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1.
通过体细胞核移植技术制作了人胰岛素原转基因牛。在CMV启动子指导下以内部核糖体进入位点序列(IRES)连接的新霉素抗性基因和绿色荧光蛋白基因组成了双重标记基因的筛选系统,用于转基因细胞的富集以及细胞和植入前胚胎的筛选。转基因通过电穿孔的方法(900 V/cm, 5 ms)转入体外培养的牛胎儿成纤维细胞,基因转染细胞在添加G418(800 μg/mL) 的培养基中培养10天以富集转基因细胞。选择表达绿色荧光蛋白的转基因细胞作为核供体进行体细胞核移植,重构胚经体外培养至囊胚阶段,选择表达绿色荧光蛋白的囊胚进行胚胎移植。为比较基因转染以及供体细胞所处周期对转基因细胞核移植胚胎发育的影响,用作核移植供体的转基因细胞或非转基因细胞先饥饿培养2—4天(0.5% FBS),然后恢复培养(10% FBS)10?h使细胞同步化于G1期,以正常培养的细胞作为对照进行核移植。 结果表明,转基因细胞作为核供体得到的核移植胚胎的体外囊胚发育率低于以非转基因细胞为核供体的对照组(23.2% VS 35.2%, P<0.05);转基因细胞周期同步化处理与否对其克隆胚囊胚发育率无显著影响(23.2% VS 18.9%, P>0.05)。胚胎移植后2个月直肠检查发现7头受体牛(每头移植2—4枚胚胎)中有一头妊娠,并最终发育足月产下一头小牛。聚合酶链反应(PCR)检测和DNA测序分析表明其为转人胰岛素原基因的转基因克隆牛。  相似文献   

2.
供体细胞类型对体细胞克隆牛生产效率的影响   总被引:11,自引:0,他引:11  
建立了中国红系冀南黄牛颗粒细胞系(YGR)、Holstein奶牛颗粒细胞系(HGR)、Holstein奶牛不同个体的成年成纤维细胞系(AFB)以及Holstein奶牛同一个体的胎儿成纤维细胞系(FFB)和胎儿输卵管上皮细胞系(FOV). 以上述不同类型的体细胞为核供体, 进行了体细胞核移植, 共成功培育出12头体细胞克隆牛. 比较了不同类型供体细胞的重构胚的发育潜能, 结果表明: (ⅰ) YGR和HGR的重构胚的囊胚发育率(33.2% vs 35.1%)无显著差异(P > 0.05), 妊娠率分别为33.3%和30.2%, 产犊率分别为16.7%和11.6%; (ⅱ) Holstein奶牛不同个体AFB的重构胚的囊胚发育率(27.9% vs 39.4%)差异显著(P < 0.05), 妊娠率分别为36.2%和36.4%, 产犊率分别为14.9%和27.3%; (ⅲ) Holstein奶牛同一个体的FFB和FOV的重构胚的囊胚发育率(37.9% vs 41.5%)差异显著(P < 0.05), 妊娠率分别为45.7%和24.1%, 产犊率分别为22.9%和10.3%. 综合比较Holstein奶牛的4种体细胞(HGR, AFB, FFB和FOV)的重构胚的发育情况, 结果显示: 在体外发育阶段, FOV的重组胚的囊胚发育率(41.5%)最高, FFB (37.9%)和HGR (35.1%)次之, AFB(29.4%)最低, 三者之间差异显著(P < 0.05). 在体内发育阶段, 4种供体细胞克隆胚胎的妊娠率分别为30.2%, 36.2%, 45.7%和24.1%, 产犊率分别为11.6%, 17.2%, 22.9%和10.3%.  相似文献   

3.
通过体细胞核移植技术制作了人胰岛素原转基因牛。在CMV启动子指导下以内部核糖体进入位点序列(IRES)连接的新霉素抗性基因和绿色荧光蛋白基因组成了双重标记基因的筛选系统,用于转基因细胞的富集以及细胞和植入前胚胎的筛选。转基因通过电穿孔的方法(900V/cm,5ms)转入体外培养的牛胎儿成纤维细胞,基因转染细胞在添加G418 (800μg/mL)的培养基中培养10天以富集转基因细胞。选择表达绿色荧光蛋白的转基因细胞作为核供体进行体细胞核移植,重构胚经体外培养至囊胚阶段,选择表达绿色荧光蛋白的囊胚进行胚胎移植。为比较基因转染以及供体细胞所处周期对转基因细胞核移植胚胎发育的影响,用作核移植供体的转基因细胞或非转基因细胞先饥饿培养2—4天(0.5 ?S) ,然后恢复培养(10?S) 10 h使细胞同步化于G1期,以正常培养的细胞作为对照进行核移植。结果表明,转基因细胞作为核供体得到的核移植胚胎的体外囊胚发育率低于以非转基因细胞为核供体的对照组(23.2% VS 35.2 %,P<0.05) ;转基因细胞周期同步化处理与否对其克隆胚囊胚发育率无显著影响(23.2% VS 18.9 %,P>0.05)。胚胎移植后2个月直肠检查发现7头受体牛(每头移植2—4枚胚胎)中有一头妊娠,并最终发育足月产下一头小牛。聚合酶链反应(PCR)检测和DNA测序分析表明其为转人胰岛素原基因的转基因克隆牛。  相似文献   

4.
绵羊胎儿成纤维细胞不同处理对核移植重构胚发育的影响   总被引:1,自引:0,他引:1  
研究供体细胞代数、大小、周期以及基因转染处理对重构胚发育的影响. 结果如下: (i)体外培养5~7代细胞做供体核, 重构胚的桑椹/囊胚率显著高于16~18代细胞的桑椹/囊胚率(17.3% vs. 4.9%, P < 0.05); (ii) 15~25 μm细胞做供体核, 重构胚的桑椹/囊胚率为20.0%, 高于8~15 mm细胞、25~33 μm细胞桑椹/囊胚率(8.0%, 9.7%), 但效果不显著(P > 0.05); (iii) 血清饥饿与非血清饥饿的细胞做供体核, 重构胚的桑椹/囊胚发育率没有显著性差异(11.8% vs. 18.6%, P > 0.05), 但非血清饥饿的效果要好于血清饥饿; (iv) 用0.05 μmol/L秋水仙素处理供体细胞效果最好, 重构胚的桑椹/囊胚率可达27.5%, 而未处理或用0.1 μmol/L秋水仙素处理供体细胞, 重构胚的桑椹/囊胚率分别为17.1%和12.1%, 但三者之间差异不显著(P > 0.05); (v) 以转染绿色荧光蛋白基因(GFP)细胞做供体核, 重构胚的桑椹/囊胚率显著低于非转基因细胞做供体核的桑椹/囊胚率(3.1% vs. 20.4%, P < 0.05). 上述结果表明, 传代少、中等大小的细胞更适合做供体核; 血清饥饿没有必要; 用0.05 μmol/L秋水仙素处理供体细胞有利于重构胚的发育; 转基因供体细胞对重构胚发育有影响.  相似文献   

5.
不同供体细胞及其处理对猪核移植重构胚体外发育的影响   总被引:9,自引:0,他引:9  
张德福  刘东  汤琳琳  王英  陈茵  王凯  王根林  LIN Cailu 《遗传》2007,29(2):211-217
系统探讨了体细胞的组织来源及培养代数对猪核移植重构胚发育的影响。体外成熟培养40~44 h的猪卵母细胞去核后, 将经血清饥饿(0.5%FBS)培养2~9天、0.1 mg/L Aphidicolin(APD)培养+0.5% FBS培养2~9天或一般培养法(10% FBS)培养的卵丘细胞、颗粒细胞、输卵管上皮细胞和耳皮成纤维细胞, 直接注射到去核的卵母细胞质中, 或注射到卵周隙中, 再经电融合(100 V/mm, 30 [mu]s, 电脉冲1次)构建重构胚。重构胚以钙离子载体A23817 或电脉冲结合6-DMAP 激活处理, 体外培养6天。耳皮成纤维细胞和颗粒细胞经0.1 mg/L APD + 0.5% FBS培养处理后的重组胚卵裂率, 均高于血清饥饿和一般培养处理的同种供体细胞(P<0.01)。卵丘细胞、颗粒细胞经0.1 mg/L APD + 0.5% FBS处理后进行核移植的分裂率和发育率均高于输卵管上皮细胞和耳皮成纤维细胞(P<0.05)。以猪颗粒细胞为核供体时, 电融合法的重构胚分裂率显著高于胞质内注入法(P<0.05), 但囊胚发育率无显著差异(P>0.05)。培养3代和6代的猪颗粒细胞以及培养6代和10代的耳皮成纤维细胞, 其具有正常二倍染色体的细胞比例均无显著差异(P>0.05); 以这2种细胞不同培养代数做供体进行核移植时, 各代之间核移胚的体外分裂率、囊胚发育率无显著差异(P>0.05)。这些结果表明: (1) 猪耳皮成纤维细胞和颗粒细胞经培养传代所建立起来的细胞系相对比较稳定; (2) 0.1 mg/L APD预培养处理供体细胞能提高猪体细胞核移植的效果, 血清饥饿培养则无明显效果; (3) 猪颗粒细胞和耳皮成纤维细胞等均可做供核细胞, 核移植后都能得到体细胞克隆的囊胚, 但前者的效果略优于后者, 且其核移植效果不受供核细胞培养代数的影响; (4) 电融合核移植胚胎的发育率高于胞质内直接注入法, 但两者的总体效率相近。  相似文献   

6.
共培养体系在牛核移植胚体外发育培养中的应用   总被引:3,自引:0,他引:3  
采用电融合法构建牛体细胞核移植重构胚,分析共培养细胞类型、传代次数、细胞冻-融以及蛋白质添加物(BFF和FBS)对牛体细胞核移植胚体外发育的影响,探讨胚胎体外共培养的条件,以建立优化的共培养体系。结果表明与非共培养组相比,共培养组重构胚的囊胚发育率以及胚胎细胞数显著增加(P<0.05),而输卵管上皮细胞共培养组同颗粒细胞共培养组相比胚胎细胞数显著增加(P<0.05),更适合做共培养细胞;随着共培养细胞传代次数的增加重构胚囊胚发育率及胚胎细胞数显著下降(P<0.05),共培养细胞在冷冻处理后重构胚的囊胚率和胚胎细胞数都显著下降(P<0.05);BFF较FBS更能促进牛核移植胚的囊胚发育率(P<0.05)。表明应用新鲜原代输卵管上皮细胞进行牛核移植胚胎的共培养,并在SOFaa添加10?F能够有效促进核移植胚胎的体外发育。  相似文献   

7.
以转染了质粒pEGFP-N1的猪胎儿成纤维细胞与体外成熟(in vitro maturation, IVM)的猪卵母细胞构建克隆胚, 比较了细胞转染后G418筛选与否, 卵母细胞IVM持续时间及IVM时氧分压高低对克隆胚早期发育的影响. 结果如下: (ⅰ) G418连续筛选10天所得转GFP细胞的克隆胚卵裂率显著低于非筛选组(47.5% vs. 71.6%, P<0.05), 而囊胚率差异不显著(10% vs. 10.4%, P>0.05); (ⅱ) 相比于36 h IVM, 延长IVM时间至 42 h卵母细胞的核成熟明显改善(83.6% vs. 96.7%, P<0.05); 另外, 虽然IVM 42 h也使得克隆胚卵裂率(59.3% vs. 73.6%)及囊胚率(9. 3% vs. 13.2%)都略有提高, 但效果不显著 (P>0.05); (ⅲ) 7%氧IVM 42 h 的卵母细胞与20%氧处理组相比, 克隆胚的卵裂率(70.6% vs. 67.1%)以及囊胚率(11.8% vs. 12.3%)差异都不明显(P>0.05). 上述结果显示: (ⅰ) G418筛选对转绿色荧光蛋白基因(GFP)克隆胚卵裂不利; (ⅱ) IVM 36和42 h的卵母细胞对克隆胚早期发育影响不明显, 但IVM 42 h有利于核成熟, 因此构建克隆胚时仍以IVM 42 h的卵母细胞为宜; (ⅲ) 低氧对猪转GFP克隆胚早期发育无明显促进作用.  相似文献   

8.
本实验用小鼠血液淋巴细胞为核供体进行了核移植研究。用淋巴细胞分离液(比重1.088)分离出小鼠血液中的淋巴细胞,直接用作核移植供体细胞,采用胞质内注射法成功构建的重构胚经常规培养2h后,SrCl_2激活处理6h,然后添加mM16培养液和小鼠输卵管上皮细胞饲养层共培养。把发育至早期囊胚阶段的重构胚转移至小鼠胎儿成纤维细胞饲养层上,添加ES细胞培养液继续培养。对孵化出的内细胞团进行消化,然后接种培养。结果显示,小鼠血液淋巴细胞可以支持体细胞核移植重构胚的发育,核移植重构胚2-细胞率41.03%(128/312),桑葚胚和囊胚发育率分别为9.29%(29/312),1.92%(6/312)。重构囊胚在小鼠胎儿成纤维细胞饲养层上分离出2个内细胞团,分离率为0.64%(2/312)。实验证实利用小鼠血液淋巴细胞进行体细胞核移植是可行的,可用于深入研究。  相似文献   

9.
卵丘细胞核移植技术生产克隆牛犊   总被引:17,自引:0,他引:17  
分别以短期培养的5头牛卵丘细胞(1~5 BCC)为细胞核供体, 共用1188枚体外成熟的去核卵母细胞构建了931枚重构胚(78.4%).体外培养后,763枚(82%)发育至2-细胞期,627枚(67.3%)发育至8-细胞期,最后获得囊胚275枚(29.5%).囊胚的平均细胞数为124±24.5 (n = 20).分析不同个体来源的卵丘细胞,同一个体卵丘细胞饥饿与否以及饥饿时间的长短、融合后核/质相容时间(融合到激活的时间长短)等因素对核移植效率的影响发现,5个个体的体细胞核移植囊胚率(14.1%,45.2%,27.3%,34.3% vs 1.5%)有显著差异(P<0.05).同一供体细胞饥饿与否(47.1% vs 44.4%)、饥饿11~12 d (52.5%)和18~19 d (41.6%)均不影响核移植囊胚率(P≥0.05).核/质相容2~3 h的囊胚率(20.3%)显著低于3~6 h组(31.0%,P<0.05). 3~6 h范围内,囊胚率无差异(P≥0.05).其中63枚冷冻的核移植囊胚解冻后移植给31头受体牛,妊娠4例,最后顺利获得2头克隆牛犊.结果表明,牛卵丘细胞饥饿不是核移植成功的关键因素,核质相容程度和供体细胞的个体差异对核移植效率有一定影响.卵丘细胞能够获得全程发育的克隆牛犊.  相似文献   

10.
本研究系统探讨了体细胞的组织来源及培养代数对猪核移植重构胚发育的影响。体外成熟培养40-44h的猪卵母细胞去核后,将经血清饥饿(0.5?s)培养2-9d、0.1mg/L Aphidicolin (APD)培养 0.5?S培养2-9d或一般培养法(10?S)培养的卵丘细胞、颗粒细胞、输卵管上皮细胞和耳皮成纤维细胞,直接注射到去核的卵母细胞质中,或注射到卵周隙中。再经电融合(100V/mm,30μs,电脉冲1次)构建重构胚。重构胚以钙离子载体A23817或电脉冲结合6- DMAP激活处理,体外培养6天。耳皮成纤维细胞和颗粒细胞经0.1mg/L APD 0.5?S培养处理后的重组胚卵裂率,均高于血清饥饿和一般培养处理的同种供体细胞(P<0.01)。卵丘细胞、颗粒细胞经0.1mg/L APD 0.5?S处理后进行核移植的分裂率和发育率均高于输卵管上皮细胞和耳皮成纤维细胞(P<0.05)。以猪颗粒细胞为核供体时,电融合法的重构胚分裂率显著高于胞质内注入法(P<0.05),但囊胚发育率无显著差异(P>0.05)。培养3代和6代的猪颗粒细胞以及培养6代和10代的耳皮成纤维细胞,其具有正常二倍染色体的细胞比例均无显著差异(P>0.05);以这2种细胞不同培养代数做供体进行核移植时,各代之间核移胚的体外分裂率、囊胚发育率无显著差异(P>0.05)。这些结果表明:(1)猪耳皮成纤维细胞和颗粒细胞经培养传代所建立起来的细胞系相对比较稳定;(2)0.1mg/L APD预培养处理供体细胞能提高猪体细胞核移植的效果,血清饥饿培养则无明显效果;(3)猪颗粒细胞和耳皮成纤维细胞等均可做供核细胞.核移植后都能得到体细胞克隆的囊胚,但前者的效果略优于后者,且其核移植效果不受供核细胞培养代数的影响;(4)电融合核移植胚胎的发育率高于胞质内直接注入法,但两者的总体效率相近。  相似文献   

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