应用免疫电镜技术快速检测菜豆黄花叶病毒、马铃薯M病毒和燕麦花叶病毒

应用免疫吸附电流技术(ISEM)可有效地检测腐汁液中的菜豆黄花叶病毒(BYMV)、马铃薯M病毒(PVM)和燕麦花叶病毒(OMV)。BYMV,PVM和OMV三种抗血清的适宜工作浓度和对铜网的适宜包被时间均为1000倍和1小时,对同源病毒的适宜捕获时间分别为4℃下2、2和8小时。PVM和OMV的病汁液检测灵敏度均为稀释4000倍,而BYMV病汁液稀释16000倍时还能检测到少量病毒料子。ISEM捕获法和修饰法的结果表明,这三种病毒之间无血清学交叉反应。     

单抗免疫斑点法和组织印迹法检测侵染蝴蝶兰的建兰花叶病毒

应用抗建兰花叶病毒(CymMV)的单克隆抗体, 建立了快速检测蝴蝶兰病样的免疫斑点法(Dot-ELISA)和组织印迹法(Tissue blot-ELISA)。CymMV单抗稀释8000倍时, Dot-ELISA可检出病毒粗汁液的最大稀释度为1:10240; Tissue blot-ELISA中样品1次平切后1~5次印迹与Dot-ELISA样品1:80稀释结果相当, 6~8次印迹与Dot-ELISA 1:320稀释结果相当, 前8次印迹均可以得到满意的检测效果。Tissue blot-ELISA的灵敏度略低     

单抗免疫斑点法和组织印迹法检测百合无症病毒*

应用抗百合无症病毒(Lilysymptomlessvirus,LSV)的单克隆抗体,建立了快速检测田间样品的免疫斑点法(Dot-ELISA)和组织印迹法(Tissueblot-ELISA)体系。LSV单抗稀释2,000倍时,Dot-ELISA中病叶粗汁液可被检出的最大稀释度为1∶640。Tissueblot-ELISA中样品一次平切后第1次印迹与Dot-ELISA样品1∶40稀释的结果相当,前4次印迹均可获得满意的显色效果。常规Tissueblot-ELISA的灵敏度低于Dot-ELISA,     

应用F（ab′）2—酶联吸附分析法检测大麦黄花叶病毒

F(ab′）2酶联免疫吸附分析法（F(ab′）2－ELISA）成功地用于大麦黄花叶病毒（BaYMV)的常规检测和诊断,其步骤是先用稀释1000－4000倍的抗血清F(ab′）2包被反应板,加待测样品和稀释1000倍的同种抗血清或IgG,然后再加入A蛋白碱性磷酸酯酶和底物,测定OD值。比较试验表明,ELIS稀释缓冲液加入1％小牛血清或1％全脂奶粉,BaYMV的测检灵敏度可提高达2．5－5．0ng/ml,病叶汁液检测终浓度为稀释1600－3200倍。我国BaYMV分离物与英国分离物的血清学性质完全一致。BaYMV在大麦病株中以叶部含量较高,茎中含量次之,根部测不出病毒。检测和诊断田间样品,即使有的样品已不断鲜,也均能得到满意的结果。此方法也成功地用于大麦温和花叶病毒（BaMMV)、小麦黄花叶病毒（WYMV）、燕麦花叶病毒（OMV）和燕麦金色条纹病毒（OGSV）等禾谷多粘菌传麦毒的检测,这5种病毒的血清学关系研究表明,除BaYMV和WYMV之间具有血清学关系以外,其余彼此均不反应。     

应用F(ab')_2~-酶联吸附分析法检测大麦黄花叶病毒

F(ab′)_2酶联免疫吸附分析法(F(ab′)_2-ELISA)成功地用于大麦黄花叶病毒(BaYMV)的常规检测和诊断.其步骤是先用稀释1000—4000倍的抗血清F(ab′)_2包被反应板,加待测样品和稀释1000倍的同种抗血清或IgG,然后再加A蛋白碱性磷酸酯酶和底物,测定OD值。比较试验表明,ELISA稀释缓冲液加入1％小牛血清或1％全脂奶粉,BaYMV的测检灵敏度可提高达2.5—5.0ng/ml,病叶汁液检测终浓度为稀释1600—3200倍。我国BaYMV分离物与英国分离物的血清学性质完全一致。BaYMV在大麦病株中以叶部含量较高,茎中含量次之,根部测不出病毒。检测和诊断田间样品,即使有的样品已不新鲜,也均能得到满意的结果。此方法也成功地用于大麦温和花叶病毒(BaMMV)、小麦黄花叶病毒(WYMV)、燕麦花叶病毒(OMV)和燕麦金色条纹病毒(OGSV)等禾谷多粘菌传麦毒的检测,这S种病毒的血清学关系研究表明,除BaYMV和WYMV之间具有血清学关系以外,其余彼此均不反应。     

建兰花叶病毒单克隆抗体的制备及检测应用

用建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CymMV)免疫的BALB/C鼠脾细胞与SP2/0鼠骨髓瘤细胞融合,经筛选克隆,获得3株能稳定传代并分泌抗CymMV单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞(2C6、5B7和12G9),分别制备它们的单抗腹水。其中5B7和12G92株单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10-6,3株单抗的抗体类型及亚类均为IgG1,轻链均为κ链。利用单克隆抗体建立了抗原包被间接ELISA(ACP-ELISA)检测CymMV的方法。蝴蝶兰病叶作1∶10240倍稀释、提纯CymMV病毒浓度为4.87ng/mL(每孔的病毒绝对量为0.487ng)时,该方法仍能检测到病毒。利用ACP-ELISA方法检测了田间样品,发现CymMV在兰花上发病很普遍。     

马铃薯Y病毒组病毒高产量提取方法的建立

本文报道了高产量提取芜菁花叶病毒（ＴｕＭＶ）、莴苣花叶病毒（ＬＭＶ）、芋花叶病毒（ＤＭＶ）和大豆花叶病毒（ＳＭＶ）的提取方法。本方法通过使用高盐浓度的磷酸盐缓冲液以及在缓冲液中加入氯化镁和脲,并用ＴｒｉｔｏｎＸ－１００作为澄清剂,替代常规使用的氯仿和正丁醇,成功的提取到了大量病毒粒子,上述四种病毒提取的得率分别是ＴｕＭＶ为１７３．３ｍｇ／ｋｇ病叶,ＬＭＶ为９６ｍｇ／ｋｇ病叶,ＳＭＶ为１９９．２ｍｇ／ｋｇ病叶,ＤＭＶ为１７６．６ｍｇ／ｋｇ病叶。     

应用斑点免疫结合法检测植物病毒

用改进的斑点免疫结合法,检测了烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒、豇豆花叶病毒、芋花叶病毒、柑桔速衰病毒和柑桔顽固病螺原体。无论用单克隆抗体还是多克隆抗体,全血清还是提纯的IgG,均获得满意的结果。直接法与间接法结果相同。在测定豇豆花叶病毒和芋花叶病毒时,与酶联免疫吸附试验和免疫电镜进行比较。表明无论是对纯化病毒还是感病植物汁液,其测定的敏感性均优于后二法,豇豆花叶病毒的可测感度是0.35ng,芋花叶病毒为0.83ng。以含0.5％吐温20的Tris缓冲液封闭硝基纤维素薄膜固相载体的未结合部位,其效果与牛血清白蛋白相同。应用碱性磷酸酶标记抗体以及羟基吲哚磷酸盐和氮蓝四唑为底物较合适,这种底物可在室温下长期保存,且反应产物为不褪色的紫色。易于观察和保存。     

浙江榨菜病毒病病原鉴定

从浙江桐乡和海宁的花叶或叶片皱缩、植株矮化的榨菜(Brassica juncea Coss)上分离毒源,摩擦接种5种鉴别寄主,在鉴别寄主上都出现不同症状;间接酶联免疫吸附法(In-direct ELISA)检测,芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus,TuMV)的检出率为87.5％,黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)为73.08％,两者复合侵染率为65.38％,所有的样本都没有检测到烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)     

黄瓜花叶病毒衣壳蛋白存在于被其侵染的烟草叶绿体中

用原生质体法制备出高纯度的完整叶绿体经SDS-PAGE电泳,银染后,发现黄瓜花叶病毒(CMV)侵染的烟草病叶叶绿体蛋白质图谱和健叶叶绿体相比,多出一条染色较弱的迁移率与CMV衣壳蛋白质相同的带,经Western转移,用CMV游离衣壳蛋白亚基抗血清进行斑点酶联(Immunoblot)检测,证明这条带就是CMV衣壳蛋白质。健康叶绿体中加入去掉叶绿体的病叶汁液而制备出的叶绿体中无CMV衣壳蛋白质,说明这不是在叶绿体提纯过程中得到的假象,即衣壳蛋白质存在于被CMV侵染的完整叶片叶绿体中。这个结果否认了以往报道的CMV衣壳蛋白质不存在于烟草叶绿体中的结论。另外还发现,叶绿体中的衣壳蛋白质浓度与叶片症状严重程度呈正相关。     

THE DETECTION OF CUCUMBER MOSAIC VIRUS IN SINGLE APHIDS

Abstract  Cucumber mosaic virus (CMV) was detected in single aphids Myzus persicae and Aphis gossy pii by dot immunobinding assay (DIBA). The DIB A procedure with the lowest detectable concentration endpoint of 0.16ng/ml of purified CMV, or 0. 32pg per sample dot of 2μI antigens, satisfied the sensitivity required for the detection of CMV in single virus-carrying aphids. The aphid extracting method of dipping the stylets dissected from aphid heads in the droplets of small volume (2–5p1) of suitable buffer not only ensured the highly concentrated Firuses fully released from the aphid stylets, but decreased the interference of non-virus materials from aphids to minimum as well, and thus overcame the two major difficulties in the detection of plant viruses in vectors. The virus-carrying rates tested by DIBA had good coincidence with the transmission rates by bioassay. Undoubtedly, such breakthroughs in the technique of detecting nonpersistent viruses in aphid vectors are of great epidemiological importance.     

侵染天南星科植物病毒的分子鉴定及其生态学研究

通过病毒粒子部分提纯和形态学观察,发现侵染我国南方天南星科植物的病毒主要有线状和球状两种形态．经病毒基因组序列分析确定线状病毒为芋花叶病毒(DsMV);经血清学反应和序列分析确定球状病毒为黄瓜花叶病毒(CMV)．CMV CP基因序列同源性分析的结果表明,侵染天南星科的CMV是相对独立的种内变异类型,归属于亚组L同时,CMV存在对天南星科植物的适应性变异．对采自我国海南、湖南、浙江、上海等地的126个天南星科植物样品进行RNA核酸斑点杂交检测,获得病毒检测结果。海南省样品DsMV的检出率为73．3％,CMV的检出率为46．7％;湖南省样品DsMV的检出率为100％,CMV的检出率为38.5％;浙江省样品DsMV的检出率为93．0％,CMV的检出率为7．0％;上海市样品DsMV的检出率为100％,尚没有检测到CMV,首次证实了自然条件下CMV作为天南星科植物主要病毒的存在,在我国南方地区,该病毒对天南星科植物的自然侵染受到气候、季节和寄主等生态因子的影响。DsMV则在天南星科植物上普遍存在。     

利用小RNA深度测序技术鉴定半夏病毒病病原

RNA沉默是真核生物体内由病毒来源的干扰小RNA（virus derived small interfering RNA, vsiRNA）沉默复合物介导目标RNA特异降解的一种保守机制,通过对vsiRNA分析可进行植物病毒病原鉴定。本文利用小RNA深度测序技术对感病半夏叶片进行鉴定,结果发现,表现典型花叶症状的半夏叶片受到大豆花叶病毒（Soybean mosaic virus, SMV）、黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus, CMV）、芋花叶病毒（Dasheen mosaic virus, DsMV）、魔芋花叶病毒（Konjac mosaic virus, KoMV）、烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus, TMV）等多种病毒的复合侵染。为明确SMV山西半夏分离物（SMV-SXBX）的进化关系,进行SMV-SXBX全基因组克隆与分析,获得SMV-SXBX全长为9 735 nt,编码一个由3 105个氨基酸组成的多聚蛋白质。通过核苷酸与氨基酸序列比对发现,SMV-SXBX与半夏分离物P同源性最高,分别为91.1%和94.1%,且系统发育分析表明,SMV-SXBX与半夏SMV分离物P聚为一簇。同时,也对vsiRNA进行了系统分析,研究结果有望为半夏SMV的有效防治提供一定科学依据。     

CMV抑制PVYN CP基因沉默及其介导的抗病性

以前曾报道用RNA介导的抗病毒策略,获得了高度抗病的表达马铃薯Y病毒坏死株系外壳蛋白基因(PVY^N CP)的转基因烟草,并对T1、T2代转基因植株进行了遗传和抗病性分析。此次以T,代转基因植株为试验材料,在筛选高度抗病植株并证明其抗病性是基于转基因沉默的基础上,采用Northern杂交的方法,证明CMV侵染抑制了转基因植株中PVY^N CP基因的沉默,而且CMV对PVY^N CP基因沉默的抑制部位是发生在接种后的新生叶上,接种叶及其下部叶片中PVY^N CP基因沉默则未受到影响。采用ELISA方法对CMV PVY^N复合接种的转基因植株进行PVY^N检测,结果表明,接种叶及下部叶没有检测到PVY^N,植株叶片对PVY^N表现为抗病。而在CMV接种后植株新生叶中则检测出了高滴度的PVY^N,植株叶片对PVY^N表现为感病。该文报道了在表达PVY^N CP基因的RNA介导抗性转基因植株中,异源病毒侵染抑制了转基因的沉默,并导致转基因植株的抗病性丧失。     

侵染菊花的黄瓜花叶病毒的初步鉴定和血清学检测

侵染菊花的黄瓜花叶病毒的初步鉴定和血清学检测张海保,朱西儒,张云开（中国科学院华南植物研究所广州５１０６５０）关键词菊花,黄瓜花叶病毒,间接ＥＬＩＳＡ菊花（Ｃｈｒａｙｓａｎｔｈｅｍｕｍｍｏｒｉｆｏｌｉｕｍ）病毒病是危害菊花的一类主要病害。国外文献报道...     

Molecular Characterization of a Chinese Soybean Mosaic Virus Isolate by RT-PCR,cDNA Sequence Analysis and Direct Expression of PCR Products in Bacteria

Soybean mosaic virus (SMV) causes one of the most severe viral diseases in soybean ( Glycine max L. ) and is known to contain many pathogenically and serologically related isolates. In the present study, the authors have obtained cDNAs to all cistrons of a Chinese SMV isolate, SMV-ZK, by RT-PCR. By analyzing the nucleotide and amino acid sequence of the HC-PRO, Nib and CP cistrons, it was found that SMV-ZK was highly homologous to the G2 strain of SMV, thus confirming the existence of G2-1ike isolates in soybean crop in China. The amplified cDNAs were directly cloned into a bacterial expression vector. With the exception of the P3 cistron, expression of the cDNAs of all other cistrons in bacteria gave rise to polypeptides of expected molecular weight. The expressed viral proteins were subsequently purified by gel elution. The preparation of viral-specific cDNAs and gene products will be useful in future functional study of the SMV genome.