水稻叶绿体蛋白质在生长发育过程中的表达研究

在植物中,叶绿体是负责光合作用的细胞器,对叶绿体内的各种生物过程人们已经积累了很多知识,但对叶绿体蛋白质的表达还所知甚少．为了解水稻叶绿体蛋白质在正常生长发育过程中的表达情况,尝试基于抗体的水稻蛋白质组学策略．选取了10个水稻叶绿体基因,利用表达的蛋白质或合成的抗原决定簇片段制备了抗体,用Western blotting检测了相应蛋白质在5个发育时期的根、茎、叶及穗组织中的表达．发现10个蛋白质均在叶片中表达,在根中不表达．与原初反应相关的叶绿素A/B结合蛋白1和2(CAB1和CAB2)、与电子传递相关的放氧增强蛋白1(OEE1)及与活性氧清除相关的过氧还蛋白过氧化物酶(2-CysP)和硫氧还蛋白(Trx)在茎中表达．而在卡尔文循环中发挥作用的Rubisco活化酶(RCA)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、果糖二磷酸醛缩酶(FBPA)和景天庚酮糖-1, 7-二磷酸酶(SBPase)蛋白质在茎中不表达．在穗中,这些蛋白质的表达时序不同,CAB2和2-CysP在穗发育的全程表达,CAB1和OEE1在中后期表达,而卡尔文循环中的蛋白质只在中期表达．有意思的是,卡尔文循环中的蛋白质表达模式相似,这一结果从蛋白质表达水平支持它们之间的相互衔接关系．此外,实验还揭示了可能的蛋白质修饰、二聚体及不同的转录本现象．将目标基因的表达谱与转录谱进行比较,发现二者间有一定的平行性,但也有明显的区别．以水稻叶绿体蛋白质为对象,直观并相对定量地揭示了它们的表达模式,为阐释其功能提供了信息,也为基于抗体的水稻蛋白质组学策略提供了一个初步数据．     

甜菜夜蛾核多角体病毒泛素基因的克隆及原核表达

甜菜夜蛾核多角体病毒(Spotoptera exigua multi-nucleopolyhedrovirus,SeMNPV)泛素基因ubiquitin被克隆和序列分析,该基因编码区全长243bp,编码80个氨基酸残基,预计蛋白质分子量为9.4kDa.将这一ubiquitin基因克隆到原核表达载体pET-28a上,转化至BL21(DE3)中,用IPTG进行诱导表达,对表达的条件进行了优化.用异源的泛素单克隆抗体检测目的蛋白,Western blot实验证明所表达的蛋白是泛素蛋白.同时,我们制备了特异性的抗体,为以后的研究工作做了基础.通过计算机软件Gendoc对不同来源的泛素进行分析,结果显示,病毒中的泛素与真核细胞中的泛素相比较,泛素的氨基酸序列有较大的变化,杆状病毒的泛素基因在分子进化上可能有比较独特的途径.     

甜菜夜蛾核多角体病毒泛素基因的克隆及原核表达

甜菜夜蛾核多角体病毒（Spotoptera exigua multi-nucleopolyhedrovirus,SeMNPV)泛素基因ubiquitin被克隆和序列分析,该基因编码区全长243bp,编码80个氨基酸残基,预计蛋白质分子量为9.4kDa。将这一ubiquitin基因克隆到原核表达载体pET-28a上,转化至BL21（DE3）中,用IPTG进行诱导表达,对表达的条件进行优化,用异源的泛素单克隆抗体检测目的蛋白,Western blot 实验证明所表达的蛋白是泛素蛋白。同时,我们制备了特异性的抗体,为以后的研究工作做了基础,通过计算机软件Gendoc对不同来源的泛素进行分析,结果显示,病毒中的泛素与真核细胞中的泛素相比较,泛素的氨基酸序列有较大的变化,杆状病毒的深入素基因在分子进化上可能有比较独特的途径。     

两个水稻胚乳启动子的克隆及表达分析

启动子的克隆对基因表达及基因工程研究有重要意义。根据数据库中EST丰度,从水稻中克隆了两个预测在水稻胚乳中高效表达的启动子Os772和Os359,并将启动子片段与GUS报告基因融合,构建了重组表达载体。通过农杆菌介导方法将其导入水稻愈伤组织细胞。转基因水稻经GUS组织化学分析显示,Os772和Os359能启动GUS基因在水稻胚乳中表达但不能在根、茎、叶和花中表达。该结果表明Os772和Os359为两个水稻胚乳特异性启动子。     

水稻CSN5B蛋白抗血清的制备及其应用

目的:克隆水稻COP9信号复合物5B亚基(CSN5B)的基因,原核表达CSN5B蛋白并制备多克隆抗体。方法:用RT-PCR技术从日本晴水稻中扩增得到CSN5B蛋白基因Os CSN5B并将其连接至p EASYTM-T5 Zero克隆载体,然后将其亚克隆至原核表达载体p ET-32a+,并导入大肠杆菌BL21plys S宿主菌中诱导表达;重组的CSN5B融合蛋白经Ni-NTA His.Bind Resin纯化后免疫兔子制备多克隆抗体,并经Western印迹分析。结果与结论:获得了CSN5B蛋白的特异性抗体,Western印迹显示CSN5B蛋白在水稻植株中呈高水平表达,为进一步探讨该基因的功能奠定了基础。     

人CD24分子成熟多肽的原核表达及抗体制备

目的: 为获得抗人CD24分子成熟多肽核心蛋白(hCD24N)的多克隆抗体。方法: 制备CD24表达阳性的人肿瘤细胞cDNA,采用PCR法扩增hCD24N的编码基因,构建pGEX-KGV-hCD24N原核表达质粒;转化大肠杆菌BL21(DE3),乳糖诱导表达;经GST亲和柱层析、SDS-PAGE和Western blotting制备并鉴定纯化的GST-StraptagII-hCD24N融合蛋白;免疫新西兰大白兔制备抗血清并用rProtein A亲和柱层析纯化多克隆IgG抗体;用间接ELISA法测定抗体效价,Western blotting鉴定抗体特异性,同时采用细胞免疫荧光检测技术对抗体的特异性和应用可行性作进一步评价。结果: 实现了hCD24N基因的克隆以及在原核细胞中的可溶性重组融合表达,得到了纯化后的目的融合蛋白,并以其为免疫原获得了效价高于1:100 000的抗hCD24N多克隆抗体,Western blotting及细胞免疫荧光检测证明该抗体与当前市售的抗人CD24抗体具有相似的免疫反应特异性,并且能够与CD24阳性人肿瘤细胞表达并加工的高度糖基化CD24天然分子发生特异性抗原-抗体反应。结论: 抗hCD24N多克隆抗体的成功制备为进一步以CD24分子为靶点的肿瘤生物学基础研究以及相关癌症的诊断试剂开发奠定基础。     

重组铜绿假单胞菌外膜蛋白OprI的原核表达及多克隆抗体制备

[目的]构建铜绿假单胞菌外膜蛋白OprI原核载体,表达、纯化OprI蛋白,制备并鉴定小鼠多克隆抗体。[方法]通过分子克隆获得OprI蛋白的表达菌株;利用SDS-PAGE电泳切胶纯化、尿素梯度复性获得OprI蛋白,免疫小鼠制备OprI蛋白多克隆抗体;采用ELISA法检测抗体滴度;Western blotting检测抗血清特异性;DNAMAN与MEGA软件分析OprI蛋白系统进化关系。[结果]OprI重组载体双酶切、DNA测序鉴定结果,以及蛋白表达、纯化条带大小与预测一致。ELISA法获得OprI抗血清滴度达1:3200倍,Western blotting证实抗血清具有很好的特异性。OprI序列的系统发生分析发现不同细菌存在很高的同源性。[结论]成功克隆、表达与纯化OprI蛋白,制备并鉴定小鼠多克隆抗体。为OprI蛋白免疫学功能研究奠定基础。     

水稻NADP-苹果酸酶的原核表达、纯化和抗体制备

构建了水稻NADP-ME_2基因cDNA的原核表达载体pQE30,并诱导表达出有生物学功能的融合蛋白。用Ni-NTA琼脂糖亲和层析纯化出NADP-ME_2融合蛋白,并测定了融合蛋白酶学特性(V_(max)、K_m、K_(cat)、底物特异性)。用纯化的NADP- ME_2融合蛋白免疫家兔,制备出抗水稻NADP-ME特异性抗体。全蛋白双向电泳后Western印迹表明水稻中至少有4个NADP-ME家族蛋白质成员。     

重组人骨硬化蛋白的表达、纯化及多克隆抗体制备

[目的]构建人骨硬化蛋白(Sclerostin,SOST)原核载体,表达、纯化SOST蛋白,制备与鉴定小鼠多克隆抗体。[方法]通过分子克隆获得SOST蛋白的表达菌株;利用SDS-PAGE电泳切胶纯化、尿素梯度复性获得SOST蛋白,免疫小鼠制备SOST蛋白多克隆抗体;采用ELISA法检测抗体滴度;Western blotting检测抗血清特异性;DNAMAN与MEGA软件分析SOST蛋白系统进化关系。[结果]SOST重组载体双酶切、DNA测序鉴定结果,以及蛋白表达、纯化条带大小与预测一致。ELISA法获得SOST抗血清滴度达1:6 400倍,Western blotting证实抗血清具有很好的特异性。SOST序列的系统发生分析发现动物具有显著不同的进化趋势。[结论]成功克隆、表达与纯化SOST蛋白,制备并鉴定小鼠多克隆抗体。为SOST蛋白功能研究奠定基础。     

猪FcγRIII的原核表达及多克隆抗体的制备

目的：构建猪FcγRIII 基因的原核表达载体,诱导表达重组蛋白,制备鼠抗猪 FcγRIII 抗血清。方法：从质粒pTG19-T-FcγRIII中用PCR方法克隆到编码完整猪FcγRIII蛋白分子的基因片段,将其插入到原核表达载体pET-32a中,构建了猪FcγRIII 原核表达载体pET-FcγRIII ,转化大肠杆菌BL21 (DE3) ,IPTG诱导蛋白表达,经尿素洗涤纯化后,以纯化后的融合蛋白FcγRIII-His 为抗原免疫小鼠,获得抗血清。Western blotting、ELISA 法鉴定获得的抗血清,ELISA 结果显示抗体效价为1∶16000,具有高度特异性,免疫印迹结果显示制备的多抗可以与重组猪FcγRIII蛋白特异性结合。结果：成功构建猪FcγRIII原核表达载体,纯化到融合蛋白FcγRIII-His,用纯化的融合蛋白免疫小鼠制备了多克隆抗体,Western blotting、ELISA 法证实多克隆抗体制备成功。结论：成功获得了猪 FcγRIII 多克隆抗体,为进一步研究猪FcγRIII 蛋白的功能奠定了基础。     

一个水稻高效表达启动子Os252的分离

植物基因的表达受启动子的控制,高效表达启动子的分离及功能分析不仅是植物基因工程研究的重要研究方面,也是表达调控研究的重要内容。根据EST数据克隆了一个预测在水稻茎中高效表达的启动子Os252。将该启动子与GUS基因构建成表达载体并转入水稻。转基因水稻PCR分析表明,GUS基因已经成功地整合进水稻基因组中。GUS组织化学分析表明,Os252能启动GUS基因在水稻叶、茎以及胚乳中表达。进一步GUS酶活性的测定表明,叶和胚乳中Os252启动子活性分别是35S启动子的1.9和2.5倍。由于Os252来自于水稻,在叶和胚乳中活性高于35S启动子,因此该启动子可望用于水稻基因工程研究。     

生育前期遮光对水稻灌浆期剑叶生理特性及籽粒生长的影响

通过盆栽试验研究了生育前期（插秧至孕穗期）遮光对水稻分蘖、灌浆期剑叶生理特性、籽粒生长、产量及其构成因素的影响.结果表明：前期遮光使水稻分蘖数明显降低（降低26.72%）,齐穗期与成熟期发生延迟;遮光结束后,水稻灌浆期剑叶叶面积、可溶性糖含量分别比对照增加了33.86%和30.23%;每穗实粒数、千粒重、籽粒终极生长量、最大灌浆速率、平均灌浆速率分别比对照降低了8.65%、4.81%、9.74%、20.22%和19.13%;有效穗数与产量分别降低了25.26%和39.56%,差异显著;灌浆速率峰值的出现时间提前了1.66 d,实际灌浆时间延长了6.80 d.与弱耐荫水稻品种相比,耐荫品种灌浆前中期的剑叶叶绿素a、叶绿素b、叶绿素(a+b)含量增加,灌浆期的剑叶叶面积增加幅度大,蛋白氮、可溶性糖含量及叶绿素 a/b升高,籽粒终极生长量及千粒重接近对照,减产幅度相对较低.     

The rpl16a gene for ribosomal protein L16A identified from expressed sequence tags is differentially expressed during sexual development of Aspergillus nidulans

We obtained 305 expressed sequence tags (ESTs), which are from the poly(A) site to the most proximal MboI site, from mycelia at the early sexual developmental (ESD) stage of Aspergillus nidulans. By comparison of these ESTs with those obtained previously from the vegetative stage and from the late sexual developmental stage followed by Northern blot analyses, genes of 17 ESTs were identified as being expressed more abundantly at the ESD stage than at the vegetative stage. Five of 17 genes were expressed more abundantly in the presence of the veA gene or the nsdD gene, suggesting that these 5 genes may be involved in sexual development. In a gene of one EST, appearing three times among 305 ESTs and identified by GenBank, polyadenylation seemed to occur at two sites. Nucleotide sequences of the gene having the EST and its cDNA revealed that the gene can code for a 202-amino-acid polypeptide with an estimated molecular mass of 23 kDa. The deduced amino acid showed 73% identity to Saccharomyces cerevisiae ribosomal protein L16A (RPL16A), and therefore the gene was named rpl16a. A. nidulans RPL16A had a putative leucine zipper motif and a basic leucine zipper motif like those of other organisms. The expression level of the rpl16a gene, present as a single copy in this organism, reached a maximum after 2 h, decreased thereafter, and increased again 30 to 50 h after the end of induction of sexual development. These results clearly indicated that the rpl16a gene is expressed differentially during sexual development.     

Characterisation of rice anther proteins expressed at the young microspore stage

In combination with two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (2-DE) protein mapping and mass spectrometry analysis, the pattern of gene expression in specific tissues at a specific stage can be displayed and characterised. We used this approach for rice (Oryza sativa L. cultivar Doongara) to display and assign identity to proteins in the anthers at the young microspore stage. Over 4000 anther proteins in the pI range of 4-11 and molecular mass range of 6-122 kDa were reproducibly resolved after silver staining, representing about 10% of the estimated total genomic output of rice. Two hundred and seventy-three protein spots have been extracted either from polyninylidene diffluoride membrane blots or from colloidal Coomassie blue stained 2-DE gels and analysed by N-terminal sequencing, Matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry (MS) analysis or tandem MS sequencing. This enabled identification of 53 anther protein spots representing 43 different proteins. Using the publicly available rice expressed sequence tag (EST) database at the National Centre for Biotechnology Information, a further 37 protein spots were matched to ESTs. After BLAST searching with these ESTs, we were able to predict the identity of 22 of these protein spots. Proteome reference maps of rice anthers have been constructed according to the SWISS-2DPAGE standards and are available for public access at http://semele.anu.edu.au/2d/2d.html.