MSAP荧光检测初始数据的自动分析研究

目的:建立能够实现甲基化敏感扩增多态性(MSAP)荧光检测初始数据自动分析的方法。方法:以17周龄的北京油鸡为实验材料,应用荧光标记的MSAP方法对肌肉组织基因组DNA甲基化水平进行检测,对获得的MSAP荧光检测初始数据通过直接取整法、整区间放置法和半区间放置法等3种计算机处理方法进行分析和比较。结果:对于MSAP荧光检测初始数据的自动转换,半区间放置法与标准的人工转换方法最接近(P0.05),整区间放置法次之(P0.05),而直接取整法与标准的人工转换方法差异最大,达到显著水平(P0.05)。结论:整区间放置法和半区间放置法适用于MSAP荧光检测初始数据的自动分析,建立了基于半区间放置法的在线自动分析软件MSAP Analyst,可实现MSAP荧光检测初始数据的自动分析。     

MSAP技术及其在植物上的应用

DNA甲基化在植物的很多生命过程中具有重要作用,检测DNA甲基化的技术应运而生。依据对DNA甲基化敏感程度不同的同裂酶,在AFLP技术的基础上发展而来的MSAP技术可以方便的检测全基因组范围内胞嘧啶甲基化模式及程度。该文对MSAP技术的原理、特点、基本程序及应用进行了阐述。     

喜旱莲子草MSAP分析技术反应体系的建立

目的：建立一个适于研究喜旱莲子草DNA甲基化的MSAP分析体系。方法：以喜旱莲子草为材料,采用改良CTAB法提取基因组DNA,并对影响MSAP分析的关键步骤包括基因组DNA酶切反应时间、模板DNA连接产物稀释倍数、预扩增产物稀释倍数等进行了优化。结果：改良CTAB方法提取的DNA质量较好,酶切反应时间5h,酶切连接产物稀释10倍进行预扩增,预扩产物稀释10倍进行选择性扩增,所得PCR产物经6%聚丙烯酰胺电泳,条带清晰可辨,并能有效检测喜旱莲子草基因组DNA甲基化的程度和状态。结论：为研究喜旱莲子草表观遗传适应机制奠定了基础。     

长白猪×蓝塘猪及其杂种基因组甲基化片段克隆与分析

应用甲基化敏感扩增多态性(MSAP)技术对6头长白公猪和50头蓝塘母猪及5头长白×蓝塘杂交F1代3个群体基因组DNA胞嘧啶甲基化位点进行检测,旨在克隆和分析父母代猪及其杂种F1代之间基因组DNA共同甲基化片段和差异片段,并找到其同源基因.结果显示,从MSAP条带中分离、克隆得到18条3个群体共同的甲基化片段、10条母代独有的甲基化片段和9条杂交一代独有的甲基化片段,其中有1条3个群体共有的甲基化片段通过EST拼接和电子延伸后在NCBI数据库中找到同源基因,即猪类酪氨酸蛋白激酶Lyn基因(GeneID:LOC100152890,序列号:XM_001926250).结果表明,长蓝杂交F1代与其父母代之间的基因组甲基化存在异同,为通过MSAP技术克隆猪基因组DNA甲基化片段及寻找其对应的甲基化基因提供可能,也会为将来研究这些甲基化基因表达调控机制奠定基础.     

镉胁迫下萝卜基因组DNA甲基化敏感扩增多态性分析

应用甲基化敏感扩增多态性(MSAP)技术分析了重金属镉(cd)胁迫处理后萝卜基因组DNA甲基化程度的变化。结果表明,经50、250和500mg/L CdCl_2处理后,MSAP比率分别为37%、43%和51%,均高于对照(34%);全甲基化率(双链C~mCGG)分别为23%、25%和27%,而其对照为22%,表明重金属CdCl_2胁迫后,某些位点发生了重新甲基化。萝卜叶片DNA中总甲基化水平的增加与CdCl_2处理浓度呈显著正相关。甲基化变异可分为重新甲基化、去甲基化、不定类型以及与对照相同的甲基化模式等类型,Cd胁迫处理引起的植株基因组DNA甲基化程度的提高主要是重新甲基化。     

运用MSAP技术测定谷子基因组DNA胞嘧啶甲基化水平

DNA甲基化是真核生物一种重要的表观修饰形式。为了探讨谷子基因组DNA胞嘧啶甲基化的水平和模式,以谷子Setaria italica的两个品种朝谷58号和豫谷1号为实验材料,利用Eco RⅠ和HpaⅡ/MspⅠ双酶切建立适合于谷子基因组的甲基化敏感扩增多态性(MSAP)分析体系。结果表明,从100对MSAP选扩引物中,筛选出32对MSAP引物组合,在朝谷58号和豫谷1号中分别扩增产生1 615、1 482条清晰可辨且可重复的DNA条带,其中包括3种类型的甲基化条带,朝谷58号和豫谷1号的基因组中CCGG序列胞嘧啶甲基化水平分别为6.93%和8.77%。这种谷子不同品种间甲基化水平和分布位点的差异为从表观遗传学的角度培育新品种提供了初步的理论依据和参考。     

MSAP技术及其在植物遗传学研究中的应用

DNA甲基化是表观遗传学的重要组成部分,在调节植物基因表达、生长发育和抵御逆境等方面起着重要作用.随着对DNA甲基化研究的不断深入,基于PCR检测DNA甲基化状态的技术DNA甲基化敏感扩增多态性(MSAP)由于其检测多态性高,操作简单等优点被广泛应用于植物种质资源鉴定、植物改良、种群遗传结构分析及植物进化研究等遗传学各个领域.该文综述了MSAP技术的原理、实验方法以及其在植物遗传学研究中的应用,并对其今后应用前景进行了展望.     

氮胁迫下高羊茅基因组DNA甲基化的MSAP分析

高羊茅是一种重要的禾本科牧草,尽管其具有良好的耐寒耐热性,但其生长发育过程受外界氮素浓度的直接影响。DNA甲基化作为一种表观遗传调控方式在植物抵御逆境胁迫中起到至关重要的作用。本研究以高羊茅为试验材料,经无氮胁迫15 d后,以未经氮胁迫为对照,对基因组DNA甲基化的变化进行甲基化敏感扩增多态性(MSAP)分析。结果表明:无氮处理15 d后,植株生长受到强烈地抑制,且叶片大面积发黄;MSAP分析选用12对选扩引物,共检测到725个基因位点,其中发生甲基化和去甲基化的位点占16.4%;对照组和氮胁迫组总甲基化水平分别是65.56%和65.47%,显示氮胁迫15 d高羊茅基因组DNA总的甲基化水平未发生显著变化。对15条标记带进行克隆并测序,成功获得14条不同变化类型的序列,这些序列与禾本科植物具有较高的同源性,推测氮胁迫下的高羊茅基因组甲基化可能发生在编码区域。综上,高羊茅对环境的适应性调节可能与氮胁迫诱导的甲基化的变化有关。     

一种快速高效的全基因组甲基化CpG岛富集方法的建立

高甲基化的CpG岛所致基因表观遗传学转录失活已经成为肿瘤表观基因组学研究的重要内容。现在已有很多检测CpG岛甲基化的方法,但由于各自的局限,还没有建立一种能快速在全基因组水平上进行甲基化CpG岛的富集方法。本研究利用甲基化结合蛋白MBD2b具有特异性结合甲基化DNA的特性, 建立了一种基于DNA免疫共沉淀技术的全基因组甲基化CpG岛的富集方法。在大肠杆菌中表达重组的GST-MBD2b蛋白,通过Glutathione Sepharose 4B对重组蛋白进行纯化,制备成亲和层析柱,利用在不同的盐离子强度下甲基化DNA和非甲基化DNA的结合能力不同,对甲基化DNA进行富集。用甲基化酶SssI处理过的DNA片段与非甲基化DNA片段进行富集效率的检测,发现0.5M KCl的浓度是甲基化DNA片段和非甲基化DNA片段得以分开的临界条件。样品的富集效率用Real Time PCR进行检测。结果表明,这种方法能够实现对全基因组甲基化DNA的有效富集且最高的富集倍数可达到100多倍。富集到的甲基化DNA可以进行后续的定量PCR, DNA测序和全基因组芯片的分析等工作,为大规模分析全基因组CpG 岛甲基化的改变奠定了基础。     

盐胁迫下棉花基因组基于毛细管电泳的MSAP分析

以棉花杂交种中棉所29为材料,用甲基化敏感扩增多态性(methylation sensitive amplification polymorphism,MSAP) 分析法结合毛细管电泳检测技术进行甲基化鉴定,以初步探讨棉花耐盐的分子机理．应用24个引物组合,中棉所29在0.4%盐水胁迫及清水对照下,平均每引物组合检测甲基化位点数分别为69.2和56.7,差异达显著水平．盐胁迫下的DNA甲基化水平与清水对照下相比,52.6%位点表现出甲基化水平提高,即发生了超甲基化;19.7%位点甲基化水平降低,即表现为次甲基化;二者差异达极显著水平．研究结果表明,中棉所29盐胁迫后发生了广泛的DNA甲基化变化,包括超甲基化和次甲基化,以及其它甲基化类型的转变|发生超甲基化位点极显著地多于发生次甲基化位点．盐胁迫下的中棉所29与对照相比,DNA总体甲基化水平显著提高,暗示中棉所29有提高基因组甲基化水平以应对盐胁迫的潜在机制,棉花基因组整体甲基化水平的提高可能与棉花对盐胁迫的耐受性起重要作用．本研究中,甲基化序列的初步克隆及比对分析表明,盐胁迫前后多个ATP合成相关基因甲基化程度维持在同一水平,其表达不受甲基化影响,这也可能是中棉所29耐盐性较强,在一定时间盐处理后能维持正常生长的原因之一．     

MSAP技术在植物抗逆性方面的应用

DNA甲基化在植物的生长发育中起着重要的作用。近年来,随着对DNA甲基化研究的重视,基于PCR方法检测DNA甲基化水平的甲基化敏感扩增多态性技术(MSAP)得到广泛的应用。综述了MSAP技术在植物的生物与非生物胁迫研究方面的应用。     

烟粉虱全基因组DNA四种提取方法的比较

获得大量、高质量的全基因组DNA是在DNA水平上研究许多生物的分子机制的基本前提。微小昆虫由于其体型微小,单头提取DNA浓度低,无法满足部分试验所需。为寻找一种方便、快捷、高效的全基因组提取方法,参考国内外单头微小昆虫基因组DNA提取常用方法,以烟粉虱为研究材料,选取醋酸钾(KAc)法、盐析法、氯仿-异戊醇法和苯酚提取法四种方法进行多头烟粉虱的全基因组DNA提取。通过微量核酸蛋白分析仪、基因组DNA直接琼脂糖凝胶电泳、甲基化敏感扩增多态性(Methylation sensitive amplification polymorphism,MSAP)引物扩增产物的琼脂糖凝胶电泳对DNA样品进行检测,比较提取DNA的产量、质量,并综合分析各提取方法所需时间及所用试剂的毒性大小。结果表明,盐析法提取的DNA平均浓度为521 ng/μL,纯度能满足分子检测要求,用MSAP引物能得到较好的扩增结果,相比其它方法,盐析法更简便、快速且无毒。因此盐析法是多头烟粉虱全基因组DNA提取的最佳方法。     

叶锈菌胁迫下的小麦基因组MSAP分析

内源DNA甲基化是真核生物表观遗传调控的重要组成部分, 在真核生物的基因表达调控中具有重要的作用。生物胁迫为植物提供一种内在的表观遗传进化动力。研究生物胁迫下DNA甲基化的变异模式, 有助于全面理解DNA甲基化的表观调控生物学功能。小麦近等基因系TcLr19、TcLr41及其感病亲本Thatcher在苗期对叶锈菌生理小种THTT、TKTJ分别表现为小种特异性抗病反应和感病反应。文章利用甲基化敏感扩增多态性(Methylation-sensitive amplified polymorphism, MSAP)技术分析了小麦的甲基化水平, 同时比较了苗期在生物胁迫前后基因组DNA胞嘧啶甲基化模式。用60对MSAP引物对接种前后的小麦DNA进行全基因组筛选, 没有直接分离得到接菌前后的甲基化模式的差异, 结果初步表明, 叶锈菌并没有诱导稳定且特异的植物基因组DNA胞嘧啶位点的甲基化模式变化, 但发现TcLr41及其感病亲本Thatcher之间存在表观遗传学差异。     

红豆杉脱分化过程中的遗传和表观遗传变异

采用扩增片段长度多态性（AFLP）和甲基化敏感扩增多态性（MSAP）技术分析红豆杉脱分化前后基因组DNA和DNA甲基化状态的变化。选用32个AFLP引物组合从红豆杉植株及其愈伤组织分别扩增出1834个片段,无多态性片段产生。这说明红豆杉植株在诱导形成愈伤组织的过程中基因组DNA保持高度的遗传稳定性。另用32个MSAP引物组合从红豆杉植株及其愈伤组织分别扩增出1197个片段,总扩增位点的甲基化水平由脱分化前的12．4％上升为16．2％,表明红豆杉在脱分化过程中的某些位点发生了甲基化。红豆杉脱分化前后的DNA甲基化模式也存在较大差异,说明DNA甲基化对愈伤组织形成有调控作用。     

中华绒螯蟹两种微卫星DNA分型方法的应用比较

为对比荧光标记毛细管电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳在微卫星等位基因分型上的效果,试验选择6对微卫星引物,对60个中华绒螯蟹个体基因组DNA进行PCR扩增,荧光标记法共检测出等位基因129个,平均每个位点21.5个等位变异,聚丙烯酰胺凝胶电泳共检测出等位基因174个,平均每个位点29个等位变异。对位点Esin67的PCR产物分别进行重复检测,发现荧光标记法的重复率为100%,而聚丙烯酰胺凝电泳法两次结果存在较大差异,证实了荧光标记法检测的可靠性显著高于聚丙烯酰胺凝胶电泳。对两种方法的检测效率和经济成本的分析表明,荧光标记法虽然成本较高,但效率高于聚丙烯酰胺凝胶电泳法。建立单重PCR的多重毛细管电泳技术是提高效率、降低成本的有效途径。     

利用 MSAP 分析18个芥蓝齐口期的表观遗传多样性

本研究利用MSAP检测18个芥蓝齐口期DNA甲基化水平,分析了表观遗传多样性,探讨DNA甲基化模式对齐口期的影响。结果表明,18个芥蓝齐口期平均为50d,叶片数平均为10片,齐口期和叶片数不相关(相关系数为0.296);变异系数分别为21%和18%;遗传距离分布在0~40,平均值为12.2276,在10.62处分为3类。MSAP分析表明,5对引物组合扩增得到432条多态性条带,201条片段表现出多态性,多态性比率为47%;Nei遗传距离分布在0.004~0.467,平均值为0.0958,表明遗传多样性水平较低;在0.04处分为3类。Mantel测验表明两种分析的遗传距离相关系数为-0.1366,显示齐口期、叶片数与DNA甲基化多态性没有相关性。DNA甲基化模式分析表明,非甲基化片段为110条,甲基化多态性片段为322条,分为3种带型,类型一为非甲基化带型(110条),类型二为甲基化带型(110条),类型三为半甲基化带型(152条),非甲基化片段和半甲基化片段在不同品种之间呈现多态性,甲基化片段在不同品种之间呈现多态性与单态性相差不大,显示MSAP多态性主要来源于非甲基化和半甲基化片段,芥蓝甲基化模式以半甲基化为主。本文推测DNA甲基化水平降低参与芥蓝齐口期调控,MSAP分析既可用于基因组结构研究,又可用于基因组水平上性状的功能研究。     

焦磷酸测序技术及应用

焦磷酸测序（pyrosequencing）技术是一种新的DNA序列分析技术,其特点是操作简便、大通量、自动化,适合大量样本的快速检测,无须进行电泳、DNA序列无须荧光标记等,是一个理想的遗传分析技术平台.文章对焦磷酸测序技术原理及近年来在单核苷酸多态性研究、微生物鉴定分型和DNA甲基化等方面的应用作一简要综述.     

高温胁迫下水稻基因组DNA表观遗传变化MSAP分析

目的:研究高温胁迫对水稻基因组DNA甲基化变化的影响,筛选出一批与高温胁迫的相关基因,研究DNA基因化与基因转录水平之间的关系。方法:在人工气候箱子中,对四叶期的水稻幼苗进行38度高温处理,分别取0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、16 h和24 h七个不同时间点的幼叶提取DNA与RNA,利用MSAP技术检测总甲基化水平变化,RT-PCR检测相关基因的转录本的表达量变化。结果:与对照组0 h幼叶相比,高温处理下的2 h、4 h、8 h、12 h、16 h和24 h幼叶的总体甲基化水平依次是37.14%、36.79%、36.00%、35.50%、35.43%、34.64%和34.57%,可知幼叶DNA甲基化水平在高温处理后不断降低。此外,RT-PCR结果显示筛选的两个与甲基化相关的基因(PP2C和RAFP)的转录水平与甲基化水平呈负相关。结论:基因组甲基化作为一种重要的表观遗传调控方式,可以通过调控相关的基因的表达量水平来防御高温胁迫。     

孝顺竹开花过程中DNA甲基化水平动态研究

以孝顺竹为材料,利用HPLC和MSAP技术在其未开花至开花的生长过程中进行甲基化水平的检测,分析竹子开花过程中基因组DNA甲基化的动态,以揭示DNA甲基化水平与竹子开花现象的相关性。结果显示:(1)孝顺竹基因组DNA甲基化率在不同的时间处于动态变化中,进入开花状态的孝顺竹植株其甲基化水平极显著低于开花竹丛中未开花植株和未开花竹丛;开花和未开花植株的总甲基化率分别为9.00%和12.42%,全甲基化率分别为5.06%和7.53%。(2)MSAP位点中有66.83%的位点在开花和未开花材料中甲基化状态保持一致,33.17%的位点在开花和未开花植株中发生甲基化变化:其中22.28%的位点在开花植株中发生完全的去甲基化,1.98%的谱带在开花植株中发生甲基化,8.91%的位点在开花和未开花材料中甲基化水平呈现上升或降低的趋势。研究表明,开花的孝顺竹同时发生甲基化和去甲基化,但发生去甲基化的概率明显大于发生甲基化的概率,最终导致其甲基化水平极显著降低。     

铜胁迫对拟南芥幼苗生长和基因组DNA甲基化的影响

通过Murashige and Skoog(MS)培养实验,利用甲基化敏感扩增多态性(methylation-sensitive amplified polymorphism,MSAP)技术研究Cu2+胁迫对拟南芥幼苗基因组DNA甲基化水平与甲基化模式的变化,同时比较其与幼苗鲜重、根系生长对Cu2+胁迫的敏感性。结果表明:0、0.25、1.0 mg獉L-1Cu2+处理15 d后,幼苗根长及鲜重变化差异不显著,而幼苗基因组MSAP率随Cu2+浓度的增加呈先增高后降低的趋势,分别为15.93%、16.28%和15.83%;高浓度Cu2+胁迫下(3.0 mg獉L-1),根长显著变短,鲜重显著降低,MSAP率为14.26%;Cu2+胁迫(0.25~3.0 mg獉L-1)下,拟南芥幼苗基因组超甲基化(M型)位点及去甲基化(D型)位点数均呈显著增加趋势,Msp I酶较Hpa II酶对胁迫反应更敏感。因此,拟南芥幼苗MSAP变化对低浓度Cu2+胁迫响应敏感,可作为Cu污染的早期诊断和生态风险评价。