成年SD大鼠心肌原代成纤维细胞分离及培养的优化方案

目的:摸索及优选成年SD大鼠心肌原代成纤维细胞的体外分离、培养及鉴定的实验方法。方法:将成年SD大鼠心脏剪成小组织块,采用以下四种方案(A:0.08%胰酶+0.1%胶原酶II消化15 min,B:0.2%胶原酶II消化15 min,C:0.2%胶原酶II消化60min,D:0.2%胶原酶II消化90 min)提取成年大鼠心脏原代成纤维细胞,再通过差速贴壁分离方法培养原代成纤维细胞。采用倒置显微镜观察成纤维细胞的基本形态特征,并进行Vimentiin免疫荧光染色对培养的原代细胞进行荧光鉴定;采用台盼兰染色对培养的原代成纤维细胞存活率进行鉴定;采用细胞计数对培养的成纤维细胞生长趋势进行鉴定。结果:四种方法均能培养成纤维细胞,但单酶消化60 min可一次性提取较多细胞,并且细胞状态佳,3 d即可传代。72 h成纤维细胞Vimentin免疫荧光染色阳性率高达97%。台盼兰染色可见其细胞死亡率明显降低,并且细胞计数可见细胞生长状态极佳。结论:单酶消化60 min是提取成年SD大鼠心肌原代成纤维细胞的高效、快速、稳定的实验方法,为心脏疾病的基础及临床研究提供了较为理想的细胞学实验模型。     

树鼩原代皮肤成纤维细胞的分离培养技术

建立稳定的树鼩(Tupaiabelangeri)皮肤成纤维细胞的体外培养体系,可为有关此类细胞的实验和疾病树鼩细胞模型提供技术支持。取树鼩大腿内侧皮肤用组织块贴壁法和胶原酶Ⅰ消化法分离皮肤细胞,胰蛋白酶差别消化法纯化细胞;用MEM(10%FBS)完全培养基和含低血清生长添加物(LSGS)的培养基培养细胞;免疫荧光和蛋白印迹法鉴定细胞,并测定细胞的生长、冻存和复苏特性。经树鼩皮肤细胞分离效果比较,胶原酶消化法比组织块贴壁法更适合用于树鼩原代皮肤细胞分离;对分离及冻存复苏后细胞生长状况观察比较发现,添加了LSGS的MEM培养基更利于细胞存活、生长;细胞形态观察、免疫荧光和蛋白印迹检测鉴定所分离的细胞为树鼩皮肤成纤维细胞。成功建立了树鼩原代皮肤细胞的分离、纯化方法,并优化了该细胞的培养条件。     

藏羚与几种牛科动物成纤维细胞的特性比较

为研究高原低氧环境对哺乳动物细胞生长特性的影响,本文以高原低氧动物藏羚和同科的阿尔巴斯白绒山羊、蒙古绵羊及鲁西黄牛的耳源组织细胞为材料,利用DMEM /F12 培养液进行培养,建立了4 种动物的体外培养成纤维细胞系,并对其进行形态学观察、生长曲线绘制、凋亡检测、核型分析等生物学特性检测。结果表明:4 种动物的细胞经差异贴壁法联合消化排除法,可获得纯化的成纤维细胞,细胞形态一致且活力稳定,4 种动物细胞的形态与生长曲线无明显差异;藏羚、绒山羊、绵羊、牛同代次细胞生长倍增时间分别为26 h、22 h、23 h 和22 h;经流式细胞仪检测,细胞凋亡率分别为5.5% 、2. 7% 、8. 6% 和1.5% ;藏羚、绒山羊、绵羊与牛的染色体数目分别为60、60、54 和60。藏羚与绒山羊、牛染色体数目相同,且除性染色体外,其余均为端部着丝粒类型,而绵羊存在6 条中着丝粒类型染色体。该结果表明,在体外培养条件下,藏羚的体细胞生长特性与同科的其他物种的细胞生长特性存在明显差异。这为从细胞水平上研究藏羚对环境低氧适应的分子机理提供了基础。     

中华鼢鼠成纤维细胞长期培养及其生物学特性分析

中华鼢鼠(Eospalax fontanierii)为蒙古高原代表性动物遗传资源,本研究采集中华鼢鼠心、肝、脾、肺、肾、肌肉、气管、剑状软骨和尾尖皮肤共9种组织用于实验,其中气管、肺和剑状软骨3种组织成功建立成纤维细胞系,传了8代,并分析了这些细胞的生物学特性。主要实验方法是通过细胞计数法计算细胞的贴壁率、冻存前及复苏后的存活率、绘制细胞生长曲线;制备常规染色体标本分析染色体核型。实验结果显示,中华鼢鼠气管、肺、软骨3种组织在体外条件下培养,第3～4天出现成纤维样细胞,原代细胞分别在培养第11天、第16天、第17天,达到90%以上汇合。3种组织来源体细胞均显示成纤维细胞特征,气管成纤维细胞贴壁能力最强,24 h贴壁率最高能达到98.10%,肺成纤维细胞与剑状软骨成纤维细胞贴壁能力较弱,24 h贴壁率最高,分别为95.28%和94.88%。3种来源成纤维细胞生长曲线测定结果显示,气管成纤维细胞的增殖能力最强、肺成纤维细胞次之、剑状软骨成纤维细胞最弱。气管成纤维细胞和肺成纤维细胞在接种后的第6～7天,进入对数生长期。剑状软骨成纤维细胞在接种后第2～3天进入对数生长期。3种成纤维细胞的生长曲线均呈"S"型,其中气管成纤维细胞增殖能力最强,在24孔板的每个孔中,其最大增殖数目为2.435×10~4个,肺成纤维细胞最大增殖数目为1.813×10~4个,剑状软骨成纤维细胞最大增殖数目为1.521×10~4个。核型分析结果显示,中华鼢鼠的成纤维细胞染色体数目为2n=62,30对为常染色体,1对为性染色体。综上所述,本研究成功建立了中华鼢鼠成纤维细胞体外培养体系,并揭示了该物种成纤维细胞的基本生物学特性,为深入研究中华鼢鼠适应低氧高二氧化碳洞道生境的分子生物学和生理学机制提供了条件,为进一步研究其遗传及物种进化提供了实验材料和参考。     

双峰驼胎儿耳缘组织成纤维细胞系的建立及其生物学特性鉴定

本研究旨在建立双峰驼胎儿耳缘组织成纤维细胞系.采集双峰驼胎儿耳缘组织,用植块培养法和消化分离法对其进行原代培养,差速消化和差速贴壁法进行继代培养和细胞纯化,并对培养细胞的形态、细胞活力、生长动力学、免疫组织化学、核型、绿色荧光蛋白基因质粒(GFP)转染表达以及微生物污染等生物学特性进行了分析.结果表明,原代和传代细胞形态正常,群体倍增时间(PDT)为47.2 h,细胞生长较快;不同代数的染色体众数为2n =74;免疫组织化学鉴定波形蛋白抗体呈阳性,角蛋白抗体呈阴性;外源质粒能在该细胞内整合和正确表达;微生物污染检测呈阴性.因此该研究已成功建立了双峰驼胎儿耳缘组织成纤维细胞系,在细胞水平上保存了双峰驼这一国家重要种质资源,为基因组文库和体细胞克隆等研究提供了理想的生物材料.     

西藏小型猪胚胎成纤维细胞的分离培养及性别鉴定

目的探索和建立西藏小型猪胚胎成纤维细胞体外分离培养及性别鉴定的技术方法。方法取35d的西藏小型猪胚胎分离胚胎成纤维细胞,进行体外原代培养及传代培养,观察细胞成纤维细胞的形态和生长状况。根据猪Y染色体上性别决定基因SRY设计引物进行性别鉴定,同时以β珠蛋白作为内参基因,建立PCR反应体系鉴别胚胎的性别。结果西藏小型猪胚胎成纤维体外分离后,呈贴壁生长,快速增殖。PCR性别鉴定结果表明雄性胚胎细胞可扩增出一特异性SRY基因条带,而雌性则没有。该法可快速鉴定胚胎的性别,可用于体细胞克隆动物早期性别鉴定。结论研究结果表明利用胶原酶消化法所获得的西藏小型猪胚胎成纤维细胞可在体外稳定培养并传代,利用PCR鉴定猪胎儿性别具有简单、快速、准确的特点,可应用于克隆猪研究中体细胞系的早期性别鉴定。     

猪胎儿肾脏成纤维细胞体外培养体系的建立

本研究旨在建立猪胎儿肾脏成纤维细胞体外培养体系,并探讨其作为猪体细胞克隆供体的可能性。使用组织块培养法从体长为10cm以上的猪胎儿分离得到猪胎儿肾脏成纤维细胞,绘制了生长曲线,鉴定了细胞类型并且进行了细胞周期同期化效果的研究。结果表明:该培养体系可以支持猪胎儿肾脏成纤维细胞的体外生长,单个细胞均为梭形细胞,抗波形蛋白免疫荧光染色显示为阳性,而抗角形蛋白免疫荧光染色为阴性,分离到的细胞为胎儿肾脏成纤维细胞。使用血清饥饿法和接触抑制法诱导细胞进入G0/G1期,并且分别比较两者同期化效率,结果显示:血清饥饿2d和4d的同期化效率差异不显著,但都比8d组的高(88.97%和87.69%比82.45%,P<0.05);接触抑制4d、6d组间同期化效率差异不显著,但都比0d组的高(85.56%和85.89%比81.82%,P<0.05)。本研究在国内首次分离得到猪胎儿肾脏成纤维细胞,已经在体外传代培养到32代,其同期化效果好,可以作为体细胞克隆供体。     

临床级脐带间充质细胞制备及鉴定方法研究

目的在GLP实验室中制备并鉴定临床级脐带间充质细胞(UC-MSC)。方法新鲜获取的脐带去除血管并进行充分清洗,获得的华通胶(Wharton’s jelly)机械分离后分别进行直接贴壁法和不同的酶消化法,比较获取UC-MSC的数量差别;用不同的无血清培养基进行培养比较细胞形态是否良好,得到最佳形态的UC-MSC。体外培养第3代后进行UCMSC质检,包括细胞活性,生长曲线,无菌检测,人类相关病毒、支原体、内毒素检测,染色体核型分析,FACS免疫表型检测及分化能力检测。不同消化方法获取细胞数之间比较采用两样本配对t检验。结果胶原酶Ⅱ消化获得的UC-MSC数(5.3×10~6±0.58个/ml)与胶原酶Ⅰ+0.25﹪胰酶消化法(2.53×10~5±0.03个/ml)及直接贴壁法(2.6×10~5±0.05个/ml)之间差异有统计学意义(P0.05),与胶原酶Ⅰ消化法获取细胞数(5.1×10~6±0.57个/ml)之间差异无统计学意义(P=0.07),但培养视野最干净;Mesen Cult-ACF Medium培养获得的UC-MSC形态最佳;UC-MSC质检细胞活性冻存前达99.8﹪,冻存复苏后达99﹪;无细菌、支原体、乙肝病毒、丙肝病毒、梅毒螺旋体、艾滋病毒、肺炎支原体、EB病毒、巨细胞病毒污染;内毒素检测结果均1 EU;CD73/CD90/CD10~5阳性率达98﹪,CD34/CD45/HLA-DR呈阴性,阳性率2﹪;染色体核型分析无突变或缺失;UC-MSC具有成脂、成骨或成软骨方向分化的能力。结论通过优化分离和培养条件,采用无血清及无动物来源的培养系统,在GLP实验室内可获得临床级UC-MSC。     

绵羊胎儿成纤维细胞体外培养及转基因研究

目的用增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因转染体外培养绵羊胎儿成纤维细胞,探讨绿色荧光蛋白对绵羊胎儿成纤维细胞生物学特性的影响.方法体外分离培养绵羊胎儿成纤维细胞,经脂质体介导EGFP基因转染第一代成纤维细胞,G418筛选10～12*!d,挑选转基因单克隆细胞,传代培养,进行细胞形态观察、生长曲线以及染色体核型分析,并进行了培养细胞性别鉴定.结果整合有EGFP基因的绵羊胎儿成纤维细胞生物学行为与未转染外源基因的细胞无明显差别,根据荧光强度可直接反应外源基因的表达量.结论 EGFP基因作为体内报告基因可用于转基因细胞的研究,并将整合有EGFP基因的转基因细胞为克隆动物提供核供体奠定了基础.     

褐飞虱应对水稻抗虫物质麦黄酮刺激的唾液蛋白组学响应

为研究褐飞虱响应麦黄酮刺激的分子机理,应用差异蛋白质组学方法分析褐飞虱唾液腺响应麦黄酮刺激处理的蛋白质组变化趋势。结果表明,麦黄酮处理褐飞虱6 h差异蛋白数量90个,其中上调蛋白62个,下调蛋白28个;处理褐飞虱24 h差异蛋白数量27个,其中上调蛋白10个,下调蛋白17个,6 h的差异蛋白数量显著大于24 h。麦黄酮处理可以引起褐飞虱唾液腺丝氨酸蛋白酶及其同系物产生显著变化。通过对差异蛋白进行GO功能分析和KEGG通路分析,发现麦黄酮处理褐飞虱引起褐飞虱唾液腺蛋白变化主要集中在应激蛋白和代谢这两大类上,分别占了所有差异蛋白的50%以上,麦黄酮处理引起褐飞虱唾液响应蛋白主要参与了氨基酸代谢、唾液分泌系统、能量代谢、碳水化合物代谢等通路。     

转录因子ZnF-706在鳞翅目昆虫中的进化格局及在家蚕中的功能

【目的】探讨家蚕Bombyx mori的潜在驯化基因——转录因子ZnF-706在鳞翅目(Lepidoptera)昆虫进化过程及家蚕驯化过程中的分子进化格局;并基于CRISPR/Cas9家蚕基因组编辑平台,探讨ZnF-706基因在家蚕中的功能。【方法】首先分析了家蚕ZnF-706序列特征,并利用已发表芯片数据调研该基因在家蚕幼虫组织中的表达格局;利用Phylogenetic Analysis byMaximum Likelihood (PAML)分支检验方法,分析该基因在鳞翅目不同类群中的分子进化格局。基于已发表的家蚕-野桑蚕Bombyx mandarina群体基因组多态性数据,对ZnF-706进行基因区域人工选择信号分析;对ZnF-706基因上游2 kb的调控区域进行单核苷酸多态性位点频率检测,发掘在家蚕群体中固定下来的突变位点;针对突变位点所在区域进行转录因子结合活性预测。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除ZnF-706基因,获得纯和突变体;以野生型家蚕为对照,检测突变体的茧重及蛹重变化。【结果】家蚕ZnF-706的编码蛋白具有典型的锌指蛋白结构域。ZnF-706在家蚕5龄第3天幼虫各组织中广泛表达,尤其表皮、脂肪体和生殖腺中有很高的表达量;该基因在鳞翅目、蚕蛾总科(Bombycoidea)及天蚕Antherea yamamai 3个分支中均呈现快速进化信号,在家蚕中有强烈的人工选择信号。该基因所在基因组区域的家蚕-野桑蚕种群分歧度参数Fst明显升高,家蚕群体中的群体多样性π明显降低,表明它位于一个选择扫荡区域内;该基因在家蚕-野桑蚕中的9个SNP位点存在于上游调控区,并位于转录因子结合活性区域内。该基因的纯合家蚕突变体ΔZn F-706生存力减弱,并且茧重以及蛹重与野生型家蚕相比都显著降低。但与黑腹果蝇Drosophila melanogaster中不同的是,家蚕中该基因的突变并不致死。【结论】ZnF-706可能在鳞翅目尤其是泌丝昆虫中进化,并在家蚕驯化过程中受到选择压力,提示其对于特征性状茧丝的变异可能发挥作用。该基因可能通过对丝蛋白基因的直接调控,或通过影响家蚕的生长发育而间接地影响茧丝性状。本研究不仅为探究家养动物人工选择机制提供了来自昆虫类材料的独有证据,也为后续深入开展家蚕重要经济性状的转录调控研究提供线索。     

黄体酮对成年斑马鱼下丘脑-垂体-性腺轴相关基因转录表达的干扰效应

黄体酮(P4)是一种类固醇激素。为了探究P4的内分泌干扰效应, 选择成年斑马鱼(Danio rerio)作为受试生物, 研究了P4对斑马鱼下丘脑-垂体-性腺轴(HPG轴)相关基因转录表达影响。成年斑马鱼在不同浓度P4(2、11和16 ng•L–1)下处理21 d。结果显示: 暴露于高浓度组的P4能够抑制雌鱼大脑中促性腺激素释放激素2(gnrh2)、促性腺激素释放激素3(gnrh3), 卵泡刺激素(fshb)、雌激素受体1(esr1)基因的转录表达; 然而诱导了雄鱼大脑中fshb、黄体生成素(lhb)、雄激素受体(ar)基因的转录表达, 这些转录变化暗示了P4对成年斑马鱼有潜在的弱雄激素效应。此外, P4暴露对雌鱼卵巢和雄鱼精巢类固醇合成途径中固醇激素合成急性调节蛋白(star)、细胞色素p450介导侧链裂解酶(cyp11a1)、17α羟化酶(cyp17)、卵巢细胞色素P450芳香化酶(cyp19a1a)、11β羟化酶(cyp11b)、羟基类固醇3β脱氢酶(hsd3b)、羟基类固醇20β脱氢酶(hsd20b)、羟基类固醇17β脱氢酶3(hsd17b3)、羟基类固醇11β脱氢酶2(hsd11b2)以及受体信号途径中孕激素受体(pgr)、esr1、ar基因的转录表达没有显著影响。可见, 在P4暴露下, 斑马鱼大脑比性腺更加敏感。总而言之, P4能够改变斑马鱼大脑中HPG轴相关基因的转录表达水平, 进而对斑马鱼的内分泌系统具有潜在的危险。     

果实蝇求偶行为与求偶歌

果实蝇Bactrocera是危害经济作物的一类重要农业害虫,研发有效的果实蝇防控技术是现代农业产业发展的迫切需求。雄性不育技术是防控果实蝇高效绿色的防控方法。深入研究果实蝇求偶行为是雄性不育技术顺利开展的前提,也能为开发新防控技术提供有效的生物学靶标。本文将以果蝇研究作为对照,对果实蝇求偶行为与求偶歌的研究相关进展进行总结。果实蝇求偶行为基本属于预交配求偶行为,但其求偶歌中是否具有物种特异性的特征参数还有待验证。这为下一步开展果实蝇求偶行为与求偶歌的研究工作提供了基本依据与方向性引导。     

豆科植物修复土壤重金属污染研究进展

随着经济的发展, 生态环境污染日趋严重, 其中土壤重金属污染成为一个突出问题。利用植物修复土壤重金属污染是当前环境科学和生态学领域的研究热点之一。采用根瘤菌-豆科植物共生体系修复土壤重金属污染是一种有效的植物修复方法, 它不仅可以利用根瘤菌与豆科植物互利共生的优势来抵抗重金属胁迫, 而且其固氮作用有助于提高土壤养分。通过文献检索分析, 收集整理了我国现已发现的具有土壤重金属污染修复潜力的豆科植物, 并对根瘤菌修复土壤重金属污染的机理以及根瘤菌-豆科植物共生体系修复土壤重金属污染的研究进展进行了综述, 以期为今后利用根瘤菌-豆科植物共生体系修复土壤重金属污染的研究和实践提供参考。     

Karyotype Analysis of an Endemic Species

1 South China Botanical Garden, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510650, China; 2 Graduate University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China; 3 Key Laboratory of Plant Resources Conservation and Sustainable Utilization, South China Botanical Garden, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou, 510650, China; 4 Institute of Tropical and Subtropical Ecology, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China     

短梗千金藤,越南防己科新记录种（英文）

报道了越南防己科(Menispermaceae)一新记录种:短梗千金藤(Stephania brevipes Craib)。据文献记载,该种仅分布于泰国,现首次在越南发现其分布。本种与粪箕笃(S.longa Lour.)形态相近,但叶宽三角状卵形至三角状扁圆形,雄花序小,腋生或生于无叶的茎上,总梗较短,花萼淡黄色,花瓣红紫色,内果皮外部沟数目较少而与后者不同。还提供了该种详细的形态学描述、图版、分布及生态学等信息。凭证标本保存在越南国立自然博物馆标本馆(VNMN)和中国科学院华南植物园标本馆(IBSC)。     

光学相干层析术高分辨率活体成像泼尼松龙诱导的骨质疏松斑马鱼模型

本研究利用光学相干层析术OCT对泼尼松龙诱导的斑马鱼骨质疏松模型进行活体成像,并结合电镜能谱技术定量分析斑马鱼模型骨质的钙磷元素含量及分布情况,共同探讨OCT方法在基于斑马鱼模型开展的骨质疏松研究中的使用价值。选取40条3月龄野生型斑马鱼暴露于50μmol/L泼尼松龙溶液和含0. 5%DMSO的溶液中(对照组),28. 5℃下培养,分别于第5、10、20天取出浸药组和对照组进行OCT活体成像,比较两者光散射特征。在每个时间点的成像之后,将浸药组的5条斑马鱼处死,然后取颅骨进行元素含量电镜扫描能谱分析。本研究利用50μmol/L泼尼松龙溶液培养斑马鱼至第20天,成功构建了斑马鱼骨质疏松模型。与对照组相比,模型组活体OCT成像显示骨组织光散射减弱,光子量明显减少,呈不均匀分布。能谱元素检查结果说明颅骨内所含钙、磷比例明显下降,证实骨质疏松发生,骨量减少。OCT成像方法在对斑马鱼骨质疏松模型进行活体、实时、无创等研究方面具有重要价值,本试验也为骨质疏松疾病的研究和药物筛选等方面提供了新的有效的方法。     

500 kV国安输变电工程穿越水源保护区的生态影响与生态保护调查分析

由于经济和民生需求的严重制约, 有时输变电工程难以避免穿越重要而又脆弱的生态敏感区。输变电工程的生态影响主要包括对沿线的野生动植物及其栖息地的影响、对林草等天然植被的影响、对水土保持与水源涵养的影响。以广东珠海500 kV国安输变电工程为案例, 在调查总结工程建设期生态影响基础上, 结合环保验收和运行近十年来的生态保护工作情况, 开展生态影响后评价。结果表明, 项目按照法规要求落实相应的环保措施, 对水源保护区敏感目标密切相关的植被保护、水土保持、水源涵养与水质保护等工作落实到位, 对敏感保护目标的影响轻微, 相关经验可为类似工程项目的生态保护提供科学参考。