HPV16+治疗性无佐剂蛋白疫苗—HPV16Z- Hsp65-E6/E7的构建、表达及纯化工艺研究

目的：研制针对我国宫颈癌高危相关的HPV16型的治疗性无佐剂蛋白疫苗。方法：应用PCR技术自我国山西宫颈癌高发现场分离到的毒株-HPV16z中获得E6/E7转化基因片段,自卡介苗菌株中克隆获得Hsp65基因片段,对E6/E7基因片段定点突变修饰,构建pET28a-Hsp65-E6/E7表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达融合蛋白,并研究重组蛋白的纯化方案和工艺。结果：成功构建pET28a-Hsp65-E6/E7重组表达载体,E6/E7突变位点正确,融合蛋白在亲和层析柱上正确复性和初步纯化,经阴离子交换色谱纯化后蛋白纯度达到95%。结论：该研究为无佐剂治疗性重组蛋白疫苗Hsp65-E6/E7的进一步功能研究奠定了基础。     

亚麻籽木酚素预防乳腺癌及与雌激素的关系

目的通过卵巢切除术建立雌性大鼠去势模型,探究亚麻籽粉木酚素预防乳腺癌的功能及与雌性激素的关系。方法将48只雌性Wistar大鼠随机分为基础饲料组（BD）、基础饲料去势组（BDC）、亚麻籽粉组（FS）和亚麻籽粉去势组（FSC）,每组12只,对全部大鼠进行二甲基苯蒽（DMBA）一次性灌胃（2mg/kg体重）建立诱发的乳腺癌实验动物模型;一周后对BDC组、FSC组大鼠行去势手术,连续观察21周,测定瘤体的体积和重量,并取乳腺组织进行病理学检查。结果实验期间动物一般状况良好,实验组大鼠未出现明显毒副作用;亚麻籽粉组（FS和FSC组）大鼠发生可触及肿瘤的时间较相应对照组晚2到4周;亚麻籽粉组大鼠单纯性增生和不典型增生以及乳腺癌发生率和病灶数均显著低于相应对照组（单纯性增生：FS vs BD,P=0.006＊＊;FSC vs BDC,P〈0.001＊＊;不典型增生：FS vs BD,P=0.048＊;FSC vs BDC,P=0.014＊;乳腺癌：FS vs BD,P=0.028＊;FSC vs BDC,P〈0.047＊）;亚麻籽粉组大鼠肿瘤体积和重量均小于基础饲料组;FS和FSC组研究结果提示亚麻籽粉木酚素抑制增生发生及肿瘤细胞的生长的能力与实验动物体内雌性激素水平有关（单纯性增生：P=0.008＊＊;不典型增生：P=0.042＊;乳腺癌：P=0.033＊）。结论亚麻籽粉木酚素可有效预防和降低化学诱癌剂DMBA所诱发的乳腺癌、癌前病变和单纯性增生的发生,预防乳腺癌的功能和效果受到体内雌性激素影响。本研究结果对未来实施木酚素预防乳腺癌及有效人群的筛选具有参考价值。     

小檗碱对损伤胰岛βTC6细胞相关信号分子表达的影响

目的:探讨小檗碱在棕榈酸(palmic acid, PA)诱导的胰岛β细胞发生凋亡时PTEN及AMPK的变化及其作用机制。方法:采用1.0 mmol/L PA诱导胰岛βTC6细胞损伤模型,然后给予小檗碱干预。采用流式细胞术检测βTC6细胞凋亡率,RT-q PCR法及免疫荧光法检测在PA及小檗碱作用下信号转导通路分子PTEN及AMPK表达的变化。结果:PA抑制βTC6细胞的生长并诱导其凋亡,小檗碱可缓解PA引起的βTC6的凋亡,对氧化应激具有保护作用;伴随着凋亡的发生,AMPK的表达显著降低,而PTEN的表达显著升高,表明细胞氧化损伤严重时抑制了AMPK的表达及转录,而PTEN在βTC6细胞的凋亡中具有促进作用;小檗碱治疗后,AMPK的表达增多,而PTEN的表达下降,暗示着小檗碱通过激活AMPK并抑制PTEN的表达来增强βTC6细胞的抗氧化能力。结论:小檗碱对PA引起的细胞凋亡有保护作用,同时小檗碱可能通过调节AMPK及PTEN的表达来发挥抗氧化作用。     

HPV16L1VLP纯化、鉴定及血凝抑制实验方法的建立

摘要通过昆虫细胞-杆状病毒表达系统表达HPV16L1 VLP,纯化鉴定后利用其建立血凝抑制实验,检测HPV16L1单克隆抗体的血凝抑制活性。利用重组杆状病毒感染悬浮培养的昆虫细胞表达HPV16L1蛋白,大量获得VLP;优化扩增蛋白的条件并用SDS-PAGE分析鉴定;经氯化铯密度梯度离心法纯化VLP;利用所得VLP建立血凝抑制试验,鉴定制备的HPV16L1单克隆抗体的血凝抑制活性。优化蛋白表达条件结果显示,当重组杆状病毒感染细胞的MOI=10时目的蛋白表达量最大;按此滴度感染悬浮培养的昆虫细胞,收获、纯化VLP并鉴定其特异性;利用所得VLP建立了血凝抑制实验,鉴定HPV16L1单克隆抗体的血凝抑制效价为1∶16。建立的血凝实验,可用于鉴定和检测HPV16L1相关抗体,为HPV诊断试剂的开发提供实验基础。     

粗提和纯化的HPV16L1重组蛋白为抗原的ELISA比较

为评价真核及原核细胞表达的HPV16L1粗提蛋白代替纯化的16L1蛋白作为ELISA检测抗原的可行性。实验分别用大肠埃希菌表达的HPV16L1纯化蛋白,表达16L1的大肠埃希菌破碎物及表达16L1的昆虫细胞破碎物作为抗原。在ELISA试验中与抗HPV16L1的单克隆抗体进行反应。结果证实3种包被抗原可以得出非常相近的OD值变化趋势。表明用表达16L1的大肠埃希菌破碎物和表达16L1的昆虫细胞破碎物可以代替纯化的HPV16L1蛋白作为抗原进行ELISA试验。     

HFNC与NIV治疗合并Ⅱ型呼衰的COPD患者的临床疗效对比

摘要 目的：探讨高流量湿化治疗仪（HFNC）治疗合并Ⅱ型呼吸衰竭的慢性阻塞性肺疾病患者的临床效果及安全性。方法：选择2020 年 4 月至 2022 年 3 月就诊于我院的合并Ⅱ型呼吸衰竭的慢性阻塞性肺疾病的患者共151名。随机分为接受 HFNC治疗组和NIV治疗组（HFNC组77名，NIV组74名）。分别评估患者治疗前和治疗后1小时、24小时以及治疗结束前心率（heart rate，HR）、呼吸频率（respiratory rate，RR）、氧合指数（Oxygenation index，PaO₂/FiO₂）、CO₂分压（arterial partial pressure of CO₂，PaCO₂）的变化、治疗不耐受和失败、有气管插管需求的情况、住院时间以及住院死亡率。结果：治疗后，两组各有6名患者死亡，死亡率分别为HFNC组7.8%，NIV组8.2%，组间比较差异无统计学意义（P=0.94）。两组患者治疗前后HR、RR、平均动脉压、白细胞计数、中性粒细胞百分比、C-反应蛋白、降钙素原及PaO₂/FiO₂、PaCO₂、动脉血酸碱度均无明显统计学差异。与NIV组相比，HFNC组气道护理干预次数明显减少（4±1 vs 8±2，P<0.05），皮肤破损发生率明显降低（5.2% vs 20.3%，P<0.05），住院天数明显缩短（6±2 vs 8±2，P<0.05）。结论：HFNC治疗合并Ⅱ型呼吸衰竭的COPD 患者效果并不亚于NIV，且HFNC的安全性更高，可作为该类患者的首选通气支持治疗方式。     

小檗碱通过PTEN/Nrf2途径抑制胰岛βTC6氧化应激及细胞凋亡

摘要 目的：探讨小檗碱（Berberine,BBR）在棕榈酸（palmitic acid,PA）诱导的胰岛β细胞氧化应激及凋亡中的角色及分子机制。方法：BBR和PA单独或联合处理敲低PTEN的βTC6细胞,利用MTT、Caspase-3活性检测、流式细胞术、ROS含量检测、硝基酪氨酸定量等测定各实验分组的细胞凋亡程度并比较彼此氧化应激水平,利用定量PCR以及Western blotting检测PTEN、AMPK、Nrf2的表达变化。此外,我们还评估了BBR是否可以缓解糖尿病小鼠全身炎症状态和胰岛细胞凋亡,并再次验证了BBR对糖尿病小鼠的治疗效果。结果：BBR通过降低PTEN同时升高Nrf2的表达,进而减轻PA诱导胰岛βTC6细胞ROS以及硝基酪氨酸积累,降低PA诱导性Caspase-3升高。干扰PTEN表达可以与BBR发生协同效应,即协同降低氧化应激性凋亡。经动物实验发现BBR可明显降低糖尿病小鼠血糖以及血清IL-6水平,同时在转录水平降低小鼠胰腺PTEN并上调Nrf2,TUNEL实验发现BBR可以明显抑制糖尿病小鼠胰岛细胞凋亡,而二甲双胍（Metformin, Met）未发现抑制效应。结论：BBR通过下调PTEN并上调Nrf2的表达来发挥对PA引起的βTC6细胞氧化应激以及凋亡的保护作用,而沉默PTEN可反过来与BBR形成协同保护作用。BBR与MET治疗2型糖尿病的降糖效果没有差异性,但BBR可以额外地通过PTEN/Nrf2途径发挥抗炎及抗氧化应激作用。