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应用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术抑制Rapl基因的表达,构建Rap1 shRNA(small hairpin RNA,shRNA)表达载体,观察其对小鼠肝脏细胞中Rap1 mRNA和蛋白表达的干扰作用.根据小鼠Rap1 mRNA的全序列.设计了3种Rap1 siRNA序列(Rap1 siRNA1、Rap1 siRNA2、Rap1 siRNA3)和阴性对照序列(HK);采用克隆技术,将其插入带有报告基因绿色荧光(ECFP)的pGenesil-3栽体,构建Rap1 shRNA表达载体:经双酶切和测序证实Rap1 siRNA表达载体克隆构建成功,插入片段测序结果与合成的siRNA结果一致;昆明小鼠40只,体重18~20 g,随机分成4组: Ⅰ组(转染HK组)、Ⅱ组(转染Rapl shRNAl组)、Ⅲ组(转染Rap1 shRNA2组)、Ⅳ组(转染Rapl shRNA3组).于0、16、24 h腹腔内注射Rapl shRNA 2.0~2.5 mg/kg(用PBS稀释至1 mL);48 h后收集小鼠肝脏.用显微荧光、定量RT-PCT、免疫组化检测小鼠肝细胞中Rap1shRNA的转染率、Rap1基因表达以及蛋白质表达水平.Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组小鼠肝脏细胞体内转染率均大于60%,Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组的Rap1 mRNA表达、Rap1蛋白表达均降低,其中Rap1 shRNA1干扰效果最佳.  相似文献   
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应用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术抑制Rap1基因的表达,构建RaplshRNA(small hairpin RNA.shRNA)表达载体,观察其对小鼠肝脏细胞中RaplmRNA和蛋白表达的干扰作用.根据小鼠RaplmRNA的全序列.设计了3种Rap1 siRNA序列(Rap1 siRNA1、Rap1 siRNA2、Rap1 siRNA3)和阴性对照序列(HK);采用克隆技术,将其插入带有报告基因绿色荧光(EGFP)的pGenesi1-3载体,构建RaplshRNA表达载体:经双酶切和测序证实Rap1 siRNA表达载体克隆构建成功,插入片段测序结果与合成的siRNA结果一致:昆明小鼠40只,体重18~20g,随机分成4组:I组(转染HK组)、Ⅱ组(转染RaplshRNAl组)、Ⅲ组(转染RaplshRNA2组)、Ⅳ组(转染Rap1 shRNA3组).于0、16、24h腹腔内注射Rap1 shRNA2.0-2.5mg/kg(用PBS稀释至1mL):48h后收集小鼠肝脏.用显微荧光、定量RT—PCT、免疫组化检测小鼠肝细胞中Rap1 shRNA的转染率、Rap1基因表达以及蛋白质表达水平.I组、Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组小鼠肝脏细胞体内转染率均大于60%.Ⅱ组、m组、Ⅳ组的RaMmRNA表达、Rap1蛋白表达均降低.其中Rao1 shRNA1干扰效果最佳.  相似文献   
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