家蝇变形期抗菌蛋白的提取

目的:分离纯化家蝇变形期体内抗菌蛋白并分析其抑菌作用。方法:对家蝇（Ｍusca domestica）5日龄幼虫进行针刺诱导,并于24h后挑取变形后的蛹,通过研磨、调酸、加热提取蛹体内的耐热水溶总蛋白,经过两步CM sepharose F.F.离子交换层析分离,以金黄色葡萄球菌作指示菌,检测其抑菌活性,并用SDS PAGE不连续电泳检测蛋白质的分子量。结果:经两步离子交换分离后,得到一种对金黄色葡萄球菌具有较强抑菌活性的蛋白,经SDS PAGE检测为单一条带,其分子量为43kDa。结论:家蝇处于变形期时,经过诱导后体内能产生一种抑菌活力较强的蛋白质。     

家蝇幼虫抗菌肽的超声诱导及分离纯化和活性研究

目的:分离纯化家蝇(Musca domestica)幼虫免疫血淋巴中的抗菌肽,研究抗菌肽的性质和抑菌特性.为进一步研究家蝇幼虫抗菌肽的产生及应用提供实验基础.方法:通过超声处理诱导家蝇幼虫产生免疫血淋巴,经沸水浴热变性,结合高速离心,两步CM-Sepharose离子交换层析,冷冻干燥浓缩等步骤,分离得到一种具抗菌活性的蛋白质.用Tricine-SDS-PAGE鉴定抗菌肽的纯度和性质,抑菌试验分析抗菌肽的抑菌特性.结果:300W,50Hz超声处理60s能够诱导家蝇幼虫产生抗菌肽,经分离纯化后Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳结果显示为一条带,相对分子量大约为5.8kD.纯化蛋白对阴沟肠杆菌,绿脓杆菌等G-杆菌的抑菌活性较强,而对金黄色葡萄球菌效果不显著.结论:诱导和纯化了一种家蝇幼虫抗菌肽,为此类活性物质的分离纯化提供了有效的方式.     

棉铃虫幼虫抗菌肽的初步研究*

棉铃虫(Heliothisarmigera)五龄幼虫经大肠杆菌、金黄色葡萄球菌混合菌诱导后,产生抗菌肽,经100℃热处理15min后活性不变,通过琼脂糖孔穴扩散法测定,对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌以及真菌都具有很强的抑菌活性。CM-Sepharose离子交换层析粗纯化产物经SDS-PAGE测定,其分子量约3kD。     

Isolation and purification of small antimicrobial peptide from larvae of mealworm, Tenebrio molitor

昆虫抗菌肽具有良好的抑菌效果,有望开发成新一代抗生素.本文以金黄色葡萄球菌和大肠杆菌混合液作为诱导源,采用针刺法使黄粉虫Tenebrio molitor L.幼虫感染微生物产生抗菌肽,并对抗菌肽进行了提取、色谱分离纯化及抑菌活性检测.结果显示,诱导组和对照组的三氟乙酸粗提物无抑菌活性;经SephadexG50、Superdex Peptide凝胶色谱分离后,从诱导组和对照组均可获得对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌有抑菌作用的组分,而且诱导组活性明显高于对照组;通过Resource 15RPC反相色谱分离纯化,从诱导组获得一具有明显抑制革兰氏阳性菌的组分,质谱检测该组分为混合肽,主要由分子量为1 876.21u、1 904.21u的小肽组成,可能是一种比Thanatin分子量更低的昆虫抗菌肽.     

一种蚯蚓体腔液蛋白的分离纯化及其生物活性

赤子爱胜蚓体腔液含有多种蛋白并具有广泛的生物学活性,本研究采用6 V电压刺激蚯蚓分泌体腔液,通过离心、超滤分离得到蚯蚓体腔液蛋白粗品;然后将蛋白粗品经过凝胶层析和离子交换层析纯化,得到一种蚯蚓体腔液蛋白。以离子交换色谱分离到的蚯蚓体腔液蛋白样品为受试样品,紫外光谱扫描显示该蛋白在280nm处有最大吸收峰,SDS-PAGE凝胶电泳测定其分子量约为38.6 KDa,比浊抑菌试验结果显示低浓度受试样品作用大肠杆菌1 h出现抑制效果,作用金黄色葡萄球菌3h出现抑制效果,表明该样品具有一定抑制细菌生长的活性,此外,该蛋白还具有较强的溶解鸡红细胞的作用,溶解红细胞的最低浓度为0.39μg/mL,提示此蛋白的生物活性可能是通过破环细胞结构而实现的。     

海水小球藻抗菌蛋白的分离纯化及性质研究

海水小球藻(Chlorella pacifica)提取液经硫酸铵沉淀、DEAE-52离子交换层析和SephadexG-200凝胶过滤层析后分离纯化出1种抗菌蛋白.经SDS-PAGE测定,两个亚基的相对分子量分别为61 kD和70 kD;该抗菌蛋白对热稳定,氨基酸组成分析表明含17种氨基酸,其中谷氨酸的含量最高,其次为甘氨酸与天冬氨酸,胱氨酸的含量最低.在抗菌活性中,纯化的蛋白质对产黄青霉(Penicillium chrysogenum)和中华根霉(Rhizopus chinensis)有较强的抑制作用,对金黄色葡萄球菌(staphy lococcus aureus)和肠炎病病原菌(Ameromonas punctata)也有抑制作用,其抗真菌活性比抗细菌强.     

黄粉虫幼虫小分子量抗茵肽的分离纯化

昆虫抗菌肽具有良好的抑菌效果,有望开发成新一代抗生素。本文以金黄色葡萄球菌和大肠杆菌混合液作为诱导源,采用针刺法使黄粉虫TenebriomolitorL．幼虫感染微生物产生抗菌肽,并对抗菌肽进行了提取、色谱分离纯化及抑菌活性检测。结果显示,诱导组和对照组的三氟乙酸粗提物无抑菌活性;经SephadexG50、SuperdexPeptide凝胶色谱分离后,从诱导组和对照组均可获得对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌有抑菌作用的组分,而且诱导组活性明显高于对照组;通过Resource15RPC反相色谱分离纯化,从诱导组获得一具有明显抑制革兰氏阳性菌的组分,质谱检测该组分为混合肽,主要由分子量为1876．21u、1904．21u的小肽组成,可能是一种比Thanatin分子量更低的昆虫抗菌肽。     

家蝇幼虫血淋巴中抗真菌肽的诱导方法比较及抗真菌活性

以未诱导组作为空白对照研究比较真菌诱导、超声诱导和热诱导家蝇Musca domestica 幼虫血淋巴初提液的抗真菌肽效果,比较各种诱导方法诱导后的幼虫存活率;用凝胶层析法和高效液相分离纯化热诱导家蝇3龄幼虫抗真菌肽,检测其抗白假丝酵母菌Candida albicans和新生隐球菌Cryptococcus neoformans活性;SDS-PAGE分析抗真菌肽的蛋白分子量范围。结果表明：3种诱导方法诱导后家蝇幼虫均产生具有明显抗真菌作用的抗真菌肽,其初提液抑菌圈大小没有明显差别;真菌诱导组和热诱导组幼虫存活率低于对照组,而超声诱导组与对照组相比则无明显差别。经分离纯化后,抗真菌肽仍具有较好的抗真菌活性;SDS-PAGE分析表明该抗真菌肽有效成分的蛋白分子量在14.4 kD以下。结果提示热诱导家蝇幼虫产生抗真菌肽是一种方便、有效的诱导方式。     

坛紫菜（Porphyra Haitanensis）中抑菌活性肽的制备与初步纯化

目的:提取坛紫菜中水溶性蛋白,并对其进行初步纯化和抑菌活性影响因素研究。方法:坛紫菜水溶性蛋白胃蛋白酶在37℃、pH1.8条件下酶解3h,再经超滤、Bio-Gel P-10和DEAE Sephadex A-50层析纯化步骤得到一定分子量范围的多肽混合物。采用平板打孔法和对金黄色葡萄球菌的抑制作用,跟踪测定活性多肽纯化过程及其活性影响因素。结果:SDS-PAGE测定结果表明该抗菌多肽分子量介于43.0KD~66.2KD之间。它对金黄色葡萄球菌生长的抑制作用随着温度的升高逐渐减弱,5%EDTA、5%柠檬酸、5%维生素C及25%二甲基亚砜对它的抑菌活性有协同作用,而5%维生素E则对它的抑菌活性有拮抗作用。结论:从坛子菜水溶性蛋白中初步纯化得到的分子量介于43.0KD~66.2KD的多肽,对金黄色葡萄球菌的生长有明显地抑制作用,并且它的抑菌活性受到温度,部分有机酸和维生素的影响。     

LfcinB突变基因在大肠杆菌中的融合表达及其活性测定

测定LfcinB突变基因(mLfcinB)在大肠杆菌中的融合表达及其表达产物的抗菌活性。对LfcinB基因突变后进行克隆并测定序列,mLfcinB基因融合表达载体构建后并在大肠杆菌中的表达,分离提纯表达物并测定其活性。结果显示,Lf-cinB突变基因克隆后表达产物在经SDS-PAGE电泳,考马斯亮蓝G250染色可在29kD处看到预期的融合蛋白条带;对照组空质粒pGEX-4T-1经相同条件诱导后表达的蛋白为26kD。通过抑菌试验发现其对金黄色葡萄球菌ATCC25938具有较强抗菌活性。表明mLfcinB基因表达物具有较强的抗菌作用。     

弱酸性家蝇蛆抗菌肽MD7095的分离纯化及性质研究

家蝇抗菌肽多是碱性蛋白,目前尚无弱酸性家蝇抗菌肽的报道。通过稀醋酸低温浸提,海藻酸吸附,稀盐酸低温洗脱、盐析、Sephadex G25凝胶过滤和CMC23弱阳离子交换柱层析等方法,利用灵敏的杀菌活性检测手段,从家蝇蛆(Musca domesticalarvae)中分离纯化出一组弱酸性抗菌肽,对苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)等革兰氏阳性菌和几种革兰氏阴性菌有强烈的杀灭作用,有极强的耐热、耐冻融的特性。通过电洗脱方法进一步纯化出抗菌肽MD7095,质谱测定其分子量7095Da,IEF电泳测得其等电点5.59,经肽质量指纹谱(PMF)鉴定为一新肽。扫描电镜超微结构观察表明,弱酸性家蝇蛆抗菌肽对苏云金芽孢杆菌的杀菌机制主要是使细胞膜穿孔,内容物外泄,最终使细菌完全解体死亡。     

家蝇抗菌肽的抑菌动力学研究及其机理初探

利用鼠伤寒沙门氏菌针刺诱导家蝇幼虫表达抗菌肽,对抗菌肽的抑菌动力学进行研究,并通过抗菌肽样品对不同细菌动力学特性的研究出发对抗菌肽抑菌作用机制进行探讨。研究发现抗菌肽样品的活性与作用时间有关,24h内出现一到两个活性峰,同一抗菌肽样品对不同细菌的抑菌动力学有差异,抗菌肽的抑菌动力学机制应该与它的的抑菌作用机制有关。通过电镜观测、细胞磷代谢、紫外吸收物测定以及抗菌肽与细菌DNA相互作用结果可知,微生物诱导家蝇表达的抗菌肽样品不仅能够造成细菌细胞的快速坍塌破裂而且能够破坏细胞核心,与DNA结合作用。抗菌肽抑菌动力学的解释：微生物诱导产物中含有两类抗菌肽,一类抗菌肽能造成细胞膜的快速坍塌破裂形成第一个活性峰;另一类抗菌肽可进入细胞,破坏细胞核心,造成紫外吸收物大量外泄形成第二个活性峰。     

Preliminary studies on the zinc-induced metallothionein protein with antibacterial activity in housefly larvae, Musca domestica

Three isoforms of metallothionein protein induced with Zinc were isolated and purified from housefly larvae, Musca domestica, by gel filtration on Sephadex G-75, G-25 and anion exchange on DEAE-52 chromatography. Among them, one was found to possess antibacterial activity, and was further characterized by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, sulphydryl group determination, enzyme hydrolysis, and spectra property. Our results showed that the novel protein has the characteristics of heat-stable, low-molecular weight (6 kDa), rich-cysteine (approximately 12 cysteine residues in one molecule), metal affinity, and antibacterial activity. This paper was the first to report that metallothionein had antibacterial activity. We expect that this characteristic would give some help to investigate definite physiological functions of metallothionein.     

家蝇幼虫体内一种抗菌蛋白的分离纯化

30%H2O2诱导家蝇幼虫90min,继续饲喂24h后利用硫酸铵分级盐析、Sephadex G-25 和Sephadex G-75两步凝胶过滤、CM-Sepharose Fast Flow弱阳离子交换的纯化方法,得到一种电泳纯的抗菌蛋白,经过VDS凝胶扫描得到其分子量为28kDa,命名为AP28。抑菌活性分析表明,AP28对实验中涉及的大多数革兰氏阳性菌和阴性菌都有明显的抑制作用。     

不同提取工艺对家蝇幼虫蛋白粗提液抗菌活性的影响

利用不同条件提取诱导过的家蝇Musca domestica 3龄幼虫的总蛋白,并用平板扩散法测定所得蛋白粗提液的抗菌活性。结果表明,收集幼虫时的处死温度、沸水浴时间及提取液的pH值均对家蝇幼虫粗提液的抗菌活性有明显的影响。     

家蝇幼虫壳聚糖的抑菌活性及影响因子

为研究昆虫壳聚糖的抑菌活性及影响因子, 由家蝇Musca domestica幼虫制备了10个不同分子量的壳聚糖,在不同条件下分别对6种细菌作抑菌实验, 并通过测定细菌细胞膜和细胞壁的透性初步探讨了壳聚糖的抑菌机理。结果表明,分子量在21～251 kD的壳聚糖有很强的抑菌活性,抑菌活性呈现随pH的降低而增加的趋势,pH 5.5时最低抑菌浓度在0.03％～0.06%之间,Ca²⁺和Mg²⁺能够显著降低壳聚糖的抑菌作用。通过对实验结果的方差分析表明,壳聚糖的不同分子量、pH值和金属离子等外界因素都是壳聚糖抑菌活性的极显著影响因素,而菌株本身也是极显著影响因素之一。壳聚糖能够增加细胞膜通透性,造成细胞内容物的外泄。     

Identification of 1-lysophosphatidylethanolamine (C(16:1)) as an antimicrobial compound in the housefly, Musca domestica

We observed that a methanolic whole body extract of uninfected last instar larvae of the housefly, Musca domestica, displayed antifungal and antibacterial activity. We have further purified this extract to a single active fraction using reversed phase high performance liquid chromatography. The pure fraction inhibited growth of the Gram-positive bacteria Bacillus thuringiensis and the yeast Saccharomyces cerevisiae, but not the Gram-negative bacteria Escherichia coli. The active compound was determined to have a molecular mass of 451.2 Da. Further analysis by nuclear magnetic resonance identified the substance as mono-unsaturated 1-lysophosphatidylethanolamine (C(16:1)) (1-LPE). The structurally different and more common 2-LPE have been described as mediators of the antimicrobial activity of rimenophenazine antibiotic agents (Van Rensburg et al., 1992). Our results suggest that the isolated 1-LPE displays a higher activity in comparison, possibly based on structure-specific differences in activity.     

STUDIES ON A CADMIUM-INDUCED METALLOTHIONEIN IN HOUSEFLY LARVAE, MUSCA DOMESTICA

Abstract  The induction of metallothionein (MT) was studied in the housefly larvae ( Musca domestica ). Upon dietary exposure to Cd, two Cd-binding proteins were isolated from the whole body homogenates, using gel filtration and ion exchange chromatography. Mass spectrometric measurement revealed that they have high purity and the molecular weight are 9045.9Da and 11560.2Da, respectively. Amino acid analysis showed that the content of cysteine is the highest, attaining to 18.2%. However, aromatic amino acid residues such as tyrosine (2.5%) and phenylalanine (3.1%) were also detected. In addition, MT from housefly larvae has strong heat stability. All these results suggest that the properties of MT isolated from housefly are very similar to that of mammalian MT, but some differences still exist.