五个WRKY转录因子在水稻叶片生长和抗病反应中的表达研究

WRKY是植物基因组中最大的转录因子家族之一,它们在抗病及其他信号转导途径中发挥着重要的调控作用．为了解水稻WRKY的功能,我们选择了5个WRKY转录因子,用免疫印迹技术调查了它们在水稻叶片生长和在Xa21介导的白叶枯病抗性反应中的表达丰度变化．结果表明,OsWRKY13、23和71在叶片中表达,且随叶片生长而逐步增加,至成熟期略有下降,但在叶片中检测不到OsWRKY45和OsWRKY53的表达信号．在Xa21介导的白叶枯病抗性反应中,OsWRKY45、53和71均受诱导表达,而OsWRKY13和 OsWRKY23蛋白质的表达没有可见的变化．进一步比较OsWRKY45、OsWRKY53和OsWRKY71在抗、感和对照(Mock)反应中的表达,发现它们在抗、感反应中均发生相似变化．上述结果说明,OsWRKY13和OsWRKY23可能在叶片正常生长过程中发挥作用,OsWRKY45和OsWRKY53可能在水稻-白叶枯病菌互作过程中发挥作用,而OsWRKY71在二种条件下均有功能．     

水稻病程相关PR1家族蛋白质在叶片生长及与白叶枯病菌互作反应中的表达

病程相关(PR)蛋白质经常被用作抗病反应的分子标记。利用免疫印迹(WB)技术检测了7个PR1家族蛋白质在水稻(Oryza sativa)叶片生长及与白叶枯病菌互作反应过程中的表达,发现6个PR1家族蛋白质在叶片生长中有表达。检测PR1蛋白质在Xa21介导的抗白叶枯病过程中的表达,结果显示PR1#052、PR1#072、PR1#073和PR1#121四个蛋白质在抗病反应后期呈上调或诱导表达,PR1#071则表达下调。进一步比较它们在抗病、感病和对照(Mock)反应中的表达丰度,发现在抗病和感病反应中的变化幅度均明显大于对照反应,推测这些PR蛋白质在水稻-白叶枯病菌互作反应中发挥作用。另外,对PR1基因上游启动子区的cis元件进行了分析。该研究初步揭示了水稻PR1家族蛋白质的表达谱,为进一步了解PR1蛋白质的功能提供了线索。     

水稻OsPR10A的表达特征及其在干旱胁迫应答过程中的功能

利用免疫印迹(WB)分析了水稻(Oryza sativa) OsPR10A在其不同生长时期、不同组织部位及多种非生物逆境胁迫下的表达特征, 发现OsPR10A在干旱、盐胁迫以及茉莉酸甲酯(MeJA)和脱落酸(ABA)诱导下表达量明显升高, 表明该蛋白可能在干旱和盐胁迫应答过程中发挥作用。为证明这一推测, 我们构建了OsPR10A超表达载体, 经农杆菌介导转化水稻, 获得超表达OsPR10A的纯合株系。田间表型观察表明, 转基因株系株高变矮、穗长变短、结实率降低。用20% PEG6000在水稻种子萌发过程中进行干旱处理, 结果显示, OsPR10A超表达株系的根长和芽长均显著高于野生型, 证明超表达OsPR10A可增强水稻萌发期耐旱性。该研究有助于增进人们对水稻OsPR10A功能的了解。     

担子菌交配型基因的克隆及功能研究进展

担子菌中已有２０多个交配型基因被克隆,Ａ、Ｂ位点的交配型基因具有明显不同的结构特征。Ａ位点的交配型基因编码两类含相似同源结构域的蛋白质,两种蛋白质形成异源二聚体,调节依赖Ａ因子的发育过程;而Ｂ位点的交配型基因编码信息素及其受体。交配型基因编码的同源结构域蛋白质在植物、动物和菌类中都具有广泛的保守性。     

NPTⅡ蛋白质在转基因水稻中的表达特征研究

nptⅡ编码新霉素磷酸转移酶,是转基因实验中最常用的筛选标记基因之一.本研究中,表达了重组新霉素磷酸转移酶(NPTⅡ)蛋白质,制备了单克隆抗体,建立了用免疫印迹检测转基因水稻中NPTⅡ蛋白质的方法,调查了NPTⅡ蛋白质的表达特征,包括遗传特征、表达时空特征、表达丰度和亚细胞定位等.结果表明,该方法可检测到单粒稻米的0.25%(约0.025 mg)样品中的NPTⅡ蛋白质,NPTⅡ的表达符合显性遗传规律,根据NPTⅡ的表达可对转基因T1代种子进行阴阳性及纯合株系的鉴定,对T1幼苗中NPTⅡ丰度的分析可为纯合单株的鉴定提供参考信息.定量分析表明苗期叶片中NPTⅡ蛋白质的含量约为鲜重的0.08‰.在Ca MV-35S启动子驱动下NPTⅡ蛋白质在水稻苗期、成株期的叶片和根部组织中表达量较高,而在分蘖期、孕穗期较低,NPTⅡ在不同时期的根、茎、叶、穗子、花及种子等组织中均有表达,只是在分蘖节、茎节、穗轴和花药等组织中表达量相对较低.此外,NPTⅡ蛋白质的表达主要定位在细胞质中.综上所述,本研究建立了具有应用价值的检测NPTⅡ蛋白质的免疫印记方法并系统揭示了其在水稻中的表达特征.     

水稻U-Box蛋白质在不同发育时期的表达分析

真核生物基因组中广泛存在U-Box基因,其编码蛋白大部分是泛素系统中决定底物特异性识别的E3蛋白,其构象与RING-finger极其相似．U-Box蛋白质能促进底物蛋白泛素化降解,对细胞内异常蛋白的降解及质量控制方面发挥着重要的作用．水稻基因组中有77个U-Box蛋白质,系统了解它们的表达可为功能研究提供数据．制备针对水稻U-Box蛋白质的抗体,了解水稻中U-Box蛋白质在不同发育时期的表达信息,为功能研究积累数据．选取了4个水稻U-Box蛋白质,其共同结构特点为U-Box结构在N端,C端有ARM结构．用计算机软件预测抗原决定簇,细菌体系体外表达、纯化U-Box蛋白质的片段,免疫动物制备多克隆抗体,用Western blotting检测U-Box蛋白质在水稻品种93-11苗期地上部和地下部、分蘖期根和茎、孕穗期剑叶和幼穗、开花期剑叶和穗子、成熟期剑叶和种子中的表达,并与EST数据库中公布的U-Box蛋白质EST数据进行了比较分析．体外克隆表达后,获得了纯化的蛋白质,制备的抗体特异性强,蛋白质印迹(Western blotting)检测可见一条明显的主带,其中Os06g01304和Os12g38210两个蛋白质的表观分子质量与预测分子质量相符,Os01g66130和Os08g01900两个蛋白质的表观分子质量低于预测分子质量．4个U-Box蛋白质在水稻生长发育的不同时期或部位基本上是组成型表达,且表达量接近．对NCBI上公布的来自274个文库100万条以上的EST进行分析,可以看出4个U-Box蛋白质EST的数量分布大致均匀,与Western blotting结果揭示的组成型表达平行,与ATPase、HSP81-3、EGF-1 alpha和RuBisCo等对照基因相比,U-Box基因的EST数目相对很少,说明它们属于低丰度转录的基因．选取了4个水稻U-Box蛋白质,通过抗原决定簇预测,表达片段蛋白,制备了特异性抗体,证明了这一技术路线的可行性．利用抗体对水稻不同发育时期材料进行蛋白质表达谱研究,发现这些U-Box蛋白质呈组成型表达,与EST数据揭示的结果具有平行性．所制备的抗体也为相关功能研究,如免疫共沉淀、ChIP-on-chip、Pull-down以及在抗病、抗逆反应中U-Box蛋白质的表达等,积累了 资源．     

抗菌肽的筛选策略及其应用研究进展

抗菌肽是生物体产生的、抵抗外源病原物侵袭并具有广谱抗微生物作用的多肽类物质,是天然免疫系统的重要组成部分。从首次发现抗菌肽以来,现在已经获得了上千个有不同活性的抗菌肽候选者。回顾和总结了抗菌肽筛选的策略,包括经典方法、差异显示法、基于核酸的方法以及基于生物信息学分析法等,并重点介绍了最近提出的一种高通量筛选方法。最后本文对抗菌肽的临床应用研究,尤其是对进入临床评价阶段的抗菌肽研究进展进行了综述。     

担子菌交配型基因的克隆及功能研究进展

担子菌中已有２０多个交配型基因被克隆,Ａ、Ｂ位点的交配型基因具有明显不同的结构特征。Ａ位点的交配型基因编码两类含相似同源结构域的蛋白质,两种蛋白质形成异源二聚体,调节依赖Ａ因子的发育过程;而Ｂ位点的交配型基因编码信息素及其受体,交配型基因编码的同源结构域蛋白质在植物、动物和菌类中都具有广泛的保守性。     

水稻转录因子WRKY42的转录、表达及其与W-box的结合特征分析

WRKY是植物中最大的转录因子家族之一.本文对水稻WRKY42基因的转录分析发现,该基因在水稻苗期和花药中转录,其蛋白质可在各时期的叶片中检测到.在Xa21介导的抗白叶枯病过程中,接菌后期可检测到明显的诱导表达条带,比较其在抗、感和对照反应中的表达丰度发现,在抗、感反应中的表达相似但均明显大于对照反应,推测WRKY42蛋白质在水稻-白叶枯病菌互作反应中发挥作用.我们克隆并在细菌中表达了WRKY42蛋白质,采用微量热泳动(microscale thermophoresis)技术,调查了WRKY42与病程相关基因PR1a和PR1b启动子区顺式元件W-box的互作,发现它们之间可发生特异结合,其解离常数分别为73.3μmol/L和58.3μmol/L.上述数据提供了WRKY42调控下游基因的直接证据,支持WRKY42在水稻抗病过程中发挥作用.文章提出了WRKY转录因子在水稻与白叶枯病菌互作过程中的作用模式.     

水稻白叶枯病抗性基因Xα21和稻瘟病抗性基因Pi-d2激酶蛋白质在毕赤酵母中的表达及条件优化

[目的]白叶枯病和稻瘟病是最主要的水稻病害,Xα21是水稻白叶枯病抗性基因,Pi-d2是稻瘟病抗性基因,二者都编码类受体激酶蛋白质.本研究旨在毕赤酵母系统中表达XA21和PI-D2激酶蛋白质.[方法]用Xα21和Pi-d2的激酶区PCR产物,构建了pPICZαA-Xα21K、pPICZαA-Pi-d2K重组质粒,酶切及测序验证后,将重组质粒线性化,转化到毕赤酵母菌株中,系统地比较了不同酵母菌株(KM71、GS115、X33),不同甲醇浓度(1%、2%、3%),不同pH(pH5、pH6、pH7、pH8)值,不同诱导时间(24 h、48 h、72 h)条件下激酶蛋白质的表达情况.[结果]XA21和PI-D2激酶蛋白质可以在毕赤酵母中表达,但表达的蛋白质不能分泌到培养基上清中,而只能在菌体中检测到,对表达条件的系统比较发现,毕赤酵母菌株KM71和X33、2%的甲醇诱导浓度、pH5和48 h以上的诱导时间有利于激酶蛋白质的表达,最后我们在酵母裂解物上清中获得了纯化的考染可见的激酶蛋白质.[结论]在毕赤酵母中表达了XA21和PI-D2激酶蛋白质,为下一步生化特性研究奠定了基础.