苗期水稻响应褐飞虱取食的基因差异表达分析

【目的】褐飞虱Nilaparvata lugens (St?l)是水稻的重要害虫之一,主要刺吸水稻韧皮部汁液为害,对水稻生产造成严重的产量和经济损失。为研究水稻响应褐飞虱取食的分子机制,对褐飞虱取食6 h后的苗期水稻进行转录组测序及基因差异表达分析。【方法】采用illumina二代测序技术获得褐飞虱取食前后水稻组织的转录组数据,利用RSEM软件进行基因表达定量和DEseq2进行差异表达分析;从差异表达基因中随机选取20个基因采用荧光定量PCR技术进行验证;采用GeneMerge软件对差异表达基因进行KEGG和GO富集分析。【结果】褐飞虱取食后,水稻转录组中的1 104个基因出现了差异表达,其中435个基因表达上调,669个基因表达下调。荧光定量PCR结果显示,20个差异表达基因中18个基因的表达变化趋势和测序结果一致,证明了转录组分析结果可靠。GO和KEGG富集分析表明,表达上调基因主要与水稻氧化应激、海藻糖合成及次生化合物代谢有关,显著富集在14个KEGG通路和30个GO功能分类中;而表达下调基因主要参与水稻纤维素、蛋白质及脂肪酸合成过程,显著富集在29个KEGG通路和26个GO功能分类。在差异表达基因中,分别有61个转录因子和13个水杨酸和茉莉酸信号通路相关基因。【结论】褐飞虱取食激发了水稻的应激反应和保护机制,同时还降低了营养合成的过程,是飞虱为害造成水稻减产的原因之一。本研究初步揭示了苗期水稻响应褐飞虱取食的差异表达基因,为研究水稻-褐飞虱互作机制以及褐飞虱抗性水稻品种培育提供了参考和依据。     

水稻麦黄酮对褐飞虱的抗性潜力

使用石油醚、乙酸乙酯、无水乙醇和水依次对抗性水稻品种IR36乙醇提取物进行萃取,并测试了4种萃取物对褐飞虱的活性。结果发现乙酸乙酯萃取物处理后3d的活性最强,褐飞虱1～2龄若虫和3～4龄若虫的死亡率分别是26．0％和48．0％。乙酸乙酯萃取物经柱层析分离得到麦黄酮。将麦黄酮定量加入人工饲料中饲养褐飞虱3龄若虫15d。结果表明,褐飞虱3、4龄若虫的排蜜露量随着麦黄酮在饲料中浓度（50～500μg／ml）的增加而减少,褐飞虱3、4龄若虫的死亡率却随着麦黄酮在饲料中浓度的增加而显著提高。当饲料中麦黄酮的浓度为500μg／ml时,褐飞虱3、4龄若虫的死亡率分别为58．21％和31．75％。麦黄酮50～500μg／ml浓度处理,褐飞虱3龄和4龄若虫的发育历期和相对生长量与对照之间没有明显的差异,表明麦黄酮有拒食作用。用500μg／ml的麦黄酮溶液涂抹到对褐飞虱敏感的水稻品种TN1植株上对褐飞虱雌成虫有明显的拒食作用和忌避产卵作用。本项研究结果表明水稻源的麦黄酮在水稻对褐飞虱的抗性中有重要的作用。     

褐飞虱成虫不同密度和取食时长胁迫下水稻植株的生理生化响应

【目的】探索褐飞虱Nilaparvata lugens不同密度与取食时长胁迫下水稻植株生理生化响应。【方法】在褐飞虱成虫3个密度(2,4和8头/株)与4个取食时长(6, 24, 48和96 h)的组合处理后，应用生物化学分析方法检测水稻植株中叶绿素(chlorophyll, Chl)与总蛋白(total protein, TP)含量，脂氧合酶(lipoxygenase, LOX)、总超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase, T-SOD)、过氧化物酶(peroxidase, POD)与多酚氧化酶(polyphenol oxidase, PPO)活性。【结果】与对照组(未接种褐飞虱成虫)相比，取食6 h时，低密度(2头/株)褐飞虱成虫引起水稻植株中Chl含量显著降低，TP含量和PPO活性显著升高；高密度(8头/株)褐飞虱成虫引起水稻植株中Chlb和总Chl含量、TP含量及LOX和POD活性显著升高。与对照组相比，取食24 h时，低密度褐飞虱成虫引起水稻植株中Chl含量和PPO活性显著降低，LOX, T-SOD和POD活性显著升高，高密度褐飞虱成虫引起水稻植株中...     

褐飞虱基因BphMIF1克隆及表达分析

【目的】克隆水稻重要害虫褐飞虱Nilaparvatalugens唾液蛋白基因BphMIF1,探析BphMIF1在响应褐飞虱取食过程中的表达谱。【方法】采用RT-PCR法克隆了褐飞虱唾液蛋白基因BphMIF1,测序后对序列进行生物信息学分析,使用实时荧光定量PCR(qPCR)对褐飞虱1-5龄若虫及成虫以及不同成虫虫体部位BphMIF1的表达量进行分析,同时对BphMIF1进行了原核表达分析。【结果】克隆得到BphMIF1基因,编码119个氨基酸。qPCR结果表明BphMIF1基因在若虫4龄期表达会迅速上调,在成虫的头、胸、腹均有表达,以腹部表达量最高。原核表达结果显示褐飞虱BphMIF1基因以0.5mmol?L-1的IPTG作为诱导浓度,诱导时间为4h表达效果较好。【结论】BphMIF1基因在褐飞虱成虫头、胸、腹部均有表达,在若虫不同发育历期其表达量有所差异且在4龄若虫时期表达量有显著上调。该结果可为BphMIF1在褐飞虱取食过程中的功能研究奠定基础。     

水稻防御信号NO对褐飞虱产卵刺激的响应

植物对昆虫产卵刺激产生的防御反应不仅可以直接抑制卵的发育,还可以为防御下一步若虫/幼虫带来的危害做准备。对褐飞虱产卵处理后水稻植株内一氧化氮(NO)合成的关键酶-硝酸还原酶基因的表达量和NO含量进行测定,对比褐飞虱取食和机械损伤处理,结果显示褐飞虱产卵能够诱导水稻硝酸还原酶基因的表达和NO的生成。处理后12 h,水稻硝酸还原酶基因表达量显著高于取食和和机械损伤处理;12-24 h产卵诱导的NO含量显著高于对照和机械损伤组水稻。褐飞虱产卵诱导水稻启动NO合成关键基因的表达和物质合成表明,与取食危害类似,水稻同样会对褐飞虱产卵刺激产生响应,诱导NO升高,启动相应的植物防御体系。     

褐飞虱成虫唾液细菌蛋白的鉴定

【目的】通过鉴定褐飞虱Nilaparvata lugens(St?l)水状唾液中的细菌蛋白,了解其唾液中的细菌种类。【方法】利用双层膜夹蔗糖溶液的方法对褐飞虱成虫唾液进行收集,超滤浓缩后进行电泳,然后利用液相色谱-电喷雾串联质谱(LC-ESI-MS/MS)方法鉴定蛋白,与Uniprot的细菌蛋白数据库进行比对从而鉴定褐飞虱成虫唾液中的细菌蛋白。【结果】在褐飞虱成虫唾液中鉴定到22种细菌的35种蛋白,这些蛋白主要参与能量代谢过程、蛋白的折叠和合成以及氨基酸代谢过程。这些细菌分布在变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes)3个门。蛋白种类较多来源于变形菌门。【结论】鉴定到蛋白的这些细菌可能在褐飞虱的生活史中扮演重要角色。     

水稻与褐飞虱的相互作用研究进展

褐飞虱(Nilapavata lugens,brown planthopper,BPH)是水稻生产中最重要的害虫.水稻与褐飞虱互作机制的研究为培育新的水稻品种做出了贡献.本文综述了栽培稻和野生稻中分离定位的抗褐飞虱基因,以及褐飞虱唾液蛋白、水稻和褐飞虱代谢物和褐飞虱共生菌在水稻-褐飞虱互作关系中的作用.目前从栽培稻和野生稻中鉴定了 40个抗褐飞虱基因,褐飞虱取食的信号转导开启水稻抗性基因的表达和防御机制的改变,包括筛管封闭、次生代谢产物的产生,以及蛋白酶抑制剂的诱导等.褐飞虱的唾液蛋白以及体内存在多种共生微生物对褐飞虱的生长发育和适应抗性都起到一定作用,但目前提出的水稻-褐飞虱分子相互作用的模型仍有许多方面有待研究.     

药用野生稻应答稻飞虱取食过程中基因表达的研究

褐飞虱和白背飞虱是水稻的刺吸式害虫。为了探讨水稻对虫害反应的分子机理,采用cDNA—AFLP(互补DNA扩增片段长度多态性)技术,研究了药用野生稻受这两种飞虱取食后基因表达的变化。通过调查约7％的虫．崮答后的药用野生稻转录本组,共分离了258个差异片段,测序112个;44个片段对应于已知或假定功能基因,其中35个基因的表达水平在白背飞虱为害后发生改变,24个基因在褐飞虱为害后改变。下调的基因比上调的基因多。有14个基因受这两种飞虱共同调节(2个上调,12个下调)。结果表明,药用野生稻对两种飞虱为害作出的反应有所不同。     

水稻响应缺铁的韧皮部汁液蛋白质组学分析

为鉴定水稻(Oryza sativa)响应缺铁的根冠长距离信号转导物质, 采用TMT标记技术分析了不同浓度铁处理下水稻韧皮部汁液的蛋白质组学变化, 共鉴定出206个差异蛋白, 其中54个蛋白表达丰度上调, 152个蛋白表达丰度下调。差异蛋白的KEGG通路分类主要包括激素信号代谢、谷胱甘肽代谢、碳代谢以及mRNA转运等代谢途径。此外, 对差异蛋白对应的生理指标进行测定, 发现激素、蔗糖、谷胱甘肽和转运蛋白等在缺铁条件下变化显著, 后续对这些差异蛋白的功能研究有助于揭示水稻响应铁素营养的长距离信号途径。     

褐飞虱Nl15基因的克隆及功能分析

【目的】植食性刺吸式口器昆虫的唾液蛋白参与调控植物抗虫防御反应,影响其对寄主植物的适应性。本研究旨在通过克隆褐飞虱Nilaparvata lugens重要唾液蛋白基因Nl15,调查其时空表达模式,明确其在褐飞虱致害性中的作用。【方法】基于褐飞虱IR56种群转录组数据,用RT-PCR克隆褐飞虱基因Nl15 cDNA序列,并进行生物信息学分析。利用qPCR检测其在褐飞虱TN1和IR56种群不同发育阶段(卵、1-5龄若虫和雌雄成虫)和雌成虫不同组织(头、胸、腹和足)中的表达模式。通过显微注射dsRNA对褐飞虱TN1和IR56种群的4龄若虫进行Nl15的RNAi,利用qPCR检测Nl15 RNAi后褐飞虱若虫中Nl15的相对表达量以及Nl15 RNAi后褐飞虱若虫取食3 d时水稻植株中防御相关基因(OsLecRK4, OsMPK10, OsWRKY24, OsLox, OsNPR1和OsGns5)的相对表达量,并生物测定Nl15 RNAi后褐飞虱的存活率以及成虫蜜露量和体质量增量。【结果】克隆了褐飞虱Nl15 cDNA序列(GenBank登录号：OK181113),其开放阅读框长1 008 bp;预测编码335个氨基酸,理论等电点为7.54,分子量为38.7 kD,含有23个氨基酸的信号肽序列和一个糖基化修饰位点,不存在跨膜结构域和其他已知的功能域;Nl15与灰飞虱Laodelphax striatellus同源蛋白氨基酸序列一致性为45%。发育表达谱结果表明,Nl15在褐飞虱各个发育阶段均表达,在3-4龄若虫中的表达量最高;组织表达谱结果表明,Nl15在褐飞虱雌成虫头部中的表达量最高,且在IR56种群头部中的表达量高于在TN1种群头部中的。RNAi实验结果表明,与注射dsGFP的对照组相比,注射dsNl15的处理组中Nl15的表达量显著降低了89.5%,褐飞虱的存活率以及成虫蜜露量和体质量增量均显著降低,上述6个水稻防御相关基因的表达量显著上调。【结论】褐飞虱IR56种群中的Nl15参与褐飞虱与水稻的防御与反防御分子互作。本研究为进一步阐述褐飞虱克服抗虫基因的机制及揭示昆虫与植物互作的分子网络提供了思路。     

不同温度下毒死蜱和噻嗪酮对褐飞虱的毒力作用

为了明确温度对杀虫剂毒杀作用的影响,本文研究了5个温度梯度(22℃、25℃、28℃、31℃和34℃)下毒死蜱和噻嗪酮对褐飞虱的毒杀作用。结果表明毒死蜱在不同温度下对褐飞虱的毒力变化与噻嗪酮有所不同。处理时间相同时毒死蜱的LC50随温度升高而逐渐下降。毒死蜱处理24 h、72 h、120 h时,毒死蜱对褐飞虱的LC_(50)在22℃下分别的50.15、16.15和15.33 mg/L,而在34℃下分别降低为6.70、4.16和1.92 mg/L。在实验的5个温度下,噻嗪酮对褐飞虱的LC_(50)没有显著差异。同一温度下,噻嗪酮的LC50随处理时间的增加而降低,但没有显著差异。在全球变暖的大环境下,明确温度对毒死蜱和噻嗪酮的毒力影响状况,对于杀虫剂的合理使用具有一定的指导意义。     

不同地理种群褐飞虱体内共生酵母菌的个体大小及数量差异

褐飞虱腹部脂肪体内普遍存在共生酵母菌,该类共生菌在褐飞虱的生理代谢和营养利用等方面起着重要作用。采用冷冻切片技术结合显微摄像系统观察法测定不同地理种群褐飞虱体内共生酵母菌的个体大小和数量。试验结果表明,不同地理种群褐飞虱雌(雄)成虫体内共生菌的个体大小和数量差异显著,依次为:对照种群>广西种群>浙江种群>福建种群。结合虫体内脂肪和糖元含量的分析得出,褐飞虱体内共生酵母菌的长、宽度和数量与脂肪和糖元含量显著正相关。文章从共生酵母菌的角度解释了不同地理种群褐飞虱致害性变异的内在原因,并推测,迁飞过程所导致的褐飞虱体内脂肪和糖元的消耗影响了该类共生菌的数量和质量,并最终导致褐飞虱对抗性品种水稻的致害性减弱。     

诱导水稻抗褐飞虱的化学激发子筛选

【目的】化学激发子具有毒性低、不易产生抗药性等特点,因此开发基于化学激发子的害虫防控技术,能够降低农药的使用量,促进农业生产的可持续发展。本研究旨在筛选能够诱导水稻产生对褐飞虱Nilaparvata lugens抗性的化学激发子。【方法】将茉莉酸(JA)、茉莉酸甲酯(MeJA)、水杨酸(SA)、水杨酸甲酯(MeSA)、油菜素内酯(BR)、苯甲酸苄酯(BB)、独脚金内酯(SLs)、萘乙酸(NAA)、吲哚丁酸(IBA)、草酸钠(SO)、硅酸钾(PS)和叶枯唑(Bis)12种化合物以根吸或叶鞘涂抹处理水稻,测定这些化合物处理水稻后褐飞虱的卵孵化率和24 h总产卵量。【结果】12种候选化合物中,仅茉莉酸甲酯、油菜素内酯和苯甲酸苄酯对褐飞虱卵孵化率和24 h总产卵量有显著影响。5 mg/L MeJA根吸处理水稻使褐飞虱的卵孵化率显著降低(达58.8%,降低了20.1%),而0.5 mg MeJA叶鞘涂抹处理水稻同时降低了褐飞虱的卵孵化率(达53.3%,降低了35.4%)和24 h总产卵量(达203.5粒/株,降低了15.6%),且其涂抹的浓度越高,褐飞虱的卵孵化率和24 h总产卵量越低。5 mg/L BR根吸处理水稻可以显著降低褐飞虱的卵孵化率(达59.5%,降低了22.1%),但是不影响褐飞虱的24 h总产卵量;褐飞虱的卵孵化率随BR处理浓度增高而降低,其浓度为20 mg/L时,褐飞虱的卵孵化率下降了41.8%。5 mg/L BB根吸处理水稻可以显著降低褐飞虱的24 h总产卵量(达100.3粒/株,降低了26.2%)。体外试验结果表明,MeJA和BR处理对褐飞虱卵孵化率无明显影响,说明两者对褐飞虱卵无直接毒害作用。【结论】化合物茉莉酸甲酯、油菜素内酯和苯甲酸苄酯可以提高水稻对褐飞虱的抗性,其中茉莉酸甲酯和油菜素内酯具有化学激发子的作用。     

褐飞虱唾液腺中水稻抗性适应基因的分离

褐飞虱Nilaparvata lugens (Stål)是一种危害水稻的重要害虫, 在取食水稻时其唾液腺分泌的一些物质能激发水稻产生一系列生理生化反应。为了从褐飞虱唾液腺中得到编码这些分泌物的基因, 本研究运用抑制差减杂交法（suppressed subtractive hybridization, SSH）和镜像选择（mirror orientation selection, MOS）法, 分别以取食抗虫水稻B5和敏感水稻TN1的褐飞虱唾液腺cDNA为tester和driver, 构建了一个含有768个克隆子的抑制差减杂交文库。经筛选得到102个EST, 插入序列长250~1 000 bp, 代表35个单基因。其中28个表达上调, 7个表达下调。经GenBank里的blastx在线分析工具分析, 除了约1/3的转录序列没有相匹配的蛋白质外, 其他EST所代表的氨基酸序列与已知蛋白存在不同程度的相似度, 如海藻溏酶、 卵黄蛋白原、 Ca²⁺结合蛋白、 组织蛋白酶B （cathepsin B）、 黏液样蛋白（putative mucin-like protein）、 羧酸酯酶（carboxylesterase）和碳酸酐酶（cah-3 carbonic anhydrase）等, 且多数蛋白含有信号肽, 推测与分泌有关。本研究将为进一步研究刺吸式昆虫中的激发子蛋白奠定了一定的基础。     

沉默类胰岛素多肽(Ilp)基因对褐飞虱翅和卵巢发育及海藻糖代谢的影响

【目的】类胰岛素多肽(insulin-like peptide, Ilp)位于胰岛素信号通路最上游,其在糖类物质调控中发挥关键作用。本研究则旨在探究Ilp在褐飞虱Nilaparvata lugens海藻糖代谢平衡的调控作用。【方法】以褐飞虱5龄若虫为实验材料,采用RNAi技术干扰Ilps的表达,观察RNAi后褐飞虱的表型以及雌成虫的卵巢发育。RNAi 48 h与72 h后,采用生化方法测定褐飞虱5龄若虫体内海藻糖、糖原和葡萄糖含量以及海藻糖酶活性变化;采用qPCR检测海藻糖酶基因(TRE1-1, TRE1-2和TRE2)和海藻糖合成酶基因(TPS1和TPS2)的表达量变化。【结果】dsRNA可有效抑制Ilps的表达,导致褐飞虱出现异常翅型,且注射dsIlp3以及dsIlp1+dsIlp2+dsIlp3+dsIlp4发现褐飞虱2日龄雌成虫卵巢发育不完全。分别注射dsIlp1-4和dsIlp1+dsIlp2+dsIlp3+dsIlp4后48 h均能显著提高葡萄糖含量;分别注射dsIlp2, dsIlp3及dsIlp4后48 h显著提高了糖原含量;分别注射dsIlp3和dsIlp4后48 h能够显著提高海藻糖含量,而分别抑制Ilp2和Ilp4 72 h后海藻糖含量显著下降,但注射dsIlp1+dsIlp2+dsIlp3+dsIlp4后48和72 h海藻糖含量都显著上升。注射dsIlp1+dsIlp2+dsIlp3+dsIlp4后72 h可溶性海藻糖酶活性均显著上升,膜结合型海藻糖酶活性则在分别注射dsIlp3, dsIlp4和dsIlp1+dsIlp2+dsIlp3+dsIlp4后72 h显著下降;分别注射dsIlp1, dsIlp2和dsIlp4后TRE1-1, TRE1-2, TRE2, TPS1和TPS2的表达量显著下降。【结论】沉默Ilp基因对褐飞虱的发育以及繁殖有一定的阻碍作用,且能够提高褐飞虱体内葡萄糖与糖原的含量,下调海藻糖酶与海藻糖合成酶基因表达量,提高可溶性海藻糖酶的活性,进而调控海藻糖的代谢。     

利用抑制差减杂交技术分离受水稻抗性调控的褐飞虱基因

为分离受水稻抗性调控的褐飞虱Nilaparvata lugens基因, 以取食感虫水稻台中1号和高抗水稻B5的2叶1芯秧苗24 h的褐飞虱4龄若虫为起始材料, 采用抑制差减杂交技术构建了两个群体间的正反向差减cDNA文库。通过斑点杂交从差减文库中筛选代表受水稻抗性调控的基因的cDNA克隆, 进行测序和功能分析, 挑选具功能的基因进行Northern杂交验证。结果表明, 通过斑点杂交筛选到的98个阳性克隆代表92个互不重复的单基因, 其中25个与动物的已知蛋白基因存在较高的同源性。Northern杂交表明, 这25个基因有11个表达上调, 8个表达下调, 提示它们可能在褐飞虱适应抗性水稻过程中发挥了重要作用。本研究结果为克隆上述新基因的全长cDNA序列及进一步研究其在褐飞虱与水稻互作中的功能奠定了基础。     

褐飞虱HSP70与HSP90基因特性及温度诱导表达

[目的]研究不同温度条件下,褐飞虱HSP70和HSP70基因的表达变化,探索HSP蛋白在褐飞虱对温度胁迫适应中的作用。[方法]利用同源克隆方法获得HSP70A和HSP70基因序列,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测HSPs基因在不同温度诱导下的表达量。[结果]褐飞虱HSP70A基因包含1 896 bp的ORF,编码631个氨基酸; HSP70基因包含2 193 bp的ORF,编码730个氨基酸。HSP70A在38℃高温下,表达量出现不同程度下降; HSP70B和HSP70在32℃及38℃高温下能够被诱导高表达。在低温诱导下,HSP70A及HSP70B的表达出现不同程度下降(HSP70A在15℃处理6 h及10℃处理2 h例外),HSP70表达量在低温下为显著或者极显著上升。[结论] HSP70B和HSP70在褐飞虱的高温胁迫下起重要的作用;在低温下则主要通过提高HSP70的表达来保护机体内细胞的正常生理代谢。     

褐飞虱两个糖转运蛋白的功能分析及调控海藻糖代谢的影响

海藻糖转运蛋白（Trehalose transporter,Tret）可将昆虫“血糖”——海藻糖由脂肪体转运到血淋巴中,是维持昆虫体内海藻糖平衡的重要转运蛋白。本研究通过对褐飞虱Nilaparvata lugens两条糖转运蛋白序列（NlTret1、NlTret1 X1）进行生物信息学分析,并利用RNAi技术沉默NlTret1与NlTret1 X1基因,探讨其对褐飞虱调控海藻糖代谢的生物学功能。生物信息学分析表明,NlTret1与NlTret1 X1分别有1 353 bp和1 488 bp的开放阅读框,编码具有450和495个氨基酸残基,蛋白分子量大小为49.984 kDa和53.059 kDa,理论等电点pI为6.53和7.46;保守结构域分析NlTret1和NlTret1 X1分别包含10个和12个跨膜结构域,属于MFS超家族;二级结构以及三级结构预测NlTret1和NlTret1 X1主要包含无规卷曲和α螺旋结构。进化树分析显示NlTret1和NlTret1 X1皆与同为半翅目昆虫的Tret1蛋白亲缘关系接近。与注射dsGFP相比RNAi后显著抑制了靶标基因的表达量。荧光定量检测海藻糖代谢通路TRE和TPS基因,结果显示注射dsNlTret1 48 h后NlTRE1-1、NlTPS2基因表达量极显著下调,NlTRE1-2、NlTRE2与NlTPS1、NlTPS3基因表达量极显著上调;而注射dsNlTret1 X1则为NlTRE1-1、NlTRE2与NlTPS1、NlTPS2基因表达量极显著降低,NlTRE1-2和NlTPS3基因表达量极显著增高。注射dsNlTret1与dsNlTret1 X1后海藻糖酶活性均显著性降低,同时NlTret1的沉默显著抑制了糖原含量和海藻糖含量,NlTret1 X1的沉默仅使葡萄糖含量显著增高。褐飞虱两条糖转运蛋白序列经初步分析确定为海藻糖转运蛋白,这两个海藻糖转运蛋白在转运糖类物质中发挥着不同的作用,其中NlTret1 X1可能参与葡萄糖运输功能,而NlTret1则更可能参与海藻糖特异性转运。研究结果有利于探究海藻糖转运蛋白Tret调控海藻糖代谢的作用机制,为将来通过其调控昆虫海藻糖代谢平衡治理褐飞虱等害虫提供理论依据。     

褐飞虱蜕皮激素合成相关Halloween基因的克隆及功能分析

【目的】蜕皮激素(ecdysone)是调控昆虫生长发育和繁殖的重要激素,其合成主要由5个称为Halloween基因编码的细胞色素P450(spook/CYP307A1,Phantom/CYP306A1,disembodied/CYP302A1,shadow/CYP315A1和shade/CYP314A1)参与。褐飞虱Nilaparvata lugens系东南亚和东亚地区危害最为严重的水稻害虫之一,以蜕皮激素调控基因为靶标,应用RNAi技术防控褐飞虱正逐步成为研究热点。本研究旨在揭示褐飞虱体内Halloween基因的功能,为褐飞虱的防控和新农药的开发提供理论依据。【方法】本研究基于褐飞虱基因组和转录组数据,利用RT-PCR技术克隆了参与蜕皮激素合成的5个Halloween基因;利用生物信息学软件预测分析其编码蛋白的结构特性;利用MEGA5.0邻接法构建系统进化树;利用实时荧光定量PCR技术研究其时空表达特征;利用注射法RNAi技术分析Cyp314a1基因表达下调对褐飞虱生长发育和繁殖的影响。【结果】克隆获得褐飞虱的5个Halloween基因,即NlCyp307a1(Gen Bank登录号:KM217014.1),NlCyp306a1(Gen Bank登录号:KM217013.1),NlCyp302a1(Gen Bank登录号:KM216995.1),NlCyp315a1(Gen Bank登录号:KM216998.1)和NlCyp314a1(Gen Bank登录号:KU928172)。进化分析表明,这5个基因分属于CYP2和线粒体两大类群,并与各自的同源基因聚类在一起,说明Halloween基因和蜕皮激素合成途径在昆虫进化过程中十分保守。Nl CYP314A1具有5个P450的保守结构域和两个跨膜结构域,是典型的线粒体酶。qRT-PCR检测结果显示,5个Halloween基因的表达量在整个褐飞虱5龄若虫期内呈现波动状,且均在5龄若虫蜕皮后的24 h和60 h出现表达量峰值。NlCyp314a1在褐飞虱发育各个龄期均表达,且在成虫中表达量最高;NlCyp314a1在胸部表达量较头部和腹部高,其在脂肪体中的表达量最高,其次是在足、表皮、翅芽中,中肠中表达量最低。利用注射法RNAi对NlCyp314a1基因进行沉默后,NlCyp314a1的表达量在注射后第4天较对照极显著降低84.6%(P0.01),同时蜕皮激素通路下游的响应关键基因Nl FTZ-F1的表达量较对照极显著降低64.1%(P0.01)。表型观察发现,NlCyp314a1表达量的下调导致了褐飞虱蜕皮困难,出现畸形虫体,第7天死亡率大于95%,且NlCyp314a1表达量的下调导致了褐飞虱卵巢发育畸形。【结论】褐飞虱蜕皮激素合成相关的Halloween基因在进化上非常保守,Halloween基因功能的研究揭示了褐飞虱体内Halloween基因对于褐飞虱蜕皮和繁殖的重要性。其表达水平的降低导致了褐飞虱生长发育和繁殖受阻,提示褐飞虱Halloween基因可用于褐飞虱蜕皮和繁殖进程的调控,同样也为Halloween基因在褐飞虱防治方面的潜在应用提供了依据。     

褐飞虱遇险释放挥发性物质的提取及成分分析

利用Y型嗅觉仪测定不同试验条件下褐飞虱Nilaparvata lugens(Stl)对同类昆虫遭遇草间小黑蛛Erigonidium graminicolum Sundvall捕食时挥发性物质的行为反应,并利用固相微萃取、气相色谱与质谱技术分离鉴定挥发性物质。目的明确褐飞虱遇险释放挥发性物质的最佳提取条件,并分析该挥发性物质的成分。结果表明,用乙酸乙酯、甲醇和正己烷分别提取"褐飞虱2³龄若虫+草间小黑蛛成蛛"共存体释放的挥发性物质,发现乙酸乙酯提取物能引起褐飞虱极显著的逃避行为。用不同褐飞虱虫量(100、300、600头/500 mL瓶)、不同提取时间(1、3、6 h)和不同溶剂温度(15、25、35℃)分别提取"褐飞虱23龄若虫+草间小黑蛛成蛛"共存体释放的挥发性物质,发现乙酸乙酯提取物能引起褐飞虱极显著的逃避行为。用不同褐飞虱虫量(100、300、600头/500 mL瓶)、不同提取时间(1、3、6 h)和不同溶剂温度(15、25、35℃)分别提取"褐飞虱2³龄若虫+草间小黑蛛成蛛"共存体释放的挥发性物质,发现3003龄若虫+草间小黑蛛成蛛"共存体释放的挥发性物质,发现300⁶00头、3600头、3⁶ h和25℃下的提取物能引起褐飞虱极显著的逃避行为,明确了褐飞虱遇险释放挥发性物质的最佳提取条件。利用固相微萃取法分别萃取"褐飞虱26 h和25℃下的提取物能引起褐飞虱极显著的逃避行为,明确了褐飞虱遇险释放挥发性物质的最佳提取条件。利用固相微萃取法分别萃取"褐飞虱2³龄若虫"释放的挥发性物质和"褐飞虱23龄若虫"释放的挥发性物质和"褐飞虱2³龄若虫+草间小黑蛛成蛛"共存体释放的挥发性物质。气相色谱分析表明,保留时间16 min、21.5 min时,"褐飞虱"与"褐飞虱+草间小黑蛛"共存体释放的挥发物均出现新峰;保留时间10.94 min时,仅"褐飞虱+草间小黑蛛"共存体释放的挥发物出现新峰。推测保留时间10.94 min时出现的峰为褐飞虱被草间小黑蛛捕食时释放的示警挥发物。质谱分析进一步表明,这种挥发物具有与(E)-2-己烯醛相类似的化学结构,但其实际结构还需深入研究。