家蝇肽聚糖识别蛋白(PGRP-SA)的克隆表达及细菌结合研究

对家蝇PGRP-SA基因进行克隆表达以及研究其重组蛋白与细菌结合能力。从构建的家蝇(Musca domestica)幼虫cDNA质粒文库中筛选到PGRP-SA基因,以cDNA质粒为模板设计引物,通过PCR扩增,获得PGRP-SA基因完整编码序列。运用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白进行预测和分析。构建pET-28a(+)-PGRP-SA重组质粒,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达及蛋白纯化。利用半定量RT-PCR检测PGRP-SA在家蝇3龄幼虫不同组织中的表达量差异。PGRP-SA重组蛋白进行微生物结合实验。结果表明,PGRP-SA基因ORF全长615 bp,编码204个氨基酸,理论分子量22.8 k D,等电点9.11,具有保守的PGRP结构域。成功构建了pET-28a(+)-PGRP-SA重组质粒,蛋白经IPTG诱导后在大肠杆菌中获得表达,经亲和层析柱纯化获得目的蛋白,利用Western blot检测证明纯化蛋白与预期大小相符。PGRP-SA在家蝇3龄幼虫血淋巴、脂肪体、前肠、中肠、气管、马氏管都有表达,血淋巴组织中表达量最高,后肠无表达,由此说明PGRP-SA基因的表达具有一定的组织性。PGRP-SA重组蛋白能与金黄色葡萄球菌和大肠杆菌结合,与白色念珠菌不能结合。成功表达及纯化家蝇PGRP-SA蛋白,证实家蝇PGRP-SA能与金黄色葡萄球菌和大肠杆菌结合。     

人抗酶抑制因子-1的克隆与原核表达

目的:克隆人抗酶抑制因子-1(ornithine decarboxylase antizyme inhibitor-1,OAZI-1)cDNA,建立在大肠杆菌中原核表达并纯化人OAZI-1蛋白的实验技术。方法:巢式RT-PCR法从人A549总RNA中扩增人OAZI-1 cDNA并构建pET-28a/OAZI-1原核表达质粒。该质粒转化大肠杆菌原核表达菌BL21(DE3)后IPTG诱导表达。诱导表达出的重组蛋白用Ni-NTA树脂亲和层析纯化。SDS-PAGE和Western法检测重组OAZI-1蛋白的表达和纯化。结果:成功克隆出编码全长人OAZI-1的cDNA序列,并构建出原核表达质粒pET-28a/OAZI-1。DNA测序分析,重组质粒中的OAZI-1 cDNA无突变,与6×His标签框架对接正确。重组质粒转化入大肠杆菌表达菌BL21(DE3)中后,可用IPTG诱导表达出重组OAZI-1蛋白,该重组蛋白可用Ni-NTA树脂亲和层析纯化。结论:成功建立了人抗酶抑制因子的原核表达和纯化的实验方法,为后续OAZI-1的功能研究奠定了基础。     

手掌参γ-硫素的原核表达及纯化

目的：在原核系统中高效表达手掌参γ-硫素,并对其进行纯化。方法：通过筛选手掌参cDNA文库获得γ-硫素基因（gcthionin）,分别对其全长及信号肽编码序列缺失的cDNA片段进行PCR扩增,克隆入原核表达载体pET-32（a）,构建重组质粒pET-32（a）/gcthionin和pET-32（a）/Δgcthionin;测序鉴定后,转化大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导表达融合蛋白;SDS-PAGE分析后,采用Ni-NTA亲和层析柱及凝胶柱对可溶性蛋白进行纯化,Western blotting鉴定。结果：gcthionin基因开放式阅读框全长225nt,编码一个由74个氨基酸残基组成的蛋白;带有信号肽的重组质粒在大肠杆菌BL21（DE3）中以包涵体形式表达;信号肽缺失可以极大地提高外源蛋白的可溶性,该可溶性产物经Ni-NTA柱及凝胶过滤后可获得纯度较高的蛋白,经Western blotting分析,相对分子质量约21.9×10^3处有明显的蛋白条带,与预期蛋白分子大小一致。结论：信号肽编码序列缺失的Δgcthionin可在大肠杆菌中可溶、高效表达。     

重组人ASCT2的C-末端胞外结构域的原核表达、纯化及鉴定

中性氨基酸转运蛋白（ASCT2）是人类内源性病毒的包膜蛋白合胞素在细胞膜上的主要受体,其最大的胞外结构域存在于C-末端的105个氨基酸（以下简称TAIL）。通过RT-PCR方法从人乳腺癌MCF-7细胞中克隆ASCT2基因编码区全长序列,再从中扩增ASCT2的TAIL序列,与pET-41b（克隆位点的N-和C-端分别有谷胱甘肽转移酶和His6标签序列）连接构建原核表达载体,重组质粒在大肠杆菌中获得表达,免疫印迹显示重组蛋白TAIL在细菌裂解液上清和沉淀（包涵体）中均有表达,可溶性部分经亲和层析纯化获得高纯度的TAIL蛋白,该蛋白可结合在表达合胞素的MCF-7细胞表面,提示其可能具有结合合胞素的活性。     

剪接因子1N端1-320氨基酸片段的原核表达及纯化

目的:通过扩增剪接因子1(SF1)的N端1-320氨基酸(aa)片段对应的cDNA,构建His融合蛋白原核表达质粒pET-28a(+)/SF1(1-320aa),在大肠杆菌中诱导表达并进行亲和纯化。方法:PCR扩增SF1的1-320 aa片段对应的cDNA,扩增产物和载体pET-28a(+)经酶切回收,连接载体和目的片段,获得重组质粒,转化大肠杆菌DH5α,挑取克隆、酶切鉴定、测序,将测序正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE和West-ern印迹分析蛋白表达情况,亲和纯化His-SF1(1-320aa)。结果:SF1片段以正确的读框插入pET-28a(+),IPTG可以诱导大肠杆菌表达重组蛋白,SDS-PAGE和Western印迹证实得到相对分子质量约为40×103的蛋白,亲和纯化得到高纯度蛋白质。结论:构建了His融合蛋白原核表达质粒pET-28a(+)/SF1(1-320aa),并获得His-SF1(1-320aa)融合蛋白,为进一步研究SF1和U2AF65之间的相互作用及对剪接体形成的影响提供了基础。     

东亚飞蝗主要过敏原精氨酸激酶基因的克隆表达、纯化及免疫原性鉴定

本研究克隆了东亚飞蝗Locusta migratoria manilensis(Meyen)精氨酸激酶(arginine kinase,AK)基因全长,表达并纯化重组AK蛋白,研究重组蛋白的免疫反应性。东亚飞蝗AK基因开放阅读框全长为1 068 bp,编码355个氨基酸,与GenBank中已登录的东亚飞蝗AK(DQ513322)基因同源性为98%,重组质粒pET-28a-AK在E.coli中获得高效表达,重组蛋白相对分子质量(Mr)约为40 000,主要以可溶性形式表达,经亲和层析获得重组蛋白。通过免疫印迹分析结果表明,重组AK蛋白可被过敏性患者血清识别,免疫原性良好。结果表明我们成功获得东亚飞蝗精氨酸激酶全长基因并表达出重组AK蛋白,重组AK蛋白具有良好的免疫反应性。     

重组斑马鱼 p8蛋白的原核表达及纯化

目的：在大肠杆菌中重组表达斑马鱼p8蛋白并纯化。方法：PCR扩增斑马鱼p8蛋白基因编码区,连接到带有6×His标签的原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-28a-p8并转化大肠杆菌BL21（DE3）,用IPTG诱导表达;优化表达条件后用Ni^2＋柱纯化重组蛋白。结果：构建了pET-28a-p8重组质粒;目的蛋白在大肠杆菌中获得表达,亲和纯化后,SDS-PAGE显示相对分子质量为预期的12．8×10^3。结论：获得了斑马鱼p8融合蛋白,为其生物学功能研究奠定了基础。     

砀山酥梨多酚氧化酶基因(PbPPO)的原核表达及优化研究

从砀山酥梨Pyrus bretschneideri ‘Dangshan Su’果实中克隆得到一条多酚氧化酶基因(PbPPO)的全长cDNA序列(GenBank登录号:JF809859)。通过生物信息学分析表明,PbPPO基因CDS区全长1782 bp,编码593个氨基酸,氨基酸序列由N端叶绿体转运肽、Cu结合区与C端疏水区三部分组成。为进一步研究Pb PPO基因的功能,成功构建其原核表达载体pET-28a-PbPPO,并在大肠杆菌Rosetta菌株中成功诱导表达,经优化后显示,在28℃、1.0 mmol·L~(-1) IPTG诱导5 h的条件下,融合蛋白表达量最高。     

棉花咖啡酸-O-甲基转移酶基因的原核表达及蛋白纯化鉴定

为获得大量高纯度的GhCOMT2蛋白以便研究其功能和性质,以pMD18-GhCOMT2质粒为模板,PCR扩增GhCOMT2基因的cDNA编码区,构建原核表达载体pET-28a-GhCOMT2,经酶切鉴定并测序后转化到大肠杆菌BL21 (DE3)中进行诱导表达,并采用Western blotting方法鉴定表达产物.结果表明:在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中成功表达了与标签蛋白融合的GhCOMT2蛋白,大小约为40.062 kD,浓度为0.62 mg/mL.重组蛋白的最佳诱导条件为:0.2 mmol/L IPTG在16℃诱导12 h.重组蛋白以可溶形式高效表达,用蛋白标签亲和层析柱(His TrapTM HP)获得纯化重组蛋白,Western blotting分析表明其能与His多克隆抗体起特异性反应.     

香港海鸥菌OsmC蛋白的原核表达、纯化及活性研究

[目的]原核表达纯化香港海鸥菌OsmC蛋白,并检测其抗氧化功能。[方法]通过PCR法扩增香港海鸥菌OsmC基因,将目的片段进行双酶切后连接到pET28a,构建重组质粒pET28a-OsmC并转化大肠杆菌,诱导OsmC蛋白表达,亲和层析纯化目的蛋白并利用氧化铁二甲酚橙实验检测其过氧化物酶活性。[结果]克隆得到全长基因,大小为441bp,编码147个氨基酸。得到重组表达质粒pET28a-OsmC,表达并纯化获得重组OsmC蛋白,OsmC蛋白能够降解H2O2。[结论]Osm C蛋白具有过氧化物酶活性,为研究香港海鸥菌的抗氧化机制奠定了基础。     

pten敲除小鼠中转录上调基因pdd87编码蛋白定位于高尔基体

为了明确pten敲除小鼠中转录上调基因pdd87编码蛋白在细胞中的定位,构建PDD87与绿色荧光蛋白(GFP)的融合蛋白表达载体pEGFP-C1-padS7,利用Lipofectamine2000转染该载体于体外培养的NIH3T3细胞中,采用高尔基体特异探针BODIPY TR C5-Ceramide染色显示高尔基体,激光共聚焦显微镜下观察到PDD87-GFP融合蛋白定位于高尔基体,提示pdd87基因编码的蛋白定位于高尔基体。     

胆汁三烯结合蛋白在大肠杆菌中的表达、复性与纯化

目的：合成胆汁三烯结合蛋白（BBP）基因并在大肠杆菌中表达,获得重组BBP纯化制品。方法：根据天然BBP的基因序列和大肠杆菌偏好密码子设计并合成BBP基因的引物,PCR扩增优化的BBP基因序列,克隆至载体pEasy-T3;测序正确后,将该序列克隆至表达载体pET-32a上,构建表达质粒,转化至大肠杆菌BL21（DE3）pLysS,在IPTG诱导下表达融合蛋白;采用Ni柱纯化融合蛋白。结果：PCR扩增获得了优化后的BBP基因序列,构建了表达载体pET-32a-BBP;SDS-PAGE分析表明表达的融合蛋白相对分子质量为20×10^3,以包涵体形式存在,占全菌蛋白的40%以上;变性、复性后经Ni2＋柱纯化,获得纯度达98%以上的重组蛋白。结论：优化并合成了BBP全基因序列,获得了高纯度重组融合蛋白,为进一步鉴定其生物活性及筛选小分子的研究奠定了基础。     

High-level expression and single-step purification of human tryptophanyl-tRNA synthetase.

Human trpS gene was cloned into the expression vector pET-24a(+) to yield pET-24a(+)-HTrpRS, which could direct the synthesis of a mammalian derived protein in Escherichia coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL. The vector allows overproduction and single-step purification of His(6)-tagged human tryptophanyl-tRNA synthetase by the facilitation of metal (Ni(2+)) chelate affinity chromatography. The expression level of human TrpRS was about 40% of total cell proteins after isopropyl beta-D-thiogalactoside induction. The overproduced human TrpRS-His(6) could be purified to homogeneity within 2 h and about 24 mg purified enzyme could be obtained from 400 ml cell culture. The His(6) tag at C terminus had little effect on the binding ability of its substrates.     

重组西尼罗病毒NS5融合蛋白依赖RNA的RNA聚合酶特性鉴定

西尼罗病毒(West Nile virus, WNV)非结构蛋白NS5是病毒基因组复制的关键蛋白.以病毒全长cDNA克隆为模板,PCR扩增获得NS5的RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)活性区（NS5pol）及该蛋白完整的编码序列（NS5F）,分别克隆于原核表达载体pET-28a 并转化至大肠杆菌E.coliBL21（DE3）中诱导表达.表达的可溶性重组蛋白经Ni柱亲和层析纯化后进行SDS-PAGE和Western印迹鉴定.结果显示,二者均为病毒特异蛋白,且纯度均在90%以上.进一步的体外RdRp分析及EMSA的结果表明,NS5pol和NSF5均有较高的RdRp活性,且该活性具有RNA模板序列和二级结构的特异性.获得的具有RdRp活性的NS5pol和NS5F为西尼罗病毒基因组复制相关元件的研究奠定了基础.     

High-level expression and single-step purification of leucyl-tRNA synthetase from Aquifex aeolicus

Aquifex aeolicus leucyl-tRNA synthetase is the only known heterodimeric LeuRS, consisting of two subunits with molecular masses of 74.0 and 33.5 kDa, and named alphabeta-LeuRS. The gene encoding alpha subunit was cloned into pSBET-b vector. Synthetic oligonucleotide encoding six histidine residues was also inserted in front of alpha subunit. PSBET-b vector contains argU gene, which encodes a rare Escherichia coli tRNA(Arg)(AGA/AGG). The argU gene helps A. aeolicus LeuRS, which contains AGA/AGG codons in exceptionally high frequency, express well in E. coli. The gene encoding beta subunit was inserted into pET-15b vector. E. coli BL21-CodonPlus (DE3) cells were transformed with the two recombinant plasmids to produce alphabeta-LeuRS with a His6 tag at the N-terminus of alpha subunit. The enzyme was purified by affinity chromatography on Ni-NTA Superflow. About 7 mg purified alphabeta-LeuRS was obtained from 250 ml culture. The His6-tag at the N-terminus did not affect the aminoacylation activity of the enzyme.     

含蛋白转导域的SARA/SBD融合蛋白的原核表达、纯化及生物学活性鉴定

目的:SARA/SBD是纤维化形成过程中的负性调节因子。原核表达、纯化含反式激活蛋白(TAT)蛋白转导域(PTD)的TAT PTD-SARA/SBD融合蛋白,并鉴定其生物学活性。方法:将TAT PTD-SARA/SBD基因克隆入带His标签的原核表达载体pET-44a(+)中,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,表达产物经Ni2+-NTA亲和层析柱纯化后,SDS-PAGE和Western印迹鉴定目的蛋白;用人腹膜间皮细胞系(HPMC),通过免疫细胞化学方法检测其穿膜能力,及与TGF-β1信号通路中Smad2因子的共定位情况。结果:用基因工程方法表达和纯化了TAT PTD-SARA/SBD融合蛋白,目的蛋白约占菌体总蛋白的20%左右,且以可溶形式表达,经Ni2+-NTA纯化后,所获蛋白纯度高于95%(HPLC归一法);功能学实验结果显示该蛋白能穿过胞膜,主要定位于胞核,且与Smad2因子具有核内共定位。结论:表达了TAT PTD-SARA/SBD融合蛋白,该蛋白具有生物学活性。     

幽门螺杆菌CagA蛋白N端片段的表达、纯化及其与磷脂酰丝氨酸的亲和力检测

目的:表达和纯化幽门螺杆菌不同菌株的CagA蛋白N端片段,检测其与磷脂酰丝氨酸(PS)的相互作用及亲和力。方法:用PCR方法从幽门螺杆菌3个菌株中扩增出CagA蛋白N端基因,并连接到表达载体pET-28a上;转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导可溶性表达CagA蛋白N端880残基片段;经镍柱亲和纯化后,利用PLOA法检测CagA蛋白与PS的相互作用。结果:构建了3种幽门螺杆菌菌株cagA基因的原核表达质粒pET-28a/cagAJ99、pET-28a/cagA11637及pET-28a/cagASS1,并在大肠杆菌中获得可溶性表达,SDS-PAGE和Western印迹证实得到目标融合蛋白,亲和纯化得到高纯度CagA蛋白。PLOA结果表明,CagA蛋白与PS有明显的相互作用。结论:3种幽门螺杆菌菌株CagA蛋白与PS之间存在相互作用,且不同的CagA与PS有不同的亲和力。     

δ-睡眠肽与GFP融合蛋白的表达和纯化

构建δ-睡眠肽(DSIP)蛋白与GFP的融合基因表达载体,高效表达和纯化GFP-DSIP融合蛋白。通过SOE-PCR拼接DSIP全长编码基因,并使得DSIP上游具有肠激酶识别位点,经双酶切定向克隆至表达载体pET-28a,构建重组载体pET-28a-DSIP,通过PCR扩增GFP全长编码基因,经双酶切定向克隆至pET-28a-DSIP,构建原核重组表达载体pET-28a-GFP-DSIP,通过双酶切和测序鉴定后,导入E.coli BL21宿主菌中,IPTG诱导表达融合蛋白,采用镍亲和层析和分子筛凝胶层析获得高纯度蛋白,SDS-PAGE分析鉴定。经测序鉴定成功构建了原核重组表达载体pET-28a-GFP-DSIP,在IPTG诱导下获得可溶性的绿色荧光蛋白与睡眠肽的融合蛋白,经Ni-NTA亲和层析纯化成功获得高纯度的融合蛋白。成功构建了DSIP与GFP融合基因的重组表达载体,确定了GFP-DSIP融合蛋白诱导表达的最佳条件,获得了较高纯度的融合蛋白,为进一步研究DSIP蛋白的生物学功能奠定了基础。     

重组斑马鱼CD36蛋白的原核表达及纯化

目的：在大肠杆菌中重组表达斑马鱼CD36蛋白胞外区38～432氨基酸残基段并纯化。方法：PCR扩增斑马鱼CD36蛋白的基因编码区,连接到带有6~His标签的原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET28a-CD36,并转化大肠杆菌BL21（DE3）,用IPTG诱导表达,优化表达条件后用Ni^2＋柱进行纯化。结果：构建了pET28a-CD36重组质粒;目的蛋白在大肠杆菌中获得表达,亲和纯化后,SDS-PAGE显示相对分子质量为预期的46．8×10^3。结论：获得了斑马鱼CD36融合蛋白,为其生物学功能研究奠定了基础。