一种包装AAV2/5的重组单纯疱疹病毒的构建

为了得到一种可以包装AAV2/5和表达绿色荧光蛋白的重组单纯疱疹病毒,设计并构建了一个由AAV2rep基因和AAV5cap基因嵌合而成的rep2cap5基因,然后,利用一套携带HSV1基因组的粘粒系统(cos6、cos28、cos14、cos56、cos48),将rep2cap5基因插入cos6粘粒上HSV1基因组片段的UL2基因中,而将EGFP的表达单位插入cos56粘粒上HSV1基因组片段的UL44基因中,用这2个重组粘粒与其它3个粘粒(cos14、cos28、cos48)共转染BHK-21细胞获得了重组病毒HSV1-r2c5-EGFP并进行了空斑纯化。HSV1-r2c5-EGFP病毒能够在BHK-21细胞连续传代,并且可以观察到几乎所有的感染细胞都能产生绿色荧光。用PCR方法以及Southern杂交方法表明所获得的HSV1-r2c5-EGFP中携带有rep2cap5基因,用HSV1-r2c5-EGFP感染携带报告基因LacZ的AAV载体细胞株,获得了具有感染性的重组AAV2/5-LacZ。结果表明,所获得的重组单纯疱疹病毒HSV1-r2c5-EGFP可提供AAV2/5载体包装所需的全部辅助功能,是一种能简便、高效制备重组AAV2/5病毒的通用性辅助病毒。     

建立分泌型荧光素酶基因标记的原位肝癌模型及用于干扰素β基因治疗评价

旨在建立一种分泌型荧光素酶基因标记的小鼠原位移植型肝癌模型并观察其对干扰素β基因治疗的反应。首先建立稳定表达分泌型荧光素酶Gluc(Gaussia princeps luciferase)的小鼠肝癌细胞Hepa 1-6/Gluc;将该细胞通过脾注射至C57BL/6小鼠肝脏建立原位移植型肝癌模型,通过检测外周血Gluc活性监测小鼠体内肿瘤生长情况;用此模型观察水动力注射干扰素β质粒DNA的抗肿瘤效果。结果表明,通过脾注射Gluc基因标记的Hepa 1-6细胞可以建立小鼠原位移植型肝癌模型;外周血Gluc活性可以有效反映体内接种肿瘤细胞的数量和肿瘤的生长情况;通过监测外周血Gluc活性可灵敏反映干扰素β基因治疗对肿瘤生长的抑制作用。本研究表明,利用Gluc为报告基因建立的小鼠原位移植型肝癌模型可以体外实时监测肿瘤的生长情况,并能灵敏可靠地用于抗肿瘤治疗效果的评价。     

一种高效快速浓缩腺相关病毒载体的方法

腺相关病毒载体(adeno associatedviralvector,AAVvector)是一种具有良好应用前景的基因治疗载体。研究中往往需要高滴度的重组AAV病毒(>105v g /细胞),为此利用完整的腺相关病毒颗粒具有耐受有机溶剂的特点,创造性地采用了一种用乙醇沉淀重组AAV病毒的方法,达到了高效、快速浓缩AAV载体的目的。结果表明,乙醇沉淀法可以高效浓缩AAV载体,并且对病毒的结构和活性没有明显影响。用这种方法可以方便地将低滴度的AAV病毒变成高滴度,解决动物体内实验中每点注射体积受到限制的问题。