P100蛋白及其片段重组质粒构建与表达

目的分别将人类p100基因,p100的SN基因片段和TD片段定向连入pERFP-CI质粒,使它们可与红色荧光蛋白在HeLa细胞内融合表达,从而为进一步研究P100蛋白及其片段的定位、功能及与其它蛋白的相互关系奠定实验基础。方法PCR分别扩增出P100蛋白全长,SN片段和TD片段基因的序列,定向克隆至真核表达载体pERFP-CI,构建相应的3种重组质粒。将构建成功的质粒转染入HeLa细胞,荧光显微镜下可观察红色荧光融合蛋白表达。结果①PCR法获得P100基因序列,长度为2659bp,SN基因片段1918bp,TD基因片段741bp;②将重组质粒直接进行双酶切鉴定可见P100片段,将经过蓝白斑筛选后的重组子经双酶切再与pERFP-CI载体连接并酶切得到SN片段和TD片段;③转染重组质粒后可观察到红色荧光蛋白的表达。结论3种外源片段成功载人pERFP-CI质粒;P100全长、SN片段、TD片段均可与红色荧光蛋白在HeLa细胞中融合表达。     

融合基因anti-erbB2 scFv-Fc-CD28-CD3(ζ)的构建及真核表达

本研究利用SWISS-MODEL预测该融合蛋白的三级结构。利用PCR的方法分别从重组pPIC9k、重组pBullet和pSecTag2B上扩增出3段基因片段,即片段anti-erbB2 scFv(简称A)、片段Fc-CD28-CD3(ζ)(简称B)和信号肽序列(简称S)。利用SOE-PCR将3段序列连接形成融合基因片段S-A-B。经TA克隆扩增及鉴定后,将融合基因片段与逆转录病毒表达载体pLNCX相连构建重组真核表达载体,电转染人淋巴瘤T细胞株Jurkat,G418筛选后用流式细胞术检测融合蛋白稳定表达情况。经预测在anti-erbB2 scFv与Fc基因片段之间不加连接肽的融合蛋白,在三级结构上可形成更佳的功能构象。经PCR、酶切及测序鉴定均证实成功构建重组真核表达载体pLNCX/S-A-B(在A与B基因片段之间不加linker)。经流式细胞术检测,在转染的Jurkat细胞中融合蛋白表达率约为56.17%。本研究应用分子克隆的方法成功地构建了重组真核表达载体pLNCX/anti-erbB2 scFv-Fc-CD28-CD3(ζ),融合基因能够在淋巴瘤T细胞株中表达,为制备含该融合基因的原代T淋巴细胞,进行erbB2过表达肿瘤的靶向基因治疗研究奠定了实验基础。     

PSF不同功能片段融合蛋白的构建及其在细胞内的分布

目的将人类PSF基因的不同功能片段定向连入pEGFP—C2质粒,使PSF蛋白的各功能片段与绿色荧光蛋白在HeLa细胞内融合表达,观察其在HeLa细胞中的表达及定位。方法以重组质粒pEGFP—C2-PSF为模板,PCR法扩增出目的基因,将扩增片段双酶切后连接到质粒pEGFP—C2上,构建重组质粒pEGFP—C2-PSF（I—V）。将构建成功的pEGFP—C2-PSF（I—V）质粒脂质体法转染HeLa细胞,Western印迹检测融合蛋白的表达,并在荧光显微镜下观察融合蛋白的定位与分布。结果成功构建质粒pEGFP—C2-PSF（I～V）,并在HeLa细胞中实现表达;Western印迹检测到融合蛋白GFP—PSF（I～V）;在激光共聚焦显微镜下观察到绿色的融合蛋白表达和定位。结论人类PSF基因的不同功能片段的重组质粒pEG—FP—C2-PSF（I～V）构建成功,可用于标记PSF蛋白的不同功能片段,为进一步研究PSF在信号转导中的作用机制以及其生物学功能奠定基础。     

变形链球菌致龋抗原基因在乳酸乳球菌的表达

目的 克隆变形链球菌葡聚糖结合蛋白B(GbpB)功能区的基因片段,并在乳酸乳球菌中表达.方法 在实验中利用了分子克隆技术构建携带GbpB基因的重组原核表达质粒pNI1,将重组质粒转化乳酸乳球菌YF02株,筛选鉴定阳性菌落,诱导表达的GbpB蛋白用SDS-PAGE进行鉴定.结果 成功克隆了GbpB功能区的基因片段,并在乳酸乳球菌中得到其融合蛋白的表达.结论 利用分子生物学技术能够成功克隆GbpB功能区基因并获得乳酸乳球菌融合蛋白的表达,为后续研究奠定了基础.     

Progress on Ig Fusion Proteins Application

Ig融合蛋白是指在基因水平将目的基因同Ig部分片段基因相连 ,克隆并表达的重组蛋白。该蛋白具有目的蛋白的功能 ,又获取Ig的新特性。本文综述了Fab融合蛋白及Fc融合蛋白在临床及科学研究应用方面的进展。     

融合蛋白基因工程应用及研究

通过重组DNA技术将不同的基因或基因片段融合在一起,经表达后可以得到由不同的功能蛋白拼合在一起而形成的新型多结构域的人工蛋白,这是一种极具潜在应用价值与理论意义的方法。目前这种方法已被广泛应用于许多领域的研究中,并已显示出较高的价值,本文尝试对融合蛋白研究的几个领域的发展情况进行综述。     

重组原核质粒GST-hTudor-SN-SN（1～4）的构建及表达

目的 将人类Tudor-SN（tudor staphylococcal nuelease）蛋白SN（1～4）基因片段分别定向连入pGEX-4T-1质粒,使Tudor-SN蛋白sN各功能片段与（;＂蛋白在大肠埃希菌BL21细胞内融合表达.方法 以重组质粒pSG5-Tudor-SN-flag为模板,PCR法扩增出目的 基因,利用EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切法将目的 片段连接纠pGEX-4T-1载体卜,再将构建成功的GST-hTudor-SN-SN（1～4）重组质粒转化人大肠埃希菌BL-21内,IPTG诱导表达后再以考马斯亮蓝染色法检测GST融合蛋白的表达.结果 以单/双酶切和基因测序法鉴定构建的重组质粒均无误,考马斯亮监染色法观察到GST融合蛋白的正确表达.结论 重组原核GST.hTudor-SN-SN（1-4）质粒成功构建和表达.     

融合蛋白基因工程应用及研究

通过重组ＤＮＡ技术将不同的基因或基因片段融合在一起,经表达后可以得到由不同的功能蛋白拼合在一起而形成的新型多结构域的人工蛋白,这是一种极具潜在应用价值与理论意义的方法。目前这种方法已被广泛应用于诜我领域的研究中,并已显示出较高的价值,本文尝试对融合蛋白研究的几个领域的发展情况进行综述。     

抗人P185^erbB2的scFv—Fc融合蛋白的表达及免疫功能分析

为提高鼠源单抗用于体内治疗的效应功能及降低人抗鼠抗体反应 ,将编码抗人P185 erbB2 单抗轻、重链可变区 (VL、VH)融合构建的单链抗体 (scFv)基因片段与人IgG1的Fc区基因片段融合构建了scFv Fc融合基因 ,并将其克隆到哺乳动物细胞表达载体pCIDN中。用重组载体转染CHO细胞 ,通过G4 18筛选获得稳定高表达克隆。更换无血清培养基培养 ,经重组蛋白质A亲和层析柱纯化scFv Fc融合蛋白。融合蛋白质在还原SDS PAGE中表现为5 2kD的条带 ;与SK BR 3细胞裂解液共培育可特异性地沉淀出P185 erbB2 蛋白 ;FACS分析表明融合蛋白质识别P185 erbB2 蛋白的胞外段 ;ELISA测定融合蛋白质对细胞表面抗原P185 erbB2 的亲和常数为 7.5× 10 -10 (mol/L) -1。构建scFv Fc融合基因 ,将其克隆到表达载体 ,进一步稳定表达抗P185 erbB2 的scFv Fc融合蛋白 ,为进一步的体外、体内研究鼠源单抗治疗效果创造了条件。     

乙肝病毒核心蛋白钉突部位基因工程改造对其功能的影响

通过在乙肝病毒核心蛋白钉突部位插入标签蛋白EGFP及小片段多肽,研究各种改造对HBc功能的影响。采用RLIC方法,构建野生型HBc、HBc钉突部位带不同接头的EGFP融合重组体、缩短的EGFP融合重组体,并构建与HBc功能互补的质粒HBV1.1c－,将不同重组体与HBV1.1c－共转染HEK293细胞,通过观察荧光及Southern blotting检测病毒复制中间体,判断相应基因工程改造对重组蛋白中不同结构域功能的影响。RLIC方法可有效地用来进行片段缺失,且缺失片段大小及位置无明显限制。带柔性或刚性接头的重组HBc-EGFP均可产生绿色荧光,但荧光在细胞内分布形态不同,两种重组HBc-EGFP均不能支持正常的HBV复制,各种截短的插入片段以及aa79-80单独缺失体亦不能支持HBV复制。结果表明RLIC方法是一种基因工程改造的有力工具,不同类型接头对重组蛋白的结构和功能有不同影响,aa79-80对维持HBc的主要功能之一——支持HBV复制有重要作用。     

金黄色葡萄球菌甲氧西林耐药辅助基因femB的克隆和原核表达

金黄色葡萄球菌femB基因与甲氧西林高水平耐药密切相关,可能成为开发抗MRSA药物的新靶位.以金葡菌基因组DNA为模板,PCR扩增femB全长基因,所得片段与pGM-T载体连接并转化感受态大肠杆菌DH5α,阳性克隆以PCR、双酶切及测序鉴定.将鉴定正确的目的片段定向克隆到pGEX-4T-1表达载体中,转化至大肠杆菌BL21后经IPTG诱导表达GST/FemB融合蛋白;采用SDS-PAGE及Western blot对融合蛋白进行鉴定.结果显示,重组质粒在宿主菌中获得了高效表达,融合蛋白相对分子质量为75 kD,该融合蛋白可与抗GST-tag抗体特异结合;表明femB基因的原核表达系统构建成功,为进一步研究其生物学功能奠定了基础.     

HPV16+治疗性无佐剂蛋白疫苗—HPV16Z- Hsp65-E6/E7的构建、表达及纯化工艺研究

目的：研制针对我国宫颈癌高危相关的HPV16型的治疗性无佐剂蛋白疫苗。方法：应用PCR技术自我国山西宫颈癌高发现场分离到的毒株-HPV16z中获得E6/E7转化基因片段,自卡介苗菌株中克隆获得Hsp65基因片段,对E6/E7基因片段定点突变修饰,构建pET28a-Hsp65-E6/E7表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达融合蛋白,并研究重组蛋白的纯化方案和工艺。结果：成功构建pET28a-Hsp65-E6/E7重组表达载体,E6/E7突变位点正确,融合蛋白在亲和层析柱上正确复性和初步纯化,经阴离子交换色谱纯化后蛋白纯度达到95%。结论：该研究为无佐剂治疗性重组蛋白疫苗Hsp65-E6/E7的进一步功能研究奠定了基础。     

猪丹毒丝菌C43065株表面保护性抗原AN端保护区在大肠杆菌中的表达

目的：在大肠杆菌中表达猪丹毒丝菌C43065株表面保护性抗原A（SpaA）N端保护区（SpaA-N）,并检测其抗原性。方法：利用PCR方法从猪丹毒丝菌C43065株基因组中扩增出spaA基因片段,构建pMD18-spaA重组质粒并对插入片段进行测序;以pMD18-spaA重组质粒为模板,PCR扩增得到spaA-N基因片段,构建重组表达质粒pGEX-spaA-N,经序列测定证实正确后转化大肠杆菌BL21（DE3）,再经IPTG诱导表达GST-SpaA-N融合蛋白并纯化。结果：扩增得到的spaA基因长1881bp,编码由626个氨基酸残基构成的多肽;SDS-PAGE和Western印迹检测结果表明,诱导表达获得相对分子质量约64000的GST-SpaA-N融合蛋白,该融合蛋白能与相应抗体发生特异性反应。结论：获得了在大肠杆菌中可溶性表达的GST-SpaA-N融合蛋白,为进一步研究猪丹毒丝菌免疫保护性抗原奠定了基础。     

弗氏志贺菌 M90T 株毒力相关膜蛋白复合物组成基因缺失突变体的构建

目的：构建弗氏志贺菌M90T株毒力相关膜蛋白复合物组成蛋白基因的缺失突变株。方法：分别扩增目的基因的上、下游同源臂和卡那霉素抗性基因片段,利用重叠延伸PCR技术将这3个片段融合为打靶片段,电击转化M90T／pKD46感受态细胞,在bRed重组系统的作用下,通过同源重组将目的基因置换为卡那霉素抗性基因,之后在辅助质粒pCP20的作用下切除FRT位点之间的卡那霉素抗性基因,得到基因缺失突变体。结果与结论：分别构建了M90T株毒力相关膜蛋白复合物4个组成蛋白Apy、DnaK、CIpB、YdgA的基因缺失突变体,为进一步研究各基因的功能提供了突变体。     

犬瘟热病毒核衣壳蛋白基因片段的克隆和表达

目的　构建pMal N重组表达载体 ,转化E .coliDH5α ,诱导表达犬瘟热病毒 (CDV)重组核衣壳 (N)蛋白。方法　采用RT PCR技术 ,从CDVRNA中扩增编码N蛋白的基因片段 ,通过连接反应 ,构建重组克隆载体和重组表达载体 ,转化感受态。E .coliDH5α细胞。通过IPTG诱导表达CDV重组N蛋白。结果　扩增出约 1 7kbCDV全长的主要结构蛋白N蛋白基因 ,通过PCR获得 5 36bpN蛋白基因片段。将N蛋白基因片段克隆入原核表达载体pMal C2 ,表达产物麦芽糖结合蛋白 (MAP)与N蛋白的融合蛋白的相对分子质量约 6 0× 10 3,与预期大小一致。结论　构建的pMal N重组载体所表达的CDVN蛋白为进一步研究CDV的特异、敏感的抗体检测方法打下基础     

猪丹毒丝菌C43065株表面保护性抗原A N端保护区在大肠杆菌中的表达

目的:在大肠杆菌中表达猪丹毒丝菌C43065株表面保护性抗原A(SpaA)N端保护区(SpaA-N),并检测其抗原性.方法:利用PCR方法从猪丹毒丝菌C43065株基因组中扩增出spaA基因片段,构建pMD18-spaA重组质粒并对插入片段进行测序;以pMD18-spaA重组质粒为模板,PCR扩增得到spoA-N基因片段,构建重组表达质粒pGEX-spaA-N,经序列测定证实正确后转化大肠杆菌BL21(DE3),再经IFrG诱导表达GST-SpaA-N融合蛋白并纯化.结果:扩增得到的spaA基因长1 881 bp,编码由626个氨基酸残基构成的多肽;SDS-PAGE和Western印迹检测结果表明,诱导表达获得相对分子质量约64 000的GST-SpaA-N融合蛋白,该融合蛋白能与相应抗体发生特异性反应.结论:获得了在大肠杆菌中可溶性表达的GST-SpaA-N融合蛋白,为进一步研究猪丹毒丝菌免疫保护性抗原奠定了基础.     

SARS病毒S和N蛋白抗原表位的基因合成、融合表达及纯化鉴定

通过计算机分析SARS病毒N蛋白和S蛋白的氨基酸序列 ,初步确定含强抗原表位的N蛋白片段和S蛋白片段 ,共 5 6 0个氨基酸。选择真核和原核生物均偏爱的密码子 ,化学合成全新的SARS病毒N蛋白片段和S蛋白片段的基因序列 ,利用基因工程技术将两个基因片段串联 ,克隆至质粒Pet2 8a(+)内的NcoⅠ/EcoRⅠ位点 ,表达S蛋白片段和N蛋白片段的融合蛋白。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3) ,筛选获得了高效表达SARS病毒S蛋白片段和N蛋白片段融合蛋白的工程菌 ,表达的SARS病毒的融合蛋白约占菌体蛋白总量的 30 %左右 ,部分以可溶性形式存在。经离子交换柱和反相高压液相纯化获得了表达的融合蛋白 ,经初步鉴定 ,显示该融合蛋白有较好的抗原性和特异性.     

肺炎支原体重组蛋白抗原的初步鉴定

克隆并表达肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,Mp)P1黏附蛋白D-2区基因片段,进而对重组蛋白的抗原特异性进行鉴定。应用PCR技术获取目的基因片段,并构建含有目的基因片段的重组质粒,用重组质粒酶切图谱法、PCR扩增及核苷酸测序方法鉴定重组质粒。而后将其转入大肠杆菌BL21菌株,用IPTG诱导目的基因表达,用SDS-PAGE分析重组蛋白的相对分子量,免疫印迹实验鉴定其免疫反应性,并用ELISA实验测定重组蛋白抗原的特异性。结果重组质粒中的p1基因片段经测序后,与GenBank中p1基因核苷酸序列比较,其同源性为99.66%~100%;经SDS-PAGE分析,重组蛋白的相对分子量约为59 ku;免疫印迹实验和ELISA实验证实,Mp免疫血清和Mp感染患者血清都能与重组蛋白发生特异反应。研究中的含P1黏附因子D-2区基因的重组质粒已成功构建,其表达的重组蛋白具有特异的免疫反应性,初步ELISA实验证实,本研究获得的重组蛋白可用于临床标本检测。     

重组肿瘤血管生成抑制因子CTF的构建和特征分析

为获得一种更高效的重组肿瘤血管生成抑制因子,利用重叠延伸PCR技术将来自钙网蛋白(calreticulin)和肿瘤抑素(tumstatin)的抗血管生成活性片段连接,构建融合基因CTF(calreticulin tumstatin fusion)并克隆至表达载体p ET-15b。运用生物信息学软件对其分子结构的生物学特征进行分析发现,CTF融合基因编码94个氨基酸,分子量为10.72 k D,理论等电点为7.68,利于基因工程表达;连接肽段部位呈中性且柔性良好,不影响两端活性区域原来的二级结构和融合蛋白保守结构域。研究结果表明,本研究构建的CTF能够保留钙网蛋白活性片段和肿瘤抑素活性片段各自空间结构,适合融合蛋白生物活性的发挥。     

嗜水气单胞菌BYKAH2008AC株外膜蛋白和溶血素双基因的融合表达及免疫原性分析

嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)的外膜蛋白基因(OmpTS)和溶血素基因(Hly)是其重要的保护性抗原。根据Genbank已发表的两个基因的序列设计引物,扩增其去除信号肽部分的基因片段,再将二者通过柔性片段融合,定向插入到质粒pET32a中构建重组融合表达载体,并转化到大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导获得与预期大小108 kD相吻合的融合蛋白条带。用纯化的重组蛋白免疫新西兰大白兔制备兔抗血清。ELISA和Western Blot检测该抗体效价为1∶4000以上,且该重组蛋白与抗OmpTS兔血清和抗Hly兔血清都呈阳性反应,表明该融合蛋白保留了外膜蛋白和溶血素的免疫原性,可作为基因工程亚单位疫苗的候选成分。