利用脊髓灰质炎病毒5＇NCR和RNA聚合酶基因可提高外源基因表达

将含脊髓灰质炎病毒(PV)RNA聚合酶的不同长度基因片段克隆到载体pSG5质粒上,分别构建了4个表达RNA聚合酶的质粒.体外转录实验证明,pSG5-POL1.99和pSG5-POL2.03质粒转染细胞的提取物促进了特异的RNA转录,表明两质粒可表达RNA聚合酶.将PV的5＇NCR序列插在载体pGREEN LANTERN-1的CMV启动子下游,构建了pGREEN LANTERN-1-5＇NCR质粒;用LacZ基因替换GFP基因分别插入到PGREEN LANTERN-1和pGREEN LANTERN-1-5＇NCR质粒上,构建成 pLacZ LANTERN-1和pLacZ LANTERN-1-5＇NCR质粒.表达RNA聚合酶的质粒与pLacZ 5＇NCR调控表达报告基因的质粒共转染,明显提高了报告基因的表达水平,表明PV的表达调控元件和RNA聚合酶基因可用于构建外源基因高效表达载体.     

XJ-160病毒复制子型表达载体的构建

XJ-160病毒是我国首次分离的辛德毕斯病毒,全基因组测序已经完成.本文利用该病毒全基因序列首先构建了全基因组cDNA克隆质粒,在此基础上,利用基因重组技术将病毒结构基因序列替换为含有多个单酶切位点的序列,得到复制子表达载体质粒pRepxj160.为验证载体的功能,将报告基因绿色荧光蛋白(EGFP)和β-半乳糖苷酶基因(lacZ)分别插入到载体的多克隆位点,得到两个表达质粒;经体外转录获得的转录体RNA转染BHK-21细胞后14h,可检测到报告基因的表达.结果表明我们构建的XJ-160病毒复制子型表达载体具有自主复制功能,可以表达异源基因.本研究为进一步开发具有我国自主知识产权的甲病毒载体奠定了基础.     

XJ—160病毒复制子型表达载体的构建

D-160病毒是我国首次分离的辛德毕斯病毒,全基因组测序已经完成。本文利用该病毒全基因序列首先构建了全基因组cDNA克隆质粒,在此基础上,利用基因重组技术将病毒结构基因序列替换为含有多个单酶切位点的序列,得到复制子表达载体质粒pRepxjl60。为验证载体的功能,将报告基因绿色荧光蛋白(EGFP)和β-半乳糖苷酶基因(lacZ)分别插入到载体的多克隆位点,得到两个表达质粒;经体外转录获得的转录体RNA转染BHK-21细胞后14h,可检测到报告基因的表达。结果表明我们构建的XJ-160病毒复制子型表达载体具有自主复制功能,可以表达异源基因。本研究为进一步开发具有我国自主知识产权的甲病毒载体奠定了基础。     

鹅源新城疫病毒ZJ1株微型基因组的构建及其初步应用

在获得鹅源新城疫病毒ZJ1株全基因组序列的基础上,用增强型绿色荧光蛋白（eGFP）报告基因取代鹅源新城疫病毒ZJ1株整个编码区,只保留与病毒复制、转录和病毒粒子包装相关的调控序列,将其反向克隆入转录载体TVT7R(0.0)中,构建了该毒株的微型基因组。当转染用辅助病毒ZJ1株感染的Hep_2细胞时报告基因得到表达,表明此微型 基因组RNA可被辅助病毒提供的NP、P和L蛋白翻译。同时将该病毒NP、P和L蛋白基因分别克隆入真核表达载体pCI_neo中,构建了表达该病毒NP、P与L蛋白的辅助质粒,用此微型基因组对辅助质粒的表达产物进行了功能鉴定并对该病毒拯救过程中痘苗病毒的最适感染剂量进行了摸索。以上研究为该病毒的成功拯救及开展其它相关研究奠定了基础。     

IL-37基因启动子的克隆及其荧光素酶报告基因载体的构建

[目的]克隆白介素-37(IL-37)基因启动子,构建其荧光素酶报告基因载体,并分析活性。[方法]用PCR方法扩增IL-37基因5'端上游区3个不同长度的启动子片段,分别克隆入荧光素酶报告基因载体p GL3,构建IL-37基因启动子荧光素酶报告基因质粒。将所构建的质粒转染HEK-293细胞,通过双荧光素酶报告基因系统分析启动子的转录活性。[结果]754、1 017、2 043 bp等3个IL-37启动子片段正确亚克隆入荧光素酶报告基因载体,重组质粒转染HEK-293细胞后,双荧光素酶活性分析显示1 017 bp的启动子片段具有较强转录活性,约为对照组(空载体p GL3-basic)的10.9倍。[结论]成功克隆IL-37基因启动子,构建了大小为1 017 bp的IL-37基因启动子荧光素酶报告基因载体,为IL-37表达的调控机制的研究提供有效的工具。     

EphA3基因启动子区域定位表达及活性分析

目的构建含有不同长度EphA3基因启动子片段的报告基因载体,研究其在293T细胞和MEF细胞中的转录活性。方法以Balb／C小鼠基因组DNA为模板,扩增不同长度的EphA3基因启动子片段,并克隆进入荧光素酶报告基因质粒pGL3-Basic真核表达载体内。酶切鉴定及基因测序无误后,将重组质粒和pRL—CMV内对照质粒共转染293T和MEF细胞,分析不同长度的OhA3基因启动子片段的转录活性。结果酶切和测序鉴定表明表达载体构建成功,EphA3基因的核心启动子区域位于-279bp～＋110bp之间,在293T细胞和MEF细胞中其转录活性相似。结论成功构建了荧光素报告基因重组质粒,并确定了BphA3基因的核心启动子区域。     

含VEGF启动子的报告基因的构建及雌激素受体对其活性的影响

目的：构建含血管内皮生长因子（VEGF）基因启动子的荧光素酶报告基因载体,并检测其在雌激素受体作用下的转录活性。方法：以乳腺癌细胞系MCF-7基因组为模板,扩增VEGF启动子片段,克隆到荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中。用脂质体介导的基因瞬时转染法,将重组正确的报告基因载体转染293T细胞,检测重组质粒中荧光素酶报告基因的表达。结果：酶切鉴定和DNA序列分析表明构建了正确的pGL3-basic—VEGF报告基因载体;转录活性实验表明构建的报告基因载体具有启动子活性,雌激素受体α（ERα）能以剂量依赖的方式升高VEGF启动子调控下的报告基因的转录。结论：克隆了VEGF启动子,为ERα共调节子的功能研究奠定了基础。     

团头鲂促性腺激素GtH Iβ亚基基因5′端启动子区克隆及表达载体构建

本研究利用改进的锚定PCR方法克隆了团头鲂(Megalobrama amblycephala)促性腺激素Iβ(GtH Iβ)亚基基因5′端侧翼序列,并在生物信息学方法分析的基础上构建了荧光素酶质粒表达载体。序列分析结果显示:克隆得到的GtHIβ亚基基因5′端侧翼序列长度为479bp,其中包括TATA盒、ARE、PRE、ERE、SF-1、Ptx1等可能对GtH Iβ亚基基因转录调控起重要作用的功能转录因子结合位点。利用PCR方法在基因组中扩增得到了3个缺失片段,并同全长片段一起分别连接至pGL3-Basic报告基因载体,成功构建了团头鲂GtH Iβ亚基基因5′端侧翼序列的表达载体,为进一步研究、分析其转录调控机制提供了基础。       

siRNA抑制HIV-1基因表达的研究

RNA干扰(RNAinterfering,RNAi)现象是动植物体内的一种序列特异性的、转录后基因沉默的过程.在哺乳动物细胞中,19～25个核苷酸长短的双链siRNA(smallinterferingRNA)可有效地抑制基因表达.利用pBS/H1SP载体,它表达的双链RNA的转录产物可以用来抑制特异性HIV-1基因的表达.在siRNA实验中,为了比较由H1启动子转录的siRNA在细胞内的作用,使用以绿色荧光蛋白(EGFP)为报告基因的载体——pEGFP-C1质粒,在荧光显微镜下,很容易地看到EGFP在细胞中表达.将HIV-1siRNA表达载体与表达相应EGFP-HIV融合基因的质粒,共转染人胚肾293细胞,结果表明,和对照质控载体相比,转染了pHIV-siRNA质粒的细胞中EGFP-HIV的表达得到显著抑制.通过该途径,筛选出能抑制HIV-1基因表达的有效siRNA.此外,还在同一载体上表达两种或三种siRNA,分别针对不同的HIV基因,获得了良好的抑制效果.     

团头鲂促性腺激素GtH Iβ亚基基因5''端启动子区克隆及表达载体构建

本研究利用改进的锚定PCR方法克隆了团头鲂（Megalobrama amblycephala）促性腺激素IB（GtHIβ）亚基基因5＇端侧翼序列,并在生物信息学方法分析的基础上构建了荧光素酶质粒表达载体。序列分析结果显示：克隆得到的GtHIβ亚基基因5’端侧翼序列长度为479bp,其中包括TATA盒、ARE、PRE、ERE、SF-1、Ptxl等可能对GtHIp亚基基因转录调控起重要作用的功能转录因子结合位点。利用PCR方法在基因组中扩增得到了3个缺失片段,并同全长片段一起分别连接至pGL3-Basic报告基因载体,成功构建了团头鲂GtHIp亚基基因5’端侧翼序列的表达载体,为进一步研究、分析其转录调控机制提供了基础。     

甜菜黑色焦枯病毒外壳蛋白与病毒致病性的关系

利用RT-PCR方法,构建获得了由T7RNA聚合酶启动子驱动的甜菜黑色焦枯病毒(BBSV)全长cDNA克隆pUBF52.摩擦接种苋色藜(Chenopodiumamaranticolor)后,体外转录产物可导致与野生病毒相同的枯斑症状,蛋白质印迹和RNA印迹检测也都证明了转录产物的侵染活性.构建了BBSVp24基因的原核表达载体pECP1,转化大肠杆菌BL21后的诱导表达产物能够与BBSV的抗血清呈现特异性反应,表明该基因编码产生BBSV的外壳蛋白(CP).以pUBF52为模板,分别构建了BBSVCP基因的移码突变体和不同程度的缺失突变体.侵染性检测表明,CP基因的移码突变对BBSV在苋色藜上所导致的枯斑症状及病毒RNA在寄主体内的积累基本没有影响,但CP基因的大部或完全缺失会使体内病毒RNA的积累水平大大降低,其中CP基因完全缺失的突变体转录物接种苋色藜后仅能够产生很轻的枯斑症状.将绿色荧光蛋白(GFP)基因和葡糖苷酸酶(GUS)基因分别与BBSVCP基因的5′端融合,构建了表达载体pBGFP和pBGUS.摩擦接种苋色藜叶片后可观察到GFP或GUS基因的表达,为探索利用BBSV作为外源蛋白的表达载体奠定了基础.     

小鼠Daintain/AIF-1 基因启动子的克隆及其荧光素酶报告基因 载体的构建

目的:对Daintain/AIF-1(大炎肽/同种异体移植炎症因子-1)基因启动子进行克隆并构建荧光素酶报告基因载体,为进一步研究Daintain/AIF-1的转录调控作用提供了质粒资源。方法:提取单核巨噬细胞系RAW264.7基因组DNA,以其为模板采用PCR方法克隆出Daintain/AIF-1基因5’端UTR区1.6 kb DNA序列,将该序列同源重组到pGL3-Basic载体上,转化感受态DH5α并酶切鉴定和测序。结果:PCR产物片段与预期结果一致,Daintain/AIF-1基因5’端UTR区1.6 kb DNA序列连接到pGL3-Basic载体上,构建成pGL3-Basic-Daintain/AIF-1(pGL3-Basic-DT)载体,酶切结果与理论预测值一致,经测序证实无碱基突变。结论:Daintain/AIF-1基因报告基因载体的构建为进一步研究Daintain/AIF-1转录调控作用提供了载体资源。     

小鼠Daintain/AIF-1基因启动子的克隆及其荧光素酶报告基因载体的构建

目的：对Daintain/AIF-1（大炎肽/同种异体移植炎症因子-1）基因启动子进行克隆并构建荧光素酶报告基因载体,为进一步研究Daintain/AIF-1的转录调控作用提供了质粒资源。方法：提取单核巨噬细胞系RAW264.7基因组DNA,以其为模板采用PCR方法克隆出Daintain/AIF-1基因5＇端UTR区1.6 kb DNA序列,将该序列同源重组到pGL3-Basic载体上,转化感受态DH5α并酶切鉴定和测序。结果：PCR产物片段与预期结果一致,Daintain/AIF-1基因5＇端UTR区1.6 kb DNA序列连接到pGL3-Basic载体上,构建成pGL3-Basic-Daintain/AIF-1（pGL3-Basic-DT）载体,酶切结果与理论预测值一致,经测序证实无碱基突变。结论：Daintain/AIF-1基因报告基因载体的构建为进一步研究Daintain/AIF-1转录调控作用提供了载体资源。     

CMV与T7启动子对仙台病毒微小基因组拯救效率的比较

构建一种以分泌型荧光素酶基因(Gluc)作为报告基因的仙台病毒BB1株微小基因组质粒,比较了CMV启动子与T7启动子对仙台病毒微小基因组的拯救效率。首先设计并合成锤头状核酶序列,仙台病毒trailer、L基因非编码区、N基因非编码区和leader序列以及丁型肝炎病毒核酶序列,插入含有CMV和T7双启动子的质粒pVAX1中,获得仙台微小基因组的通用型载体pVAX-miniSeV。将Gluc基因插入pVAX-miniSeV中,分别获得正向插入的仙台病毒微小基因组载体pVAX-miniSeV-Gluc(+)和反向插入的pVAX-miniSeV-Gluc(-)。用pVAX-miniSeV-Gluc(+)转染BHK21细胞能在上清中检测到高水平的Gluc活性,表明其中的CMV启动子具有正常转录功能。将pVAX-miniSeVGluc(-)和仙台病毒N、P、L蛋白表达质粒共转染BSR T7/5细胞(稳定表达T7RNA聚合酶的BHK-21细胞)检测到Gluc的高效表达,表明pVAX-miniSeV-Gluc(-)能够被有效拯救;但在BHK-21细胞中却未检测到Gluc的有效表达,提示该载体中的CMV启动子对仙台病毒微小基因组的拯救效率可能没有明显作用。为了进一步了解CMV与T7启动子各自对于仙台病毒微小基因组拯救的作用,本研究又构建了单独含有CMV或T7启动子的仙台病毒微小基因组载体pCMV-miniSeV-Gluc(-)和pT7-miniSeV-Gluc(-)。将这两种载体和仙台病毒N、P、L蛋白表达质粒分别共转染BSR T7/5细胞,结果pT7-miniSeV-Gluc(-)共转染组检测到了Gluc的高效表达,而pCMV-miniSeV-Gluc(-)共转染组未检测到,证实了通用型载体pVAX-miniSeV中仅T7启动子对仙台病毒微小基因组的拯救起了关键作用,而CMV启动子作用不明显。本研究成功构建了一种通用型双启动子仙台病毒微小基因组载体pVAX-miniSeV,并证明了T7启动子系统对仙台病毒微小基因组拯救的关键作用。本研究为下一步构建仙台病毒全基因感染性克隆打下了基础。     

含G0S2基因启动子的荧光素酶报告基因载体的构建

目的:克隆人G0S2基因启动子并构建荧光素酶报告基因载体,为进一步研究G0S2基因转录调控提供质粒。方法:利用PCR技术从人胚肾293A细胞基因组DNA中克隆获得G0S2基因启动子的DNA片段,将其克隆至pGL3-basic表达载体中,并转化人大肠杆菌DH5α,经限制性内切酶酶切、PCR及测序鉴定得到确认;将重组载体质粒与半乳糖苷酶表达质粒psV-β-Galactosidase共转染至大鼠血管平滑肌细胞(VSMC),检测细胞中荧光素酶的活性。结果:pGL3-G0S2-Promoter重组质粒插入片段和相邻序列正确,克隆的G0S2基因片段有启动子活性(P0.05)。结论:成功构建了pGL3-G0S2-Promoter报告基因质粒,为进一步研究G0S2基因的表达奠定了基础。     

苏云金芽胞杆菌LM1212菌株cry基因启动子的活性分析

【背景】前期发现一株具有独特分化表型的苏云金芽胞杆菌(Bacillusthuringiensis,Bt)LM1212,该菌株共有14种杀虫基因,组成了10个转录单元。利用源自菌株LM1212的晶体产生细胞调控因子(crystal producing cell regulator, CpcR)以及其可以激活的cry35-like基因启动子,已在典型Bt菌株HD73中成功构建了非芽胞杀虫蛋白表达体系。【目的】比较菌株LM1212的不同杀虫基因启动子的转录活性,明确可被转录因子CpcR激活的且转录活性较高的启动子,以此为基础优化非芽胞杀虫蛋白表达体系。【方法】将10个启动子区域分别与lacZ报告基因融合构建在pHT304-18Z载体上,得到了10个重组质粒;然后将cpcR基因及其启动子(PcpcR-cpcR)分别反向构建在选取的启动子区域与lacZ报告基因的上游,得到可以表达CpcR且与上述构建相对应的10个重组质粒,将这些重组质粒分别转入不含CpcR的菌株HD73,即获得20个可用于测定β-半乳糖苷酶活性的重组菌株。通过光学显微镜观察和SDS-PAGE检测明确杀虫蛋白表达的情况。【结果】在...     

杆状病毒囊膜糖蛋白gp64基因启动子活性分析

GP64是杆状病毒在其发育循环第一时相所产生的芽生型病毒粒子（budded voirus,BV)的特异性囊膜糖蛋白。它在病毒入侵细胞过程中具有重要作用。为了探明杆状病毒gp64基因的表达调控。从所克隆的BmNPV和AcMNPVgp64基因ATG上游437-439bp启动子的序列分析发现。该启动子同时具有早期和晚期转录模体,将所构建的该启动子控制下荧光素酶报告基因（Luc)的非融合表达质粒分别转染Bm-N和Sf-21细胞进行瞬间表达分析,BmNPVgp64启动子能被允许宿主Bm-N细胞RNA聚合酶Ⅱ所识别,AcMNPVgp64启动子既能被允许宿主Sf-21又能被非允许宿主Bm-N细胞RNA聚合酶Ⅱ所识别,同时,这两个启动子的转录活性在各自的允许宿主细胞中被相应的病毒因子所反式激活2.4-4倍。将家吞核多角体病毒同源重复序列3（BmNPV homologous region-3,hr3)克隆到该启动子控制下的Luc报告基因下游,用所构建的质粒分别转染细胞,瞬间表达分析结果表达,BmNPVhr3能分别增强该启动子在Bm-N和Sf-21细胞中的转录活性13-22倍和7000-14000倍以上,同时,相应的病毒因子能反式激活插入了hr3的gp64启动子在各自允许宿主细胞中转录活性73-78倍,这暗示着BmNPVhr3除了具有病毒DNA复制原点和增强子的功能外,它在病毒的反式激活过程中起着重要的作用。     

用表达T7RNA聚合酶细胞系拯救麻疹病毒微复制子

构建稳定表达T7RNA聚合酶的细胞系,用于提高拯救麻疹病毒微复制子效率.PCR扩增T7RNA聚合酶基因,克隆到真核表达载体,转染Vero细胞,用G418筛选到稳定表达的细胞株Vero/pcDNA3-T7.用Westernblotting证明了T7RNA聚合酶在细胞中的表达.将T7启动子控制绿色荧光蛋白表达的质粒转染该细胞后,绿色荧光蛋白在细胞株中得到表达.反向插入报告基因的微复制子转染感染麻疹病毒的Vero/pcDNA3-T7细胞后,细胞中能够检测到报告基因的表达.用细胞系取代痘苗病毒系统,可以提高拯救效率.     

利用脊髓灰质炎病毒5‘NCR和RNA聚合酶基因可提高外源基因表达

将含脊髓灰质炎病毒（ＰＶ）ＲＮＡ聚合酶的不同长度基因片段克隆到载体ｐＳＧ５质粒上,分别构建了４个表达ＲＮＡ聚合酶的质粒。体外转录实验证明,ｐＳＧ５－ＰＯＬ１．９９和ｐＳＧ５－ＰＯＬ２．０３质粒转染细胞的提取物促进了特异的ＲＮＡ转录,表明两质闰可表达ＲＮＡ聚合酶。将ＰＶ的５’ＮＣＲ序列插在载体ｐＧＲＥＥＮ ＬＡＮＴＥＲＮ－１的ＣＭＶ启动子下游,构建了ｐＧＲＥＥＮ ＬＡＮＴＥＲＮ－１－５’ＮＣＲ质粒;     

IRE1α上调人骨肿瘤细胞XBP1启动子转录活性的研究

目的研究内质网跨膜蛋白肌醇酶1α（inositol-requiring enzyme 1α,IRE1α）对其下游转录因子XBP1启动子转录活性的影响。方法在成功构建人IREla基因全长重组质粒的基础上,设计合成并构建靶向IRE1α基因的siRNA干扰载体（pS1;pS2）;采用巢式PCR扩增XBP1启动子,插入到pGL3．Basic载体,构建携带XBP1启动子的报告基因重组质粒pGL3-XBP1。分别将siIRE1α干扰质粒与pGL3-XBPl报告基因重组质粒共转染人SW1353细胞和Saos-2细胞中,48h后采用双荧光报告系统检测IRE1α对XBP1启动子转录活性的调控作用。结果酶切及测序结果证实siRNA1干扰质粒和XBPl启动子真核表达载体均构建成功,双荧光报告系统检测显示SW1353细胞和Saos-2细胞中,直接载体pcDNA3．15（-）IRE1α与pGL3-XBP1共转实验组的荧光素酶活性明显高于其他实验组（P〈0．5）,并随着IRE1α转染剂量的增加逐渐达到饱和;而silRE1α与pGL3-XBP1共转实验组的荧光素酶活性明显降低。免疫印迹结果显示,过表达IRE1α明显上调剪接型XBPlS蛋白的表达。结论人恶性骨肿瘤细胞中,过表达IRE1α明显上调XBP1启动子的转录与表达,并能有效促进XBPIU剪切生成XBPIU;通过siRNA方法抑制IRE1α后,XBP1启动子的转录与表达受到抑制。本实验为进一步研究骨肿瘤细胞中IRE1α调控XBP1启动子转录与剪接的分子机制奠定基础,为临床骨肿瘤的诊断与治疗提供一定的实验依据。