纤维二糖水解酶Ⅰ吸附结构域的新功能

从拟康氏木霉S-38中分离纯化得到的外切酶Ⅰ（CBHI）,经过木爪蛋白质酶的有限酶解后通过一系列的柱层析分离获得其吸附结构域（CBM）．利用CBM与纤维素在40％下作用24h后,利用红外光谱测定纤维素结构的变化,发现纤维素的氢键作用减弱,利用分子动力学模拟进一步确认实验的结果,并从纳米尺度上阐明了在CBM分子吸附作用于纤维素表面的过程中纤维素链间的氢键作用明显降低．本研究表明CBM分子不仅具有使CBHI分子定位于纤维素表面的作用,还会在吸附过程中导致纤维表面结构的破坏．本研究为CBHI分子催化结构域与吸附结构域分子间的协同模型提供了一重要证据．     

微紫青霉外切葡聚糖纤维二糖水解酶（CBHI）的纤维素结合结构域及其链结区非水解性破坏纤维素结晶区结构

天然纤维素的结晶区必需在内、外切纤维素酶的协同作用下,始可被降解,这是纤维素降解的限速步骤。内、外切纤维素酶均为β－1,4－糖苷键的水解酶,但单一的内、外切纤维素酶却都不能水解天然纤维素的结晶区。内、外切纤维素酶怎样协同降解纤维素的机理一直未得阐明,是天然纤维素降解机制研究中的难点。纤维素酶分子是由具有催化功能的催化结构域（catalytic domain,CD）和具有结合纤维素功能的纤维素结合（吸附）结构域（cellulse biding domain,CBD）及涟结它们的链结区（linker）序列组成。已知一细菌的CBD在吸附纤维素后,纤维素聚合物断裂形成短小纤维,但这一现象还未在真菌中有类似发现,通过对插入质粒pUC-18上的微紫青霉外切葡聚糖纤维二糖水解酶CBHI的 cDNA基因,进行系列序列定向缺失等体外操作,得到了催化结构域序列缺失的重组质粒,转化大肠杆菌JM109后,利用纤维素结合结构域CBD可吸附纤维素的特性,筛选到含CBD编码区的转化子PUC18G,生产出了LacZ－CBD融合蛋白,经木瓜蛋白酶有限酶切后,分离纯化得到了CBD结构域及其链结区称为：CBDCBHI。经X光衍射、红外光谱分析、热活力测定和扫描电镜观察表明,CBDCBHI吸附纤维素后,能够导致纤维素聚合物氢键断裂,结晶度减低和形成短纤维,从而在底物可及性上为内切葡聚糖酶的水解糖化作用提供了条件,为真菌内、外切纤维素酶协同降解天然纤维素的作用机制提供了实验支持,并提出了内切纤维素酶的水解作用可为外切纤维素酶吸附纤维素提供能量的推论。     

纤维二糖水解酶I基因的系统进化分析

纤维二糖水解酶I（CBHI）是生物降解纤维素的一种重要的外切酶,它作用于纤维素分子末端,水解β-1,4-糖苷键。纤维二糖水解酶由3个部分组成：具有催化活性的催化结构域,作用为锚定纤维素的纤维素结合域以及连接这两个结构域的一段短肽。已知催化结构域属于糖基水解酶家族7（GH7）,纤维素结合域属于糖类结合模块家族1（CBMl）。为进一步探索CBHI编码基因之间的进化关系,本研究依据CBHI的结构域在GenBank数据库中搜索并鉴定CBHI编码基因并据此构建系统发育树。序列的平均长度为1776bp,平均GC含量为57．64％,平均转换颠换比为0．71,平均遗传距离为0．424。得出结论CBHI编码基因只存在于真菌中,是一个相对活跃的基因,它的进化与物种的进化有着密切的关系。     

天然结晶纤维素的生物合成及其去晶化途径

纤维素是高等植物细胞壁的结构骨架和重要组成成分,由细胞质膜上的纤维素合成酶合成.一个纤维素合成酶亚基合成一根纤维素分子链,多个亚基聚集在一起形成末端复合体(TC),可同时合成多根葡聚糖分子糖链,其在氢键和范德华力作用下快速有序堆积,形成结构紧密的天然微纤丝结晶结构.质膜上有序线性排列的超分子TC合成结晶纤维素Ⅰα,而玫瑰花型排列的TC合成结晶纤维素Ⅰβ.结晶微纤丝的密切有效堆积是植物抗降解的天然屏障.高浓度的酸和离子液体可以在微纤丝间有效扩散,破坏晶体分子链的有序堆积、分子间氢键网络,甚至打断晶体内部的糖苷键,完成天然结晶纤维素的去晶化及解聚过程.酶分子的去晶化过程是发生在微纤丝特定表面上的非均相反应过程,可在常温常压下固或液表面上快速完成,但有效可及表面积是其主要限速瓶颈.因此结合物理、化学方法预处理,低成本高效打破限制酶分子有效扩散的屏障,增加酶分子对结晶纤维素特异性结合的效率和有效可及面积,从而实现天然结晶纤维素高效去晶化及绿色快速降解转化.     

纤维素结合域的研究进展

纤维资源是生物界最为丰富的有机碳源,有效酶解植物纤维资源对于减缓能源枯竭和食品危机具有重要意义。然而,天然纤维素结构上的复杂多样性为酶的攻击和可及带来巨大困难。为了克服这一问题,自然界中能够利用纤维原料的酶大多由相对独立的两种结构域、催化结构域(CD)、纤维素结合结构域(CBM)组成。其中,CBM有助于酶与不溶性底物的结合,在纤维原料酶解中具有重要作用。CBM所具备的特殊的底物特异性不仅对于提高酶与纤维的可及度,增强纤维素酶解效率,揭示纤维素酶解机制具有重要意义,而且应用在基因工程产品的分离纯化,酶制剂的品质改善及细胞固定化等领域也有很好的发展前景。本文就近年来CBM的研究现状及其发展前景进行了综述。     

纤维素酶纤维素吸附区的结构与功能

大多数纤维素酶含有催化区和可与纤维素结合且氨基酸序列较为保守的纤维素吸附区(cellulosebindingdomain,CBD)。纤维素吸附区促进酶与底物的结合,有利于催化区对不溶性底物的作用,但对可溶性底物的催化作用无影响。对CBD结构的研究和进一步的诱变研究揭示:纤维素吸附区是通过几个芳香族氨基酸结合到纤维素表面。有实验证明外切葡聚糖酶的CBD对结晶纤维素有疏解作用。CBD结构域已成功地应用于一系列重组融合蛋白的纯化和固定化。对纤维素吸附区结构与功能的深入了解对进一步了解酶的作用机制,促进纤维素酶类生物技术的发展是重要的 。     

生物质生物预处理研究进展与展望

木质纤维素生物质分布广、产量大、可再生,用于制备生物基能源、生物基材料和生物基化学品。木质纤维素生物质组成复杂,包含纤维素、半纤维素和木质素等,木质素与半纤维素通过共价键、氢键交联形成独特的“包裹结构”,纤维素含有复杂的分子内与分子间氢键,上述因素制约着其资源化利用。生物预处理以其独特优越性成为生物质研究的重要方面。系统阐述了生物预处理过程中木质素降解和基团修饰对纤维素酶解的影响,纤维素含量及结晶区变化,半纤维素五碳糖利用,微观物理结构的改变。进一步提出了以生物预处理为核心的组合预处理、基于不同功能的多酶协同催化体系、木质纤维素组分分级利用和新型高效细菌预处理工艺是生物预处理未来发展的重要趋势。     

瑞氏木霉内切葡聚糖酶Ⅰ及其CBD的噬菌体表面展示系统的构建

为研究纤维素酶的酶活性和吸附特性之间的关系,将瑞氏木霉内切葡聚糖酶Ⅰ(endoglucanaseⅠ,EGⅠ)和其吸附结构域(cellulose-binding domains,CBD)的基因经PCR扩增后,连接到载体pCANTAB5E上,构建成噬菌粒展示载体pCANTAB5E-egⅠ和pCANTAB5E-egⅠ-cbd。将这些噬菌体展示载体转化到大肠杆菌TGⅠ中,在辅助噬菌体M13KO7的帮助下得到重组噬菌体。用ELISA和Somogyi方法分别测定了EGⅠ及其CBD的表面展示噬菌体对纤维素的亲和性和EGⅠ的CMC活性,结果显示EGⅠ及其CBD已功能展示于噬菌体表面。该系统的成功构建为今后利用噬菌体展示的方法进行纤维素酶的酶分子改造提供了基础。     

微紫青霉CBHI酶的CBD蛋白编码区在大肠杆菌中的亚克隆及表达

对插入质粒pUC18－181上的微紫青霉（Penicilliumjanthinellum）CBHI酶的cDNA基因进行一系列DNA体外操作,包括进行序列定向缺失,最后将两末端修饰为平端后进行连接使质粒环化。用得到的产生序列定向缺失的重组质粒转化大肠杆菌JM109。利用CBD能吸附到结晶纤维素上的特性,从随机选取的24个缺失转化子中筛选到一株含CBD编码区的转化子JM109（pUC18C）,所表达的CBD融合蛋白分子量为21kD．JM109（pUC18C）所产生的LacZ-CBD融合蛋白可通过对纤维素的吸附-解吸附过程一步纯化。其IPTG诱导的pNPC酶活力为零,表明该菌已不再具有CBHI酶活力。     

超声波对木质纤维素糖化过程影响的研究

将超声波应用在木质纤维素预处理及其酶解糖化过程中,通过SEM、FTIR研究了处理前后纤维素的形态结构和结晶性能,并考察了不同预处理方式对原料 成分的影响和超声波对酶解糖化率的影响。结果表明,超声波作用能有效的破坏纤维素分子中的氢键,降低其结晶程度,而且能有效地提高木质素的脱除率和酶解糖化率。对超声波作用于酶解过程中的机理进行了初步探讨     

纤维素酶纤维素吸附区的结构与功能

大多数纤维素酶含有催化区和可与纤维素结合且氨基酸序列较为保守的纤维素吸附区（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ,ＣＢＤ）。纤维毒品及附区促进酶与底物的结合,有利于催化区以对溶性底物的作用,但对可溶性底物的催化作用无影响。对ＣＢＤ结构的研究和进一步的诱变研究揭示。纤维素吸附区是通过几个芳香族氨基酸结合到纤维素表面。有实验证明外切莆聚糖酶的ＣＢＤ对结晶纤维素有疏解作用。ＣＢＤ结构域已居功     

纤维素酶解速度的可视化表征与限制因素分析

纤维素酶解效率是木质纤维素高效生物转化的限制瓶颈,利用原子力显微镜(atomic force microscope,AFM)可以在水相中原位可视化表征纤维素酶分子运动行为,分析单个酶分子的运动速度及其影响因素.研究发现,高效降解结晶纤维素酶分子仅结合于特定结晶表面上的特定位点上,通过单方向运动完成逐层降解,过量酶分子结合于特定表面上会导致持续性运动"塞车"现象.结晶微纤丝的降解不仅取决于酶分子运动速度及其糖苷键断裂效率,更取决于酶分子可及底物的晶面大小及其晶面氢键解聚程度.以新结合模式、新运动模式或新组织模式的纤维素酶系或复合体应是纤维素酶研究的重点方向.     

木聚糖酶碳水化合物结合结构域研究进展

木聚糖酶含有催化活性结构域,有时还含有非催化活性结构域,促进酶与底物结合,特别是与不溶性底物的结合及降解,称为碳水化合物结合结构域(CBM),它们在木聚糖降解过程中有重要作用。以下从CBM来源,所属家族类型、对不溶性底物结合特性、与底物结合的特定氨基酸、与催化结构域间的连接肽、特别是对影响木聚糖酶稳定性的5个方面进行了综述,说明CBM对木聚糖酶性质有很大影响。自然界中碳水化合物结构复杂、难以降解,所以认识CBM相关性质对研究其与木聚糖酶的协同作用、提高木聚糖酶活性有重要意义,并根据CBM属性用于改造木聚糖酶相关性质进行了展望。     

草酸青霉中一个膨胀因子基因POX06047的遗传分析

纤维素由于大量纤维素链间氢键的存在形成了很难被纤维素酶降解的微晶纤维素.膨胀因子通过破坏纤维素链间的氢键使纤维素酶能更好地接近和降解底物.草酸青霉(Penicillium oxalicum)HP7-1的基因组中注释为膨胀因子基因有4个,分别为POX01524、POX06047,POX07832和POX08485.其中POX06047被注释为类扩展蛋白(expansin-like)基因,通过结构域分析,POX06047含有一个类内切葡聚糖酶45家族结构域.本研究通过同源重组途径和冻融转化法在草酸青霉ΔPoxKu70菌株中将POX06047基因敲除,成功获得了缺失突变株ΔPOX06047.通过测定缺失突变株在液体产酶培养基下的各种纤维素酶产量和木聚糖酶产量,发现相比于出发菌株ΔPoxKu70,ΔPOX06047 的 CMCase产量和滤纸酶产量没有变化,而木聚糖酶产量、p-NPCase产量和p-NPGase产量均出现了不同程度的下降.将POX06047基因在草酸青霉ΔPoxKu70中进行过量表达,得到过量表达菌株OXPOX06047,检测结果表明,相比出发菌ΔPoxKu70,ΔPOX06047的p-NPCase、木聚糖酶产量有所提高,CMCase、p-NPGase产量有所下降,滤纸酶活力保持不变.     

纤维素酶分子结构和功能研究进展

概述了近10年来利用结构生物学和蛋白质工程技术在纤维素酶分子结构和功能方面研究的进展,包括：酶分子结构域的拆分、催化域和纤维素结合结构域的结构和功能的研究,纤维素酶的分子折叠.并展望了该领域的研究前景.     

内切-1,4-β-葡聚糖酶在植物细胞生长发育中的作用

内切-1,4-β-葡聚糖酶(EGases)可以催化水解具有1,4-β-葡聚糖主链的多聚糖,如纤维素和木葡聚糖分子,从而参与对细胞壁的修饰.植物细胞中存在一个EGase蛋白家族,且多为分泌蛋白;在植物细胞中还存在另一类跨膜EGase,是细胞壁纤维素生物合成所必需的,但植物EGases在体外具有降解纤维素人造底物羧甲基纤维素(CMC)的能力,而绝大多数植物EGases在活体细胞中并不能有效地降解结晶态纤维素分子和木葡聚糖分子.本文就EGases在细胞伸长、果实成熟和组织器官脱落等发育过程中的作用,以及EGases在植物纤维素合成与降解中的作用进行综述.     

真菌和细菌纤维素酶的差别及内、外切葡聚糖苷酶的底物专一性

通常认为纤维素的降解过程,首先是纤维素酶（纤酶）分子吸附到纤维素表面,然后,内切葡聚糖苷酶（内切酶）在葡聚糖链的随机位点水解底物,产生寡聚糖;外切葡聚糖苷酶（外切酶）,从葡聚糖链的非还原端进行水解,主要产物为纤维二糖,需要两类酶的"协同"才能完成对纤维素的降解。纤维素酶分子由催化结构域（ｃａｔａｌｙｔｉｃｄｏｍａｉｎ,ＣＤ）、纤维素结合结构域（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ－ｂｉｎｄｉｎｇｄｏｍａｉｎ,ＣＢＤ）和一个连接桥（ｌｉｎｋｅｒ）三部分组成。近年来,纤维素酶分子结构与功能的研究取得了实质性的进展。不同…     

嗜热厌氧细菌Caldicellulosiruptor bescii降解木质纤维素研究进展

嗜热厌氧菌Caldicellulosiruptor bescii具有强大的木质纤维素降解能力,能以多种模式植物细胞壁多糖如微晶纤维素Avicel和木聚糖,甚至未经预处理的木质纤维素如柳枝稷作为唯一碳源快速生长,该菌还具有少见的厌氧降解木质素的能力。对基因组注释发现,该菌所编码的蛋白大多为多结构域双功能酶,即在多肽链的N端和C端分别是不同家族的糖苷水解酶,间隔以2-3个碳水化合物结合结构域。该菌降解纤维素相关的酶基因多集中于一个植物细胞壁多糖降解利用的基因簇,例如纤维素酶/木聚糖酶、纤维素酶/甘露聚糖酶和纤维素酶/木葡聚糖酶等。C.bescii的木聚糖酶主要属于GH10家族,该家族的酶底物特异性较为宽泛,氨基酸序列的同源性在18.7%-59.5%间。Caldicellulosiruptor属细菌进化出了一系列的机制使得糖苷水解酶和底物、细菌和木质纤维素能更好的吸附在一起,从而有利于木质纤维素的酶解。C.bescii有12个含SLH结构域的蛋白,以及新发现的黏附蛋白Tāpirin,可能参与了木质纤维素的吸附与利用。综述了近年来对C.bescii降解植物细胞壁的糖苷水解酶的基因资源挖掘方面和降解分子机制方面的研究进展,对高效、多功能高效木质纤维素降解酶的设计和优化具有积极的意义。     

土壤矿物与微生物相互作用的机理及其环境效应

土壤矿物与微生物相互作用是地球表层系统中重要的生态过程.微生物或生物分子与矿物间的吸附(粘附)是两者相互作用的基础.吸附(粘附)是一个由分子间力、静电力、疏水作用力、氢键和空间位阻效应等多种作用力或作用因素共同决定、影响的物理化学过程.因此,微生物和矿物的表面性质如表面电荷、疏水性和它们所处的环境条件如pH、电解质浓度、温度等,都影响着矿物-微生物吸附(粘附)过程.微生物细胞或酶可吸附于矿物表面,其结果是细胞代谢或酶活性会发生明显变化,并进一步影响土壤中诸多相关的生态、环境过程.结合4种典型的初始吸附理论:表面自由能热力学理论、DLVO理论、吸附等温线理论和表面复合物理论及本课题组近年来的研究成果,对土壤矿物与微生物相互作用的类型、机理、作用力和现代研究技术等方面的最新研究进展进行了较为全面的论述,对土壤矿物-微生物相互作用的环境效应进行了讨论,并就该领域今后研究工作的特点及应关注的问题进行了展望.     

瘤胃中木质纤维素降解菌及降解酶基因的研究进展

摘要：反刍动物瘤胃是公认的木质纤维素高效降解的天然反应器,对瘤胃微生物的研究成为开发生物能源的热点领域之一。其研究手段已经从传统的依赖分离培养从瘤胃中获得木质纤维素降解菌,并对降解菌中的木质纤维素降解酶逐一分析,发展到通过基因组/元基因组技术,直接从瘤胃中发现获得大量新的木质纤维素降解酶基因/基因簇,进而探讨其降解的分子机理。已有的研究结果表明,瘤胃微生物降解木质纤维素的过程非常复杂,其中涉及到大量不同种类的微生物、酶及基因/基因簇,随着新分析技术的建立和完善,对这些微生物、酶和基因的研究已取得了诸多进展。本论文综述报道了近期有关该方向的研究进展。