：成功采用慢病毒载体系统构建了乙酰肝素酶重组慢病毒转基因和siRNA干扰质粒,为探讨HPSE在在肿瘤浸润转移过程中的分子机理奠定基础。     

靶向Smad4基因shRNA质粒表达载体的构建及筛选

目的:构建编码Smad4mRNA的shRNA真核表达载体,并筛选出基因沉默效果最明显的shRNA质粒表达载体.方法:根据GenBank提供的人Smad4基因的mRNA序列构建2个shRNA质粒表达栽体和1个阴性对照质粒表达载体,并通过基因测序进行鉴定.经鉴定后转染体外培养人成纤维细胞,western-blot检测Smad4蛋白水平抑制表达效果.结果:构建质粒表达载体测序结果显示,插入片段测序结果与合成的shRNA序列一致;靶向Smad4基因shRNA质粒表达栽体对所转染的人成纤维细胞中Smad4蛋白水平表达均有抑制作用,其中shRNA1最为明显.结论:成功构建了靶向Smad4基因shRNA质粒表达栽体,其中抑制Smad4基因表达效果最为明显的是shRNA1,为进一步研究Srnad4基因的RNA干扰奠定了基础.     

小鼠Dppa2基因shRNA载体的构建及干扰效果的检测

目的:构建有效的针对小鼠Dppa2基因的shRNA(short hairpin RNA)干扰载体。方法:设计合成2对针对小鼠Dppa2基因的shRNA序列以及1对与哺乳动物基因组无同源性的shRNA序列作为对照,构建pSUPER.Retro.puro干扰载体并进行PCR,酶切和测序验证。进一步将各干扰载体分别转染小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs),RT-PCR检测干扰效率。结果:PCR,酶切和测序验证均表明各shRNA载体构建成功。将空载体及各重组载体分别转染小鼠ESCs发现,干扰组Dppa2基因表达水平相对于空载体对照组和阴性shRNA载体对照组明显下调。结论:成功构建了有效的针对小鼠Dppa2基因的shRNA干扰载体,为进一步研究Dppa2基因在维持小鼠ESCs不分化过程中的作用提供了基础。     

细胞周期蛋白E siRNA真核表达载体的构建与鉴定

目的 构建细胞周期蛋白E（CyclinE）小干扰RNA（siRNA）的真核表达载体,并检测其抑制乳腺癌细胞株MCF-7中CyclinE表达的效果。方法根据基因文库中Cyclin E的cDNA序列,设计并合成两段siRNA,分别转入到pGENESIL-1质粒中,并对重组质粒（命名为pGENESIL／CyclinE-1和pGENESIL／Cyclin E-2）进行测序鉴定。脂质体介导下转染MCF-7细胞株,RT-PCR检测转染后Cyclin E的表达。结果 CyclinEsiRNA真核表达载体构建成功,测序结果显示插入片段的方向和序列与预想一致。RT-PCR检测显示Cyclin E的表达显著降低。结论 Cyclin E siRNA真核表达载体的成功构建为进一步研究以Cyclin E为靶位点对乳腺癌进行基因治疗奠定了重要的实验基础。     

慢病毒siRNA靶向干扰YAP基因胃癌细胞株的建立

目的：构建并鉴定YAP基因短发夹干扰RNA（shRNA）慢病毒载体,建立稳定干扰YAP基因表达的胃癌细胞株SGC7901。方法：荧光定量PCR检测YAP基因在多种胃癌细胞株中的表达情况。构建重组靶向YAP基因的shRNA慢病毒表达质粒PGC-shRNA-YAP,用脂质体转染的方法将载体导入胃癌细胞。经杀稻瘟菌素筛选后,建立稳定表达siRNA的细胞株。荧光定量PCR检测干扰效率。结果：在胃癌细胞株SGC7901中,YAP基因显示高表达。测序验证PGC-shRNA-YAP重组质粒构建成功。将重组质粒稳定转染入胃癌细胞株SGC7901后能明显抑制YAPmRNA表达水平。结论：成功构建了PGC-shRNA-YAP慢病毒重组质粒,建立了靶向稳定干扰YAP基因表达的siRNA胃癌细胞株SGC7901。     

靶向FTL基因的shRNA真核表达载体的构建及鉴定

目的:为了构建铁蛋白轻链(ferritin light chain,FTL)的短发夹小干扰RNA表达载体,并提供进一步研究FTL功能的平台。方法:针对小鼠FTL基因的特异性位点设计并合成特异性长度约65bp的短发夹状小干涉RNA(shRNA)寡核苷酸序列,退火形成双链后将其插入真核表达载体pRNA-U6.1/neo的限制性内切酶HindⅢ和Bam HⅠ之间中,构建成FTL基因的干扰载体(FTL shRNA)。经测序鉴定正确后,用lipofectamineTM2000将FTL shRNA及其对照空载体pRNA-U6.1/neo分别转染到小鼠腹腔单核巨噬细胞(RAW264.7)中,提取蛋白后利用Western blot技术检测细胞中FTL蛋白的表达。结果:得到与预期目的片段大小相似的重组载体,测序结果显示所构建的小鼠FTL shRNA质粒序列正确。细胞内的FTL表达被FTL shRNA成功干扰,效率高达80%。结论:实验成功构建了小鼠FTL基因的短发夹小RNA干扰表达载体FTL shRNA。     

小鼠Smad6基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

构建小鼠Smad6基因RNA干扰（RNAi）慢病毒载体,有效沉默骨髓树突状细胞（BMDC）的Smad6基因表达,为构建骨髓致耐受DC用于哮喘等自身免疫疾病的研究。设计小鼠Smad6 shRNA序列,合成、退火,得到双链DNA,与经酶切后的Psih1-H1-copGFP shRNA Vector载体连接产生LV-shSmad6慢病毒载体,并测序鉴定。转染293TN细胞,包装产生慢病毒,测定滴度。感染小鼠骨髓树突细胞,检测Smad6基因的表达状况成功构建Smad6 shRNA的慢病毒载体LV-shSmad6。包装慢病毒,并显著抑制Smad6 mRNA水平及蛋白水平的表达。成功构建出小鼠Smad6基因shR-NA慢病毒载体,为后期研究Smad6基因在哮喘发病机制及新治疗方法提供了稳定的转染细胞载体。     

人eya2基因小干扰RNA表达载体的构建及表达

目的：设计并构建人eya2（eyes absent2）基因小干扰RNA（siRNA）的真核表达载体,并观察其沉默效果。方法：以人eya2为靶基因,以pSliencer2．1-U6 neo质粒为载体,根据人eya2的cDNA序列,设计含有小发卡结构的2条寡核苷酸序列,将其克隆到siRNA表达载体上;转化大肠杆菌DH5Ⅸ菌株,抽提质粒,测序分析;将重组质粒转染人胚肾293T细胞,通过荧光分析、Westemblot和转录活性实验检测其抑制效果。结果：重组体测序结果与目的序列相一致,证明构建了eya2 siRNA真核表达载体;荧光观察表明siRNA能显著减弱细胞中绿色荧光强度,抑制eya2基因表达;Westemblot分析证明构建的siRNA能有效抑制外源性及内源性eya2基因表达;转录活性测定表明,构建的siRNA能有效抑制eya2基因表达。结论：构建了eya2 siRNA真核表达载体,该siRNA能有效地抑制eya2基因表达。     

小鼠XBP1基因RNA干扰慢病毒载体的构建及筛选

目的:构建小鼠XBP1基因RNA干扰(RNA interference,RNAi)慢病毒载体,筛选具有较好干扰效率的小鼠XBP1 siRNA靶序列.方法:针对小鼠XBP1基因特异性序列,设计4个RNAi靶序列及1个阴性对照序列,合成含有正义和反义Oligo DNA的互补DNA序列,退火形成双链DNA,并克隆到经Age Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切后的pGCL-GFP载体连接产生短发卡RNA(shRNA)慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,DNA测序鉴定.由病毒包装系统进行包装,经滴度测定后感染NIH3T3细胞,应用Real-time PCR鉴定干扰效率.结果:PCR鉴定与DNA测序证实合成的寡核苷酸链插入正确,293T细胞测定病毒滴度为1×108TU/ml.Real-timePCR证实XBP1-siRNA-3靶点的干扰效率最高,其干扰效率达到95%以上.结论:成功构建并筛选了小鼠XBP1基因RNAi慢病毒载体,为研究XBP1在巨噬细胞免疫功能调控中的作用奠定了基础.     

靶向人CHOP基因shRNA真核表达载体的构建

[目的]构建靶向干扰内质网应激标志性因子CHOP的shRNA真核表达载体,并检测其对CHOP的干扰效率。[方法]查询Gen Bank数据库,获取人源CHOP基因mRNA的序列,按照小干扰RNA(siRNA)靶序列的设计原则,设计并构建靶向CHOP基因mRNA的4个特异性shRNA真核表达载体(shRNA-1、shRNA-2、shRNA-3、shRNA-4)和1个无同源性的阴性对照载体(shRNA-NC),经PCR和测序鉴定确认shRNA载体构建成功后,脂质体转染人正常肝细胞系(L-02),Western Blot法检测CHOP蛋白的表达,筛选出干扰效果最好的表达载体。[结果]PCR和测序结果显示,5个shRNA表达载体均构建成功。Western Blot结果显示,0.06 g/L衣霉素损伤24h后,与内质网应激模型组相比,shRNA-1、shRNA-2、shRNA-3、shRNA-4组的CHOP蛋白表达水平均明显降低(P0.01),其中shRNA-1和shRNA-4组CHOP干扰效果最明显。[结论]构建了并成功筛选出靶向干扰CHOP基因的真核表达载体,为深入研究CHOP介导内质网应激所致细胞凋亡的信号通路奠定了实验基础。     

核磷蛋白NPM1的RNA干扰慢病毒载体的构建及鉴定

目的:构建高效抑制核磷蛋白NPM1基因的短发夹RNA(shRNA)干扰载体。方法:以人NPM1基因为靶序列,设计并合成shRNA序列,将其连入RNA干扰慢病毒载体pll3.7;酶切鉴定插入shRNA序列片段的质粒,经测序正确后转染293T细胞;Western印迹检测得到抑制效果好的载体pll-shRNA,将其与慢病毒载体共转染293T细胞,进行病毒的包装,将得到的病毒感染HT1080细胞,通过RT-PCR、Western印迹等方法验证其抑制效果。结果:酶切证实构建的载体pll-shRNA中已插入外源基因片段,转染293T细胞后都有抑制效果,其中pll-shRNA2的抑制效果最好;用pll-shRNA2病毒感染HT1080细胞,RT-PCR和Western印迹检测分别在RNA和蛋白质水平证实NPM1的表达显著降低。结论:构建的RNA干扰载体pll-shRNA2能有效抑制NPM1的表达,为NPM1功能的研究提供了有力工具。     

神经粘附分子NCAM140 基因RNA干扰质粒的构建与鉴定

摘要目的：构建有效的小鼠神经粘附分子（NCAM140）基因的RNA 干扰（RNAi）质粒载体,为研究NCAM140参与的细胞信号通 路转导、其生物学作用以及以NCAM140 为靶点的基因治疗提供稳定转染的RNAi 质粒。方法：使用基因序列软件设计、筛选符 合公开文献筛选参数的4 条靶序列以及1条阴性对照序列,由上海吉玛技术有限公司合成。与载体质粒pGPU6/GFP/Neo 重组后, 分别命名为pSi-nca1、pSi-nca2、pSi-nca3、pSi-nca4和pSi-control。转染大肠杆菌感受态细胞。选择阳性克隆进行DNA 测序鉴定, Western blot方法进行干扰靶点的筛选。选取干扰效率最高的质粒转染MN9D 细胞,普通光学显微镜分别计数同一视野细胞总数 及GFP阳性细胞数,计算转染效率。结果：酶切和DNA 测序结果证实shRNA正确插入pGPU6/GFP/Neo 质粒;Western blot结果 显示与空质粒对照组比较,pSi-nca4 组细胞NCAM140 表达明显下调,细胞转染效率为62 %。结论：成功构建靶向小鼠 NCAM140 基因的RNAi 质粒,为NCAM140 参与的细胞信号通路的研究以及以NCAM140为靶点的基因治疗提供了稳定转染 细胞的干扰质粒,为研究其生物学作用奠定了分子生物学基础。