铜绿色假单胞菌AS1.860中萘质粒的分离和鉴定

本文报道了一种新的萘降解质粒ND1.860。铜绿色假单胞菌AS1.860经碱-SDS裂解,氯化铯-溴化乙锭密度梯度离心,得到质粒DNA。通过电子显微镜观察到环状DNA分子,并根据轮廓周长推算其分子量为38.1×10~6道尔顿。ND1.860经过EcoRI消化产生10个片段,HindⅢ消化产生9个片段,由琼脂糖凝胶电泳得到的限制图谱与已报道的萘质粒明显不同。     

萘质粒ND1.860HindⅢ片段的分子克隆和限制酶图谱

萘质粒ND1.860经限制性核酸内切酶HindⅢ完全消化和部分消化所产生的限制片段,分别在大肠杆菌质粒pBR322中克隆。通过对含有ND1.860HindⅢ片段的17个重组质粒进行限制酶分析,建立了ND1.860质粒的HindⅢ、EcoRⅠ和XbaⅠ种内切酶26个切点的酶切图谱。     

铜绿假单胞菌PIC－N萘降解基因的研究

铜绿假单胞菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＰＩＣ－Ｎ对萘、邻苯二甲酸、水杨酸等有较强的氧化能力。发现该菌株以禁为底物可诱导产生芳香烃分解酶系。菌株中存在一个５７．４ｋｂ的质粒,经限制性内切酶ＨｉｎｄⅢ处理可产生７个片段,用限制性内切酶ＥｃｏＲⅠ处理可产生８个片段。将以限制性内切酶ＨｉｎｄⅢ部分酶切的片段克隆至大肠杆菌质粒ｐＭＦＹ４３上,获得２９个克隆株。通过对含有菌株ＰＩＣ－Ｎ质粒ＨｉｎｄⅢ片段的７个重组质粒进行限制酶分析,绘出了该质粒ＨｉｎｄⅢ内切酶７个切点的酶切图谱。     

抗性库蚊酯酶基因在大肠杆菌中的克隆和表达

用抗性库蚊酯酶基因,引入原核表达载体pRL439,转化大肠杆菌HB101细胞,获得表达。通过酶切、Southern杂交鉴定重组质粒。研究了重组菌酯酶的活性,重组质粒pRLB1表达的酯酶具有高酶活并能高效降解酯酶的特异性底物α乙酸萘酯(αNA)和β乙酸萘酯(βNA);经对重组菌进行细胞固定化后降解农药三氯杀虫酯(7504),反应时间短,降解效率高     

沈阳地区铜绿假单胞菌药物敏感性测定及质粒图谱分析

目的 测定铜绿假单胞菌对22种药物的敏感性,帮助临床选择用药。并对分离株进行质粒图谱分析以了解耐药菌株的流行情况。方法 药物敏感性实验采用纸片琼脂扩散法,质粒指纹图谱分析采用碱变性法提取质粒DNA,限制性内切酶切割后进行凝胶电泳分析。结果 铜绿假单胞菌对头胞哌酮、氧派酸、丁胺卡那霉素、壮观霉素、多粘菌毒和头孢三嗪的敏感率在84％－100％之间。所有菌株对其他16种抗性素均有不同程度的耐药。质粒DNA图谱分析显示,12株被检测菌株中有11株含有质粒DNA,其中8株含有23kb质粒DNA。结论 铜绿假单胞菌对头胞哌铜、氟派酸、丁胺卡那霉素、壮观霉素、多粘菌素敏感;多数耐药菌株含23kb质粒DNA。     

铜绿假单胞菌PIC—N萘降解基因的研究

铜绿假单胞菌ＰＩＣ－Ｎ对萘、邻苯二甲酸、水杨酸等有较强的氧化能力。发现该菌株以萘为底物可诱导产生芳香烃分解酶系。菌株中存在一个５７．４ｋｂ的质粒,经限制性内切酶ＨｉｎｄⅢ处理可产生７个片段,用限制性内切酶ＥｃｏＲ Ⅰ处理可产生８个片段。将以限制性内切酶ＨｉｎｄⅢ部分酶切的片段克隆至大肠杆菌持ｐＭＦＹ４３上,获得２９个克隆株。通过对含有菌株ＰＩＣ－Ｎ质粒ＨｉｎｄⅢ片段的７个重组闰进行限制酶分析,绘出     

质粒pNK866的拷贝数测定和限制酶图谱

假单胞菌(Pseudomonds)降解质粒的基因组织和表达调控的研究,以及以这些质粒为基础的高效降解环境污染物菌株和产生精细化工产品菌株的构建,是当前一个极为活跃的研究领域.但是,由于假单胞菌基因在大肠杆菌中的表达水平非常低,可用的假单胞菌载体又比较少,使这方面的研究遇到不少困难.目前使用较多的是来自质粒RSF1010的载体,但由于分子量较大,使用不方便,因此构建新的假单胞菌载体是该领域研究的一项重要内容.我们从弯曲假单胞菌(P.geniculata)AS 1.866中分离到质粒pNK866.本文报道了该质粒的拷贝数和限制酶图谱,为假单胞菌新载体的构建奠定了基础.     

染色体DNA转化原生质球构建解烃工程菌

用供体菌C_(20-11)和D_(36-3)染色体DNA转化受体菌T_3原生质球。采用5mg/ml溶菌酶,37℃水浴1小时制备原生质球。原生质球形成率为99％,再生率为72.5％。在30％、PEG6000和0.1MCaC1_2作用下,供体DNA转化受体原生质球。我们用上述条件构建了能够同时降解以下四种碳源:苯甲酸、萘、樟脑、十六烷的工程菌株TCD32-14-1。     

萘降解质粒ND1.860和NAH7的DNA同源性研究

通过DNA:DNA杂交技术,用NAH7质粒的全部EcoR Ⅰ片段或ECOR Ⅰ A片段作为~(32)P标记的DNA探针,研究了萘降解质粒ND1.860和NAH7之间的DNA同源性。在ND1.860的9个HindⅢ片段中,5个与NAH7有同源性,其中3个与NAH7的编码萘降解途径的EcoR Ⅰ A片段有同源性。     

新型基因重组α-半乳糖苷酶工程菌菌种稳定性研究

观察脆弱类杆菌来源的新型重组α-半乳糖苷酶工程菌菌株的遗传稳定性.在有选择压力(Kan+)条件下,将重组α-半乳糖苷酶工程菌菌株在LB固体培养基上采用划线法连续传60代,每隔20代取样保存菌种,最后同时进行菌体形态、生长速度和抗生素抗性、平板传代及诱导过程中的质粒稳定性、限制酶切图谱、测序、表达量和酶活力检测.结果表明细菌形态、生长速度和抗生素抗性等与原始种子库无明显差异;LB固体培养基上传60代后质粒稳定性接近100％,但诱导过程中质粒易丢失.第20、40和60代提取质粒进行酶切检查,酶切图谱没有改变.DNA测序未见α-半乳糖苷酶基因变异.原代菌株及第20、40和60代菌株经诱导培养,其α-半乳糖苷酶表达水平、酶活力及菌体蛋白的SDS-PAGE图谱均无明显差异.说明α-半乳糖苷酶工程菌株在平板传代中具有良好的遗传稳定性     

铜绿假单胞菌LasR基因反义核酸原核表达载体的构建及对该菌毒力的影响

PCR扩增LasR基因,用反向克隆法构建LasR基因反义核酸原核表达载体pUCP18/lasRantisense并转化铜绿假单胞菌,经酶切、PCR及测序鉴定重组载体.RT-PCR检测LasB基因和LasI基因mRNA的表达,NAD法测定外毒素A的活性,紫外分光光度计测定绿脓菌素的产生水平.用转化pUCP18/lasRantisense质粒菌株感染大鼠呼吸道并进行病理组织切片检查.PCR扩增出约720bp片段,与GenBank(No:NC_002516)报道的基因片段大小一致,构建了LasR基因反义核酸原核表达载体pUCP18/lasRantisense,并成功转化铜绿假单胞菌,且有效表达,使转化菌的毒力因子弹性蛋白酶、外毒素A和绿脓菌素表达水平均降低.与标准株感染的大鼠比较,转化pUCP18/lasRantisense质粒菌株感染的大鼠支气管炎症明显减轻.上述结果表明,LasR基因反义核酸原核表达载体pUCP18/lasRantisense可以降低铜绿假单胞菌的毒力.     

农药

862738降解对硫磷(一六O五)的缺陷假单胞菌质粒的大小及其酶切物理图谱〔英〕/MeDaniel,C.S.…了Abstr.Annu.Meet。Am.Soe。Mierobiol一1985,85,Meet。一12〔译自DBA,2985,4(9),85一04457」缺陷假单胞菌质粒pCS_1可用限制性内切酶酶解降解农药。该质粒编码催化降解一六O五的磷酸醋酶。     

转解毒酶基因工程菌的构建及酶活性分析

实验构建了能高效降解有机磷、有机氯等四大类农药的转解毒酶基因工程菌。将抗性库蚊解毒酶酯酶B1基因片段引入融合表达载体pThioHisA中,转化入大肠杆菌DH5α,在IPTG诱导下,经过8 h,酯酶B1在大肠杆菌中的获得融合高效表达。研究了工程菌的酶酯活性,重组质粒pThioHisA-B1表达的酯酶融合蛋白具有较高的酯酶B1活性,能高效降解酯酶的特异性底物α-乙酸萘酯(-αNA)和β-乙酸萘酯(-βNA),该工程菌将为农药污染的生物治理提供新手段。     

一株红球菌(Rhodococcus sp.)二噁英降解质粒的稳定性与接合转移特性

【目的】考察一株红球菌Rhodococcus sp.strain p52中的二噁英降解质粒pDF01(170 kb)和pDF02(242 kb)的稳定性和接合转移特性。【方法】在无选择压力的条件下对菌株p52进行连续传代培养,考察质粒pDF01、pDF02的丢失;以菌株p52为供体菌,以不同种属的菌株作受体菌,通过平板接合实验探讨质粒pDF01、pDF02接合转移的受体菌范围以及接合转移频率,利用菌落杂交、Southern杂交对质粒转移结果进行确认,利用降解实验测试转移质粒降解基因的表达。【结果】质粒pDF01和pDF02在红球菌p52中均具有较高的稳定性,在LB培养基上连续传代少于47次时pDF02可保持,连续传代少于65次时pDF01可保持。质粒pDF01和pDF02具备在同属和属间接合转移的能力,可向受体菌——紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)、红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)、大地两面神菌(Terrabacter tumescens)和节杆菌(Arthrobacter sp.)转移,其中以节杆菌作受体菌时质粒pDF01和pDF02接合转移频率最高,达到3.5×10~(-6)(接合子/受体菌);对节杆菌接合子质粒进行Southern杂交进一步确认了质粒pDF01、pDF02的存在。另外获得质粒pDF01、pDF02后的节杆菌接合子可以对二苯并呋喃高效利用,且降解能力与红球菌供体菌株p52相当。【结论】红球菌菌株p52可通过降解质粒转移强化生物修复过程,在去除环境中二噁英污染中具有良好的应用前景。     

麦迪霉素产生菌生米卡链霉菌1748的质粒Psmyi及其特性的研究

从大环内酯类抗生索麦迪霉素的产生菌生米卡链霉菌1748(Streptomyces,mycarofa-ciens1748)中首次分离到质粒pSMYl DNA,通过琼脂糖凝胶电泳和电镜观察,测定pSMYl的分子量为7．17×10⁶道尔顿。用限制性内切酶EcoRI、PstI、XhoI、SalI和BamHl酶切该质粒DNA,构成了pSMYl的限制性内切酶酶切图谱。EcoRI、Pstl对该质粒均只有一个切点。pSMYI能转化到变青链霉菌1326(S.lividansl326)菌株中能稳定地存在,且具有形成麻点(pock)的特性。     

抗生素

<正>产生红霉素的红链霉菌3038菌株分离出质粒pPC7和pPC8已有报道,并给出了限制性内切酶的图谱。该菌株在含有甘氨酸的TSB培养基中,在振荡下于30℃培养18-24小时。在相同的培养基中培养40小时就形成原生质体。按以前的方法进行蓝链霉菌(Streptomyces coelicolor)和红链霉菌属的转化。把原生质体加进含有酵母提取物的R_2培     

低温萘降解菌的筛选、鉴定及降解条件优化

研究采用富集培养法从黑龙江省大庆油田地区污染土壤中筛选能以萘为唯一碳源和能源的低温菌株,采用气相色谱-质谱法(GC-MS)研究降解菌在萘-无机盐培养基中对萘的降解情况,通过单因素试验与正交试验测定降解菌的培养条件并进行优化,同时分析降解阶段其主控因素。结果表明:筛选出2株在低温条件下高效降解萘的菌株,编号为GN1和GN2。在低温条件下GN1和GN2可以快速降解萘,在对照组非生物因素影响基础上,萘(300 mg/L)的降解率在4 d内达到94.43%和95.47%,在耐受能力和降解速度方面具明显优势;经形态观察、生理生化特性和16S rDNA基因序列鉴定两株降解菌皆属于假单胞菌属(Pseudomonas);均在萘-无机盐培养基(萘浓度300 mg/L),培养温度15℃,初始pH 6.0,培养转数180 r/min,培养时间7 d的条件下生长最佳。2株降解菌的生长与5种环境因素均有显著关系。     

大连市两种来源的副溶血性弧菌分子分型

目的分析食品来源、患者来源及2种来源的副溶血性弧菌之间的PFGE图谱的关系,从分子流行病学角度探讨2种来源的副溶血性弧菌的关联。方法收集患者和食品2种来源的副溶血性弧菌178株,经限制性内切酶SfiI酶切,用脉冲场凝胶电泳方法进行电泳,凝胶成像仪获得电泳图谱,利用BioNumerics软件对图谱进行聚类分析。结果食品来源的96株菌,有13株降解,83株菌被限制性内切酶SfiI酶切出83个PFGE types(PT),聚类分析发现各菌株间相似系数为55.6%~97.4%,按带型相似系数为85%标准划分为1~67共67个克隆群。患者来源的82株菌,有5株降解,77株菌被限制性内切酶SfiI酶切出46个PFGE types(PT),聚类分析发现各菌株间相似系数为64.1%~100.0%,按带型相似系数为85.0%标准划分为A~O群共15个克隆群。将2种来源的共160株副溶血性弧菌的PFGE图谱进行聚类分析,各菌株间相似系数为41.7%~100.0%,按带型相似系数为85.0%标准划分为79个克隆群。结论多数食品来源菌株间相似系数较低,患者来源菌株间相似系数高,而食品和患者来源菌株间相似系数较低,只有少数食品来源与患者来源菌株相似系数较高。     

芽孢杆菌原生质体作为质粒DNA转化的受体

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) B3F 7658,短小芽孢杆菌(B. pumilus) AS 1.940,巨大芽孢杆菌(B．Megaterium) AS 1.941,和多粘芽孢杆菌(B. polymyxa) AS 1.878等菌株,既不能作为染色体DNA的转化受体,也不能作为质粒DNA的转化受体。用不同量的溶菌酶处理这些菌株形成原生质体,然后加pUB110质粒DNA,经聚乙二醇6000(PEG)诱导,在含新霉素(400μg／ml)的DM-3再生培养基上恢复细胞壁,培养48小时后,转化子数为1.0 x 103一4.6×105／μg DNA。若同时用PEG和Ca2+ 离子诱导,转化子数可提高2—3倍。质粒pUBll0用EcoRI酶切后,转化子数大大下降(2.0×102转化子／μg DNA)。Eco RI酶切后,用T4连接酶连成环状,转化子数有所增加(1．7×103转化子／μg DNA)。     

嗜热脂肪芽孢杆菌中耐热蛋白酶基因的克隆

用鸟枪法把嗜热脂肪芽孢杆菌313一l(供体菌)染色体上的蛋白酶基因克隆到质粒pPL603上,并在枯草杆菌中得到表达。此基因位于6．6kb的EcoRI酶切片段上,带有重组质粒的枯草杆菌所产生的蛋白酶活性比供体菌株约提高30倍左右。该酶的最适反应温度为75℃,最适pH为7．0左右,是一个中性蛋白酶,在80℃作用30min后仍保留85％以上的酶活。