应用原位杂交及RAPD技术标记抗黄矮病小麦一中间偃麦草染色体异附加系

以生物素（Ｂｉｏｔｉｎ－１６－ｄＵＴＰ）标记中间偃麦草基因组 ＤＮＡ为探针,与抗黄矮病小麦－中间偃麦草染色体异附加系Ｚ６进行原位杂交,鉴定出附加的１对中间偃麦草染色体。对异附加系 Ｚ６和 Ｌ１及它们的小麦亲本进行了 ＲＡＰＤ分析,从 １２０个随机引物中,筛选出 ２个引物可以扩增出附加染色体的特异ＤＮＡ片段,可作为鉴定寻人小麦的中间偃麦草染色质的分子标记。     

携带抗黄矮病基因的中间偃麦草染色体2Ai—2特异的分子标记

小麦－中间偃麦草二体异附加系Ｚ１、Ｚ２具有一对携带抗黄矮病基因的中间偃麦草染色体２Ａｉ－２。利用中间偃麦草（Ｔｈｉｎｏｐｙｒｕｍ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍ （Ｈｏｓｔ） Ｂａｋｗｏｔｈ ａｎｄ Ｄｅｗｅｙ）和拟鹅冠草（Ｐｓｅｕｄｏｒｏｅｇｎｅｉａ ｓｔｒｉｇｏｓａ）基因组ＤＮＡ作探针,对Ｚ１、Ｚ２进行基因组原位杂交分析。结果表明,Ｚ１、Ｚ２附加的一对中间偃麦草染色体２Ａｉ－２为Ｓｔ－Ｅ染色体,Ｅ组染     

小麦-中间偃麦草双体异附加系的鉴定

利用形态学、细胞学、A-PADE和RAPD方法,对5个小麦-中间偃麦草(Thinopyrum intermedium)双体异附加系Line 1、Line 4、Line 10、Line 14和Line 15进行了鉴定。细胞学鉴定结果表明,它们根尖细胞染色体数目为2n=44,花粉母细胞减数分裂中期Ⅰ(PMCMⅠ)染色体构型为2n=22 Ⅱ,具有高度的细胞学稳定性;形态学鉴定和A-PADE电泳分析证明,Line 1和Line 15可能附加了中间偃麦草第7部分同源群的染色体,Line 10和Line 14可能附加了中间偃麦草第1部分同源群的染色体,Line4则可能同时存在多种染色体变异;RAPD分析表明,在供试的100个随机引物中,有5个引物S21、S29、S57、S121和S152能够在亲本中间偃麦草和双体异附加系中稳定扩增出特异带型,并可作为异附加系所附加染色体的特异RAPD标记。     

小冰麦异附加系TAI系列中异源麦谷蛋白基因位点的生化与分子生物学鉴定

小冰麦异附加系TAI系列的每一个材料中分别附加了1对来自中问偃麦草的染色体,附加染色体很容易丢失,使得失去附加染色体的小麦可以作为异附加系的对照材料。通过分析TAI系列异附加系及各自对照材料的高分子量麦谷蛋白亚基组成与低分子量麦谷蛋白基因的PCR图谱,鉴定出异附加系TAI-13和TAI-25中具有编码中问偃麦草麦谷蛋白的基因位点,附加的中间偃麦草染色体属于第一同源群。异附加系TAI-11中附加的中间偃麦草染色体只具有低分子量麦谷蛋白基因位点。     

大麦6H染色体特异性标记的筛选和鉴定

从大麦、小麦和小麦－大麦６Ｈ染色体附加系ＲＡＰＤ分析筛选出对６Ｈ染色体特异的２个ＲＡＰＤ标记,转换为特异性ＰＣＲ标记,利用标记对不同植物材料进行ＰＣＲ扩增鉴定。表明凡含有大麦６Ｈ染色体的材料（Ｂｅｔｚｅｓ、Ｉｇｒｉ、ＣＳ６Ｈ附加系）均能扩增出特异带;而不含６Ｈ染色体的材料,包括小科、黑麦、长穗偃麦草、中间偃麦草、簇毛麦以及含有其他大麦染色体的小麦附加系均不主增出特异带。可见,２对ＰＣＲ引物具有大麦     

小麦-中间偃麦草双体异附加系的选育和鉴定

在小麦-中间偃麦草59个杂交后代种质系中,筛选出6个小麦-中间偃麦草双体异附加系(line0605,line0607,line0609,line0610,line0611,line0625),并对其进行了形态学、白粉病抗性、细胞学和RAPD鉴定。形态学结果表明:6个双体异附加系农艺性状较好地结合了双亲的优良特点;细胞学结果表明:6个双体异附加系具有高度的细胞学稳定性,花粉母细胞减数分裂中期Ⅰ(PMCMI)的染色体构型为2n=22Ⅱ;RAPD分析表明:在供试的209个随机引物中有5个引物分别能在6个异附加系中稳定地扩增出不同的特异带型,可以作为各个异附加系所附加染色体的特异分子标记;白粉病抗性鉴定结果表明:line0605表现免疫,line0610和line0625表现高抗,line0607表现中抗,line0609和line0611表现中感。     

小麦-中间偃麦草双体异附加系的选育和鉴定

在小麦-中间偃麦草59个杂交后代种质系中,筛选出6个小麦-中间偃麦草双体异附加系(line 0605,line 0607,line 0609,line 0610,line 06ll,line 0625),并对其进行了形态学、白粉病抗性、细胞学和RAPD鉴定。形态学结果表明：6个双体异附加系农艺性状较好地结合了双亲的优良特点;细胞学结果表明：6个双体异附加系具有高度的细胞学稳定性,花粉母细胞减数分裂中期I(PMCMI)的染色体构型为2n=22II;RAPD分析表明：在供试的209个随机引物中有5个引物分别能在6个异附加系中稳定地扩增出不同的特异带型,可以作为各个异附加系所附加染色体的特异分子标记;白粉病抗性鉴定结果表明：line 0605表现免疫,line 0610和line 0625表现高抗,line 0607表现中抗,line 0609和line 06ll表现中感。     

小麦—中间偃麦草双体异附加系的选育及形态学和细胞学鉴定研究

应用在小麦品种烟农15与中间偃麦草杂交的五个世代群体中直接筛选2n=22Ⅱ植株的方法,获得11个双体异附加株,分别命名为DAL1、DAL2、……、DAL11。双体异附加株的细胞学稳定性较强,外源染色体传递频率高。形态学和细胞学鉴定结果表明：DAL1、3、5、6、8、9、10、11等8个异附加系中附加的可能是中间偃麦草第2部分同源群的染色体。 其中,DAL5、9、10、11是同一种异附加系,DAL6和DAL8为同一种异附加系,DAL3可能与之相同;DAL1与上述7个异附加系均不同。DAL2和DAL4可能分别附加了中间偃麦草第5部分同源群的1对染色体,但二者在形态上存在差异。DAL7可能附加了中间偃麦草第7部分同源群的1对染色体。旗叶卷曲是异附加系DAL、3、5、6、8、9、10、11共有的形态标记。11个异附加系可作为进一步研究和转移中间偃麦草有益基因的良好中间材料。     

小偃麦部分双二部体及其异附加系异源染色体的GISH分析

应用ＧＩＳＨ对小偃麦部分双二本ＴＡＦ４６及其衍生的６个二体异附加系的中间偃麦草染色体组种类进行了分析,鉴定,以拟鹅冠草ＤＮＡ为探针的分析结果表明,ＴＡＦ４６所含有的中间偃麦草洒色体组为合成染色体组,即６条Ａ１组染色体和８条Ｅ组染色体。在其衍生的二体异附加系中,Ｌ４和Ｌ含有Ｓｔ组染色体,Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ５含有Ｅ组染色体。ＴＡＦ４６所含有的中间偃麦草染色体的部分同源群依次为ＩＥ（Ｌ３）、２Ｓｔ（Ｌ     

单体异附加系花药培养创制小麦- 中间偃麦草纯合易位系

利用单体异附加系花药培养细胞工程途径,诱导小麦与中间偃麦草发生染色体易位,通过细胞学分析、荧光原位杂交(F ISH)和SSR鉴定出纯合易位系.研究结果表明,经单体异附加系花药培养创制出1个小麦-中间偃麦草纯合易位系99-803;其花粉母细胞(PM C s)减数分裂中期I染色体构型为18.42个环状二价体 2.57个棒状二价体 0.01个单价体;中间偃麦草的7A i-1染色体与小麦7A或7B染色体发生了非罗伯逊易位,且中间偃麦草易位片段较小;通过该途径获得纯合易位系的频率约为2%.以上结果表明,单体异附加系花药培养是一条向小麦转移异源染色体小片段(基因)的快速高效途径.     

普通小麦与东方旱麦草异附加系和异代换系的选育与原位杂交检测

旱麦草属（Ｅｒｅｍｏｐｙｒｕｍ）是用于小麦品种改良的又－潜在的植物资源。为了筛选小麦－旱麦草异附加系、异代换系,对普通小麦品种 Ｆｕｋｏｈｏ×东方旱麦草属间杂种的 ＢＣ２Ｆ３代材料的９６粒种子进行了染色体数目的检测,共检出１５粒２ｎ＝４３的种子, ８粒 ２ｎ＝ ４４的种子,进一步对以上材料进行的基因组ＤＮＡ原位杂交,共鉴定出３个单体附加系,２个二体附加系,１个双单体附加,１个小麦三体单体附加,１个附加３条东方旱麦草染色体的小麦单体,在染色体数为４２的个体中,检测出１个单体代换,１个双单体代换。根据ＢＣ２Ｆ３代自交品系来源的不同,初步认为由双单体附加自交比单体附加自交选择异附加系的效率高。     

小偃麦部分双二倍体及其异附加系异源染色体的GISH分析

应用ＴＩＳＨ对小偃麦部分双二倍体ＴＡＦ４６（２ｎ＝８ｘ＝５６）及其衍生的６个二体异附加系的中间偃麦草染色体组种类进行了分析、鉴定。以拟鹅冠草（Ｐｓ．ｓｔｒｉｇｏｓａ）ＤＮＡ为探针的分析结果表明,ＴＡＦ４６所含有的中间偃麦草染色体组为合成染色体组,即６条Ｓｔ组染色体和８条Ｅ组染色体。在其衍生的二体异附加系中,Ｌ４和Ｌ７含有Ｓｔ组染色体,Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ５含有Ｅ组染色体。ＴＡＦ４６所含有的中间偃麦草染色体的部分同源群依次为ＩＥ（Ｌ３）、２Ｓｔ（Ｌ６）、３Ｅ（Ｌ２）、４Ｓｔ（Ｌ４）、５Ｅ（Ｌ５）、６Ｓｔ（Ｌ７）、７Ｅ（Ｌ１）。     

利用生化及分子标记确定长穗偃麦草（Elytrigia elongatum,EE.2n=14） …

利用限制性片段长度多态性（ＲＦＬＰ）及等电聚焦（ＩＥＦ）技术确定普通小麦中国春－二倍体长穗偃麦草７个异附加系所附加的外源染以体与小麦染色体的部分同源性,共有８个生化标记,１３个ＲＦＬＰ标记在亲本间揭示了多态性,结果表明：长穗偃麦草的１Ｅ,２Ｅ,３Ｅ,４Ｅ,５Ｅ,６Ｅ,７Ｅ７条染色体分别与小麦染色体的１、２、３、４、５、６、７７个部分同源群具有部分同源关系,偃麦草的１Ｅ与７Ｅ、５Ｅ与７Ｅ染色体间可能     

抗白粉病耐盐小麦-中间偃麦草附加系‘山农120211’的鉴定

以中间偃麦草(Thinopyrum intermedium,2n=42)与普通小麦‘烟农15’杂交,从其杂种后代中选育出一个细胞学稳定的二体异附加系‘山农120211’,该研究对其细胞学和主要性状特点进行了鉴定。白粉病抗性鉴定结果表明,‘山农120211’成株期对白粉病的田间抗性为免疫,苗期对白粉病菌种E09表现为免疫。以耐盐品种‘山融3号’为对照进行苗期耐盐性鉴定表明,‘山农120211’耐盐级别为2级(较强)。细胞学鉴定表明:‘山农120211’根尖细胞染色体数目为2n=44,PMC MI染色体构型为2n=22Ⅱ,具有高度的细胞学稳定性。以拟鹅观草基因组DNA为探针,‘烟农15’DNA为封阻,在‘山农120211’的根尖有丝分裂细胞中检测到2条染色体具有明显的杂交信号,确定其为二体异附加系。利用该实验室筛选的71对E组染色体特异分子标记,对‘山农120211’分析显示,标记BE494262在中间偃麦草和‘山农120211’中可以稳定扩增出1条440bp特异带,而‘烟农15’中缺少此带,BE494262可作为‘山农120211’中附加中间偃麦草染色体的特异标记。利用二倍体长穗偃麦草和一套中国春-长穗偃麦草异附加系(1Ee~7Ee),进一步将BE494262定位在2Ee染色体,确定‘山农120211’所附加的中间偃麦草染色体为2Ee染色体。     

中间偃麦草染色体2Ai-2特异PCR新标记的建立和St基因组特异序列的克隆

中间偃麦草麦、小麦和小麦－中间偃麦草2Ai－2附加系Z1、Z2、X6,代换系ZD28等进行RAPD分析,从320个RAPD引物中,鉴定出2Ai－2染色体特异的2个RAPD标记OPO05650和OPMO414000。利用这2个特异OPO05和OPM04,PCR扩增普通小麦CS（ABD）及其近缘植物中间偃麦草（E1E2St）、拟鹅冠草（St）,长穗偃麦草（E）、簇毛麦（V）、黑麦（R）、大麦（H）粗山羊草（D）等基因组DNA。结果表明,OPO05650和OPO41400均是2Ai－2染色体上St基因组区域的特异标记。将上棕2个特异片段分离回收、克隆、测序,根据测序结果重新设计、合成特异引物,成功地转换RAPD标记为SCAR（sequence characterizked amplifed region）标记SC－05和SC－M4。利用SCAR标记对不同材料进行分析的结果表明,凡含有2Ai－2染色体的抗黄矮病材料及拟鹅冠草均产生一条扩增带,不含2Ai－2染色体的材料,包括小麦、长穗麦草、簇毛麦、黑麦、在麦、粗山羊草以有含有其他他中间偃麦草染色休的附加系,均没有扩增产物,说明上棕2个SCAR标记是中间偃麦草2Ai－2染色体的特异性PCR标记,且是2Ai－2染色体上St基因组区域的特异性标记。克隆与鉴定中间偃麦草的2个SCAR扩增片段TiSCO5和TiSCM4。结果表明,克隆的中间偃麦草TiSCO5和TiSCM4特异片段,分别是St基因组特异性的寡拷贝序列有多拷贝重复序列,为St基因组遗传研究的新探针。     

普通小麦-百萨偃麦草(Thinopyrum bessarabicum)二体异附加系的选育与鉴定

为转移与利用百萨偃麦草耐盐、抗病等优良基因,用普通小麦中国春-百萨偃麦草双倍体与中国春杂交,通过染色体C-分带、分子原位杂交并结合减数分裂中期I的染色体配对分析,从回交后代中选育出一套小麦-百萨偃麦草二体异附加系。对这套异附加系进行的鉴定与分析表明,各附加系除添加了一对百萨偃麦草染色体外,小麦的21对染色体未见明显变化。各附加系所添加的百萨偃麦草染色体在减数分裂中期I配对基本正常,仅有少量单价体,其自交后代中外源染色体亦能正常传递。这说明所培育的这套二体异附加系在细胞学上已相对稳定,暂分别编号为DAJ1、DAJ2、DAJ3、DAJ4、DAJ5、DAJ6和DAJ7。各异附加系中百萨偃麦草染色体在小麦族中的部分同源群归属和百萨偃麦草耐盐抗病基因在染色体上的定位研究正在进行之中。     

抗条锈病小偃麦双体异附加系山农87074-519的鉴定

综合利用抗性接种鉴定、细胞学分析、SSR分子标记和基因组原位杂交(GISH)技术相结合的方法,对从长穗偃麦草与小麦复合杂交后代中选育的抗条锈病种质系山农87074-519进行了鉴定。结果表明,山农87074-519的根尖细胞染色体数目2n=44,花粉母细胞减数分裂中期I(PMCMI)绝大多数细胞内可观察到22个二价体,平均染色体构型2n=44=21.82Ⅱ 0.36Ⅰ,它与普通小麦中国春杂种F1的多数花粉母细胞内染色体构型为2n=21Ⅱ 1Ⅰ,因此它是1个附加了1对长穗偃麦草染色体的双体异附加系;以假鹅冠草St基因组总DNA作探针进行原位杂交发现山农87074-519的44条染色体中有2条出现黄绿色杂交信号,且杂交信号遍布整条染色体,证明其附加的长穗偃麦草染色体为St基组;利用SSR分子标记技术,在170对SSR引物中筛选出特异引物BARC165,它能稳定地在山农87074-519中扩增出长穗偃麦草特异标记BARC165268;将长穗偃麦草中BARC165的特异扩增片段克隆测序后制备成探针进行原位杂交,可在山农87074-519的间期染色体和有丝分裂中期染色体检测到杂交信号。山农87074-519综合农艺性状较好,对条锈病免疫,其抗性基因为显性,且位于附加的长穗偃麦草St基组染色体上,暂将其表示为YrSt。该种质系在小麦的遗传改良中具有重要利用价值。     

抗白粉病小麦——中间偃麦草异附加系的细胞学和RAPD鉴定

利用细胞学和ＲＡＰＤ技术,对从小麦与中间偃麦草杂种后代中选育的抗白粉病异附加系ＤＡＬ６６进行了鉴定。结果证明ＤＡＬ６６根尖细胞染色体数为４４,花粉母细胞减数第一分裂中期（ＰＭＣ ＭＩ）杂色体模型为２ｎ＝２２Ⅱ。对ＤＡＬ６６及其双亲进行ＲＡＰＤ分析,从４０个随机引物中筛选出１个特异引物（ＯＰＥ－０２）能够稳定地扩增出特异带型。     

拟鹅观草St基因组ISSR特异标记的建立

以拟鹅观草(Pseudoroegneria spicata)、中间偃麦草(Thinopyrum intermedium)、长穗偃麦草(Th.elonga-tum)、二倍体簇毛麦(Dasypyrum villosum)、澳冰草(Australopyrum retrofractum)等10份小麦族物种为材料,对100条ISSR引物进行分析,结果显示引物811可以在拟鹅观草(GenBank登录号为EU368859)和中间偃麦草中扩增出一条长441 bp的特异DNA片段命名为St441,而其它供试物种均未扩出.经序列比对、软件分析结合原位杂交结果认为St441为一类新的低拷贝重复序列.利用ISSR引物811对10份不同居群的中间偃麦草、20份披碱草属物种、4份小麦-偃麦草部分双二倍体、6份小麦-茸毛偃麦草后代和12份小麦对照进行扩增,结果发现除对照小麦外均能扩增出St441;进而对小麦-中间偃麦草两套附加系进行扩增,将St441初步定位于包括第四同源群在内的8条St染色体上.同时,发现只含有整条St染色体和St染色体片段的材料能扩增出St441,而仅有Js染色体的材料未扩增出St441.因此,该标记St441可以作为检测不同背景下St染色质的分子标记.     

普通小麦-中间偃麦草TAI-27中附加染色体的显微切割及特异性探针的筛选

试验以长穗偃麦草基因组DNA为探针 ,与普通小麦 中间偃麦草TAI 2 7进行染色体原位杂交 ,表明有 4条与长穗偃麦草同源的染色体 ;以P .stipifolia (St)基因组DNA为探针 ,有 4条与St同源的染色体 .这说明TAI 2 7中有 4条St染色体 .TAI 2 7是异代换 附加系 .对TAI 2 7中附加的中间偃麦草染色体进行显微切割 ,并建立其微克隆库 ,从中筛选获得了中间偃麦草的特异性探针 ,同源性分析表明该序列为一新序列 .这为进一步筛选抗病、抗逆和优质基因打下基础 .