重组人源性脂联素球状结构的表达、纯化与活性检测

目的:利用基因工程方法构建人源性脂联素球状结构(gAd)基因的高效原核表达体系,并对重组蛋白进行诱导表达、纯化、鉴定及活性检测.方法:从正常人脂肪组织里面提取总RNA,反转录合成cDNA,经PCR扩增、酶切后连入pET-22b(+)载体构建重组质粒pET-22b(+)-gAd,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞.经诱导剂诱导后目的蛋白以包涵体形式产生,采用强碱促溶包涵体并用丙酮沉淀蛋白的方法进行复性和纯化,得到高纯度的人源性gAd.运用SDS-PAGE、Western blotting对重组蛋白进行鉴定,通过对蛋白激酶(AMPK)的磷酸化水平和对小鼠的心肌缺血再灌注损伤的保护作用来检测纯化蛋白的生物学活性.结果:成功构建了原核表达载体pET-22b(+)-gAd,实现了人源性gAd在原核细胞中的表达,并对形成的包涵体变性、复性和纯化,纯化出的蛋白经过SDS-PAGE和Western分析证实为gAd;通过对AMPK的磷酸化水平的检测和对小鼠的心肌缺血再灌注损伤的保护作用证明纯化出的gAd具有高生物学活性.结论:成功构建、表达和纯化了无标签、高生物学活性的人源性脂联素球状结构(gAd),为其进一步的理论研究、生产开发奠定了基础.     

含蛋白转导域的SARA/SBD融合蛋白的原核表达、纯化及生物学活性鉴定

目的:SARA/SBD是纤维化形成过程中的负性调节因子。原核表达、纯化含反式激活蛋白(TAT)蛋白转导域(PTD)的TAT PTD-SARA/SBD融合蛋白,并鉴定其生物学活性。方法:将TAT PTD-SARA/SBD基因克隆入带His标签的原核表达载体pET-44a(+)中,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,表达产物经Ni2+-NTA亲和层析柱纯化后,SDS-PAGE和Western印迹鉴定目的蛋白;用人腹膜间皮细胞系(HPMC),通过免疫细胞化学方法检测其穿膜能力,及与TGF-β1信号通路中Smad2因子的共定位情况。结果:用基因工程方法表达和纯化了TAT PTD-SARA/SBD融合蛋白,目的蛋白约占菌体总蛋白的20%左右,且以可溶形式表达,经Ni2+-NTA纯化后,所获蛋白纯度高于95%(HPLC归一法);功能学实验结果显示该蛋白能穿过胞膜,主要定位于胞核,且与Smad2因子具有核内共定位。结论:表达了TAT PTD-SARA/SBD融合蛋白,该蛋白具有生物学活性。     

无标签重组人硫氧还蛋白的大规模表达、纯化及活性检测

目的:利用基因工程的方法原核表达无标签的重组人硫氧还蛋白(rhTrx)并对其进行大规模表达、纯化和鉴定.方法:从人胚胎肾HEK293细胞中提取总RNA,反转录合成cDNA,经PCR扩增、酶切后连入pET-22b(+)载体构建重组质粒,重组质粒转化大肠杆菌BL21( DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,经两步离子交换层析纯化重组蛋白,采用SDS-PAGE、Western blotting、HPLC、MALDI-TOF-MS及经典的胰岛素二硫键还原法对重组蛋白进行鉴定.结果:构建成功了rhTrx基因表达载体;实现了rhTrx在原核细胞中的可溶性表达;纯化出的蛋白经SDS-PAGE和Western blotting分析证实为rhTrx;HPLC和MALDI-TOF-MS分析表明,纯化出的目的蛋白纯度大于95％;胰岛素二硫键还原法证实纯化出的rhTrx具有生物学活性.结论:成功构建了rhTrx的原核表达体系,建立了rhTrx的纯化和鉴定方法,为其进一步的理论研究和生产开发提供了有效基础数据.     

无标签人源性脂联素球状结构的表达、纯化与活性检测

目的:利用基工程方法构建无标签人性脂联素球状结构(gAd)基的核表达载体,并对重组蛋白进行诱导表达、纯化及鉴定.方法:从正常人脂肪组织里提取总 RNA,反转录合成 cDNA,经 PCR 扩增、酶切后连入pET-22b(+)载体构建重组质粒 pET-22b(+)-gAd,转化大肠杆菌 BL21(DE3)感受态细胞,经低温、低浓度 IPTG 诱导使其可溶性表达,采用硫酸铵沉淀、凝胶过滤层析和离子交换层析三步分离纯化,得到不带任何标签的人性gAd;运用 SDS-PAGE、Western 印迹、HPLC 对重组蛋白进行鉴定,通过对 AMP 激活的蛋白激酶(AMPK)的磷酸化水平检测纯化蛋白的生物学活性.结果:构建了核表达载体 pET-22b(+)-gAd,实现了人性 gAd 在核细胞中的可溶性表达,纯化的蛋白经 SDS-PAGE 和 Western 印迹分析证实为 gAd,HPLC 分析蛋白纯度达到95%以上;通过对 AMPK磷酸化水平的检测,证明纯化的 gAd 具有高生物学活性.结论:重组表达和纯化了无标签、高生物学活性的人性脂联素球状结构,为其进一步的理论研究、生产开发奠定了基础.     

血管紧张素1-7改构体对A549细胞生长的抑制作用

目的:以D型氨基酸替代的方式和C端及N端改构的方式构建2种能够抵抗蛋白酶降解的血管紧张素Ang1-7异构体小肽血管紧张素改构体1和2,对其抗肿瘤细胞系A549活性进行初步研究,以期为长效型Ang1-7改构类抗肿瘤药的应用提供理论依据。方法:HPLC法检测2种改构体抗酶降解的能力;用带荧光标记的Ang1-7对A549细胞进行药物亲和实验,并用无标记的药物拮抗这种配体亲和;用MTT法检测Ang1-7及2种改构体对A549细胞增殖的影响。结果:2种改构体均能抗血管紧张素转化酶、中性内肽酶、亮氨酸内肽酶的降解;带荧光标记的Ang1-7能够和A549细胞结合,且这种结合可以被无标记的2种改构体竞争性拮抗;Ang1-7和2种改构体能抑制A549细胞增殖。结论:构建了能够抵抗酶降解,在体外能结合于A549细胞表面并抑制A549细胞增殖的2种Ang1-7改构体小肽,为该小肽进一步的体内抗癌研究及应用奠定了基础。     

伤口愈合肽HPLC分析方法的研究

目的：研究高效液相色谱法（HPLC）分析伤口愈合肽的方法。方法：HPLC测定用Kromasil-C18色谱柱（250mm＊4.6mm,5滋m）,拟确定的色谱条件为：二元线性梯度洗脱,流动相A：0.1%三氟乙酸水溶液;流动相B：0.1%三氟乙酸50%乙腈,流速为1ml/min,检测波长为215nm。结果：线性梯度洗脱条件：起始流动相为A70%：B30%,洗脱最终流动相为A30%：B70%;伤口愈合肽浓度在0.1-0.3mg/ml内,其标准曲线的相关系数为R2=0.9998,回归方程为：y=237.19x-0.3249;日内、日间相对标准偏差都不大于2%;重复性的相对标准偏差都小于药典规定的2.0%。结论：该方法稳定性、重复性良好,符合伤口愈合肽新药研究的实验检测要求。     

一种新的恒河猴T淋巴细胞活化抗原PTA1

本文应用抗人Ｔ细胞活化抗原ＣＤ２５和ＰＴＡ１ＭｃＡｂ对恒河猴ＰＢＭＣ进行间接免疫荧光染色和流式细胞仪分析,结果发现,恒河猴静止ＰＢＭＣＣＤ２５和ＰＴＡ１均为阴性,而ＰＨＡ活化后或经连续２个月注射ｒＨｕＴＮＦ－α恒河猴ＰＢＭＣ均表达高比率的ＣＤ２５和ＰＴＡ１阳性细胞。此结果表明,ＰＴＡ１抗原可作为恒河猴活化Ｔ淋巴细胞的一种有用标志,为ＰＴＡ１分子结构和功能研究以及采用恒河猴作为灵长类动物模型,观察细胞免疫功能状态提供了有用的资料。