携带人二氢叶酸还原酶基因慢病毒表达载体构建及鉴定

目的:构建携带人二氢叶酸还原酶(DHFR)基因的慢病毒表达载体pWPI。方法:采用PCR方法扩增二氢叶酸还原酶cDNA全长,与EZ-T克隆载体连接,HindIII及BamHI-HF限制性内切酶双酶切回收的PCR片段并补平其缺口。慢病毒系统载体使用pWPI系统,采用PmeI酶切载体后回收片段,将其磷酸化,T4酶连接载体与目的基因。表达载体鉴定均采用核苷酸序列测定,重组质粒采用脂质体转染293T包装细胞后获得包装的病毒颗粒。结果:成功扩增二氢叶酸还原酶全长并连接入pWPI载体构建成重组表达载体DHFR-pWPI,重组质粒测序结果显与DHFR基因的同源性达100%,按标准生产程序转染293T后有DHFR基因的表达。结论:成功采用慢病毒载体系统构建了二氢叶酸还原酶重组慢病毒转基因,为探讨DHFR在肿瘤多药耐药过程中的分子机理奠定基础。     

慢病毒siRNA靶向干扰YAP基因胃癌细胞株的建立

目的：构建并鉴定YAP基因短发夹干扰RNA（shRNA）慢病毒载体,建立稳定干扰YAP基因表达的胃癌细胞株SGC7901。方法：荧光定量PCR检测YAP基因在多种胃癌细胞株中的表达情况。构建重组靶向YAP基因的shRNA慢病毒表达质粒PGC-shRNA-YAP,用脂质体转染的方法将载体导入胃癌细胞。经杀稻瘟菌素筛选后,建立稳定表达siRNA的细胞株。荧光定量PCR检测干扰效率。结果：在胃癌细胞株SGC7901中,YAP基因显示高表达。测序验证PGC-shRNA-YAP重组质粒构建成功。将重组质粒稳定转染入胃癌细胞株SGC7901后能明显抑制YAPmRNA表达水平。结论：成功构建了PGC-shRNA-YAP慢病毒重组质粒,建立了靶向稳定干扰YAP基因表达的siRNA胃癌细胞株SGC7901。     

慢病毒siRNA靶向干扰YAP基因胃癌细胞株的建立

目的:构建并鉴定YAP基因短发夹干扰RNA(shRNA)慢病毒载体,建立稳定干扰YAP基因表达的胃癌细胞株SGC7901。方法:荧光定量PCR检测YAP基因在多种胃癌细胞株中的表达情况。构建重组靶向YAP基因的shRNA慢病毒表达质粒PGC-shRNA-YAP,用脂质体转染的方法将载体导入胃癌细胞。经杀稻瘟菌素筛选后,建立稳定表达siRNA的细胞株。荧光定量PCR检测干扰效率。结果:在胃癌细胞株SGC7901中,YAP基因显示高表达。测序验证PGC-shRNA-YAP重组质粒构建成功。将重组质粒稳定转染入胃癌细胞株SGC7901后能明显抑制YAPmRNA表达水平。结论:成功构建了PGC-shRNA-YAP慢病毒重组质粒,建立了靶向稳定干扰YAP基因表达的siRNA胃癌细胞株SGC7901。     

CXCR4慢病毒载体的构建及其在人脐带血间充质干细胞的表达

目的：构建趋化因子CXC亚族CXCR4的慢病毒表达载体并观察其转染人脐带间充质干细胞后的表达。方法：用逆转录PCR方法获取CXCR4基因编码区片段,将构建的慢病毒载体质粒pLVTHM-EGFP-CXCR4与包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2．G共转染293T细胞,包装生产慢病毒。用相同滴度的慢病毒转导等量间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cell,MSCs）,后采用Real time PCR检测CXCR4 mRNA、Western Blot方法检测蛋白质的表达。结果：PCR、酶切和测序结果表明成功的构建了CXCR4基因重组慢病毒载体。同时用该慢病毒载体转染MSCs后可有效地增加MSCs中CXCR4的表达。结论：成功构建了CXCR4的慢病毒表达载体并能在MSCs中表达,为进一步研究其在干细胞移植中的应用奠定基础。’     

用Gateway 系统构建携带Grb2-SH2 基因重组慢病毒载体

目的:构建携带Grb2-SH2基因重组慢病毒载体。方法:把Grb2-SH2基因从合成的工程载体PUC-57中导到入门载体pentr-3C中,再利用LR反应重组到目的载体plenti,通过酶切和测序分析对比验证Grb2-SH2基因后,将plenti-Grb2-SH2质粒利用慢病毒转染系统转染人胚胎肾上皮细胞株293T细胞获得携带Grb2-SH2慢病毒载体。结果:构建的重组质粒经酶切及测序和分析比对鉴定正确,目的基因片段大小约为500bp;该质粒与包装质粒共转染293T细胞获取的慢病毒,转染效率约为90%。结论:成功构建转载质粒plenti-Grb2-SH2及携带Grb2-SH2基因慢病毒载体。     

介导大鼠结缔组织生长因子基因沉默的慢病毒载体转移质粒的构建及鉴定

目的：构建介导大鼠结缔组织生长因子（CTGF）基因沉默的慢病毒载体转移质粒pGCL-CTGF,为进一步包装慢病毒载体奠定基础。方法：以大鼠CTGF基因为靶基因,根据RNA干扰（RNAi）序列设计原则,设计4对有小发夹结构的RNAi靶点序列,退火形成双链DNA,双酶切后定向克隆到慢病毒载体转移质粒pGCL-GFP中,构建4个含靶基因片段的重组慢病毒载体转移质粒pGCL-CTGF,并对质粒进行PCR及测序鉴定。结果：CTGF的短发夹RNA（shRNA）片段被成功克隆到慢病毒载体转移质粒pGCL-GFP中,4个插入序列与设计的靶基因片段完全一致。结论：构建了能够表达4个含CTGF靶基因片段的慢病毒载体转移质粒,为进一步包装介导CTGF基因沉默的慢病毒载体奠定了基础。     

乙酰肝素酶siRNA对人膀胱癌T24细胞株侵袭能力的影响

目的:观察乙酰肝素酶(Heparanase,HPSE)小干扰R N A(small-interfering RNA,siRNA)对人膀胱癌细胞株侵袭力的影响。方法:体外化学合成一段乙酰肝素酶特异性小干扰RNA(siRNA)序列,以阳离子脂质体介导将不同浓度的siRNA转染至膀胱癌细胞系T24细胞中,应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测转染前后T24细胞中HPSE mRNA表达,采用transwell小室侵袭试验测定肿瘤细胞的体外侵袭力。结果:转染HPSE siRNA可以显著降低T24细胞中的HPSE mRNA表达,HPA siRNA处理细胞48小时,与对照组相比,各有效浓度的HPSE siRNA可显著抑制T24细胞的体外侵袭能力(P<0.05)。结论:以siRNA阻遏乙酰肝素酶在膀胱癌细胞中表达可以成功地抑制膀胱癌细胞侵袭能力,通过应用RNA干扰技术等方法抑制乙酰肝素酶活性可能可以应用于临床治疗膀胱癌。     

乙酰肝素酶siRNA对人膀胱癌T24细胞株侵袭能力的影响

目的:观察乙酰肝素酶(Heparanase,HPSE)小干扰R N A(small-interfering RNA,siRNA)对人膀胱癌细胞株侵袭力的影响.方法:体外化学合成一段乙酰肝素酶特异性小干扰RNA(siRNA)序列,以阳离子脂质体介导将不同浓度的siRNA转染至膀胱癌细胞系T24细胞中,应用逆转录—聚合酶链反应(RT-PCR)法检测转染前后T24细胞中HPSE mRNA表达,采用transwell小室侵袭试验测定肿瘤细胞的体外侵袭力.结果:转染HPSE siRNA可以显著降低T24细胞中的HPSE mRNA表达,HPA siRNA处理细胞48小时,与对照组相比,各有效浓度的HPSE siRNA可显著抑制T24细胞的体外侵袭能力(P＜0.05).结论:以siRNA阻遏乙酰肝素酶在膀胱癌细胞中表达可以成功地抑制膀胱癌细胞侵袭能力,通过应用RNA干扰技术等方法抑制乙酰肝素酶活性可能可以应用于临床治疗膀胱癌.     

靶向ADAM17基因RNA干扰慢病毒载体的构建及慢病毒包装

目的构建靶向ADAM17基因RNA干扰（RNAi）慢病毒载体及包装慢病毒。方法根据人ADAM17mRNA序列设计4个靶序列,合成4对寡核苷酸序列,同时合成1对阴性对照寡核苷酸序列;将以上5对寡核苷酸序列退火后连入pLVTHM质粒,经酶切和测序鉴定。将重组慢病毒质粒转染至A549细胞,以Real-time PCR检测A549细胞中ADAM17 mRNA表达。将干扰效果最佳的质粒载体和包装质粒共转染至293T细胞,包装产生病毒颗粒。以流式细胞术检测重组慢病毒的滴度。结果酶切和测序证实干扰靶序列已被准确克隆到pLVTHM质粒载体。pLVTHM-ADAM17-siRNA1-4均可显著抑制A549细胞ADAM17 mRNA的表达,其中pLVTHM-ADAM17-siRNA4的抑制效果最佳。LV-ADAM17-siRNA4重组慢病毒的滴度为2.16×108TU/ml。结论成功构建了靶向人ADAM17基因RNAi慢病毒载体及包装了重组慢病毒。     

Netrin-1慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的:构建携带有Netrin-1基因的逆转录病毒载体,为研究Netrin-1在神经发育中的作用奠定基础。方法:PCR扩增Netrin-1基因片段后,将其克隆入慢病毒表达载体pLXSN;通过PCR、酶切、测序鉴定重组质粒。重组质粒转染PA317包装细胞后获得包装的病毒颗粒。病毒颗粒感染人脑胶质瘤细胞SW038-C2,经Western blot证明重组病毒在真核细胞内表达Netrin-1的情况。结果:经PCR扩增、酶切和测序验证,重组质粒构建正确,命名为pLX-NT。Western blot证明在感染细胞泳道有一特异性条带。结论:成功构建了能表达Netrin-1的慢病毒载体。     

含F／2A序列的抗P185^erbB2人鼠嵌合抗体慢病毒表达载体的构建

目的构建含F／2A序列的抗P185^erbB2人鼠嵌合抗体慢病毒表达载体,观察其在293T细胞中的表达。方法用具有自我剪切能力的弗林蛋白酶（Furin）／口蹄疫病毒2A多肽（F/2A）连接人鼠嵌合抗体的重链和轻链,形成一个开放阅读框（ORF）,插入慢病毒表达载体pWPI,构建重组抗P185神睨全长人鼠嵌合抗体表达载体pWPI／H-F2A—L。以已构建的慢病毒表达载体pWPI／H-IRES-L为对照质粒。应用磷酸钙沉淀法将慢病毒载体3质粒系统共转染入293T细胞进行包装,测定病毒滴度。再感染293T细胞,荧光显微镜下观察GFP的表达和转染效率,RT—PER、ELISA方法分别检测嵌合抗体mRNA和蛋白的表达。结果经测序鉴定,pWPI／H—F2A—L与预期设计一致;pWPI／H—F2A—L组的病毒滴度为4．3×10^5TU／ml,而pWPI／H—IRES—L组的病毒滴度为3．5×10^5TU／ml;两组重组慢病毒的转染效率分别为87．68％和79．08％;两组重组慢病毒感染293T细胞后,都有嵌合重链和嵌合轻链的表达,由F／2A介导的嵌合抗体的表达水平要高于由IRES介导的嵌合抗体。结论成功构建了含F／2A序列的抗P185^erbB2人鼠嵌合抗体慢病毒表达载体,为今后抗P185^erbB2工程抗体的研究奠定了基础。     

针对miR-221基因干扰慢病毒载体的构建及其有效靶序列的筛选与检测

目的：构建携带人miR-221基因的miRNA干扰慢病毒载体并寻找其有效靶序列,为胶质瘤的研究提供一种新的方法。方法：合成含干扰序列的双链DNAoligo直接连入酶切后的RNA干扰载体上。将产物转入细菌感受态细胞,对长出的克隆进行PCR鉴定,阳性克隆即为目的基因RNA干扰慢病毒载体质粒。再将目的基因与目的载体分别进行双酶切,纯化酶切产物后进行定向连接,其产物转入细菌感受态细胞,再对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和分析比对,比对正确即为融合蛋白过表达质粒载体,然后将两种质粒共转染入293T细胞,用westernbolt法检测其有效敲减靶序列。结果：重组质粒经测序鉴定证明各转录模板完整、正确插入到相应质粒中,共转染后发现编号为PscSI576的靶点干扰效果最好。结论：本实验成功构建了人miR-221基因的RNA干扰慢病毒载体,并找到了有效的干扰靶序列。     

鼻咽癌CD44抑制表达细胞株的建立

目的:构建CD44新剪接变异体siRNA质粒表达载体,建立CD44新变异体抑制表达的鼻咽癌细胞株.方法:合成CD44新变异体特异性干扰DNA片段,干扰DNA片段亚克隆于带绿色荧光蛋白的pGenesil -1.3质粒表达载体中,双酶切和测序鉴定重组表达质粒载体;采用脂质体将重组表达质粒载体转染入鼻咽癌5 -8F细胞系,进行G418筛选;Western blot分析CD44表达.结果:重组CD44干扰DNA片段质粒表达载体的碱基序列和插入方向正确;细胞转染效率达70％;G418筛选获得GFP表达的单克隆鼻咽癌5 -8F细胞株;Western blot分析表明CD44表达受抑制.结论:建立了CD44新变异体抑制表达的鼻咽癌细胞株,为CD44新变异体在鼻咽癌中的生物学功能提供了基础.     

STAT3小干扰RNA的构建及对缺氧复氧人肾小管上皮细胞凋亡的影响

目的:构建信号转导与转录因子3(STAT3)小干扰RNA(siRNA)表达载体,并观察其对缺氧复氧后人肾小管上皮细胞(HKC)凋亡的影响。方法:设计3对人STAT3 siRNA靶序列,用DNA重组技术克隆至质粒pRNAT-U6.1/neo中,构建重组质粒pRNAT-U6.1-STAT3 siRNA,检测并筛选出最佳抑制效率的siRNA质粒载体。重组质粒转染至缺氧复氧后HKC细胞,Western blotting和Real Time-PCR测定STAT3蛋白和mRNA表达量,流式细胞仪测定细胞凋亡,间接荧光法测定Bcl-2和Bax表达的变化。结果:靶向STAT3基因表达的质粒载体构建成功,并筛选出抑制效率最佳的重组质粒。缺氧复氧后HKC细胞STAT3表达、凋亡率和Bax/Bcl-2比值增加;缺氧复氧后HKC细胞转染重组质粒后STAT3表达、凋亡率和Bax/Bcl-2比值明显降低。结论:成功构建并筛选最佳抑制效率的靶向STAT3的重组质粒载体。该载体可有效抑制缺氧复氧后HKC细胞中STAT3信号转导通路的活化,并进一步通过上调Bcl-2、下调Bax蛋白的表达,从而抑制细胞凋亡。     

LIM结构域蛋白FHL1C抑制Notch信号途径的转录激活研究

目的：克隆人表达FHL1C基因以及建立真核表达载体和慢病毒载体。方法：从人的骨骼肌细胞来源的cDNA中扩增并克隆人FHL1C基因的编码区,连接至pMD-18T载体酶切鉴定后测序。序列测定确认后,双酶切pMD18T-FHL1C回收片段,插入真核表达载体,构建真核表达载体pCMV-Myc-FHL1C酶切鉴定正确后,转染Hela细胞及Cos7细胞,用Western Blot检测其在转染细胞中的表达,用双荧光素报告基因系统检测其对Notch信号作用。构建FHL1C-IRES-GFP表达单元,建立慢病毒表达载体plen-ti6/V5-FHL1C-IRES-GFP,包装慢病毒后感染培养的细胞,用免疫荧光显微镜、Western Blot检测分析其在被感染的细胞中的表达。结果：通过PCR方法成功扩增了人FHL1C基因的编码区。通过转染Hela及Cos7细胞,使用Western Blot检测其蛋白水平表达,双荧光报告基因系统分析均能够下调激活的Notch信号。成功构建了FHL1C慢病毒表达载体pLenti6/V5-FHL1C-IRES-GFP,包装慢病毒,把获取的慢病毒感染细胞后通过荧光显微镜证实被感染的细胞绿色荧光蛋白正确表达,Western Blot检测证实其表达。结论：成功建立起FHL1C真核表达载体及慢病毒表达系统,为研究急性T淋巴细胞白血病与Notch信号转导通路之间的关系奠定了基础。     

siRNA表达载体的构建及其表达

本研究用限制性内切酶消化质粒pCMV-tag-2B,除去巨细胞病毒(Cytomegalovirus,CMV)启动子核苷酸序列,剩下的核苷酸序列作为构建表达siRNA(Small interfering RNA,siRNA)载体的前体。依据文献提供的扩增H1RNA启动子核苷酸序列的引物序列合成一对引物,以带有H1RNA启动子序列的质粒DNA为模板扩增HIRNA启动子序列,插入前体,构建SiRNA的表达载体pCH1。另外将H1RNA启动子插入pGEM．1lfz相应位点,构建瞬时表达载体pGHl。依据EGFP的有效SiRNA抑制位点,合成两条分别为64bp的核苷酸链,通过体外退火,形成双链,然后插入已构建的两个表达载体。将这两个载体分别与表达EGFP蛋白的质粒pEGFP．N3共转染Bel．7402细胞,观察siRNA对EGFP的抑制效应。研究结果表明构建的载体有效表达了siRNA,这些载体可以用于与siRNA相关抗病毒治疗性试验研究。     

敲低GATA1慢病毒表达载体的构建及敲低效果检测

目的：为了探讨与人血细胞相关的GATA1转录因子在实体肿瘤发生发展中的功能,构建GATA1的慢病毒干扰载体,并验证其敲低效果。方法：根据人GATA1的cDNA序列,设计含有小发卡结构的寡核苷酸序列,将其克隆到慢病毒表达载体上;将重组质粒转染人胚肾293T细胞,通过实时定量RT-PCR及Western印迹检测GATA1的表达水平。结果和结论：构建了具有明显干扰效果的GATA1基因的小干扰RNA（siRNA）慢病毒表达载体,能够有效抑制GATA1 mRNA和蛋白水平,为后续的GATA1生物学作用研究奠定了基础。     

脂肪储存小滴蛋白5重组腺病毒的制备

目的：利用AdEasy腺病毒表达系统构建含有小鼠脂肪储存小滴蛋白5（LSDP5）基因的重组腺病毒。方法：从小鼠肝脏cDNA克隆出LSDP5基因全长,克隆至pMD18-T载体中,酶切测序。回收酶切产物,连接到腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV,构建pShuttle-CMV-LSDP5重组质粒,经PmeI酶切线性化后转化至含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183中。筛选阳性克隆,提取重组质粒,PacI酶切线性化并转染AD293细胞进行包装,提取病毒DNA,鉴定重组病毒并检测病毒滴度。结果：LSDP5基因克隆经测序证实与Genebank公布一致,双酶切重组pMD18-T载体得到1400 bp左右的片段。重组穿梭载体经Kpn I和Sal I双酶切后得到预期片段。PacI酶切得到30 Kb大片段和4.5 Kb小片段。转染AD293细胞后收集病毒,经PCR鉴定,获得理想的目的片段。取病毒上清反复感染AD293细胞以扩增病毒,最后所得病毒滴度为2.5×109pfu/ml。结论：成功构建了携带脂肪储存小滴蛋白5基因的重组腺病毒载体,为进一步研究LSDP5基因功能奠定基础。