利用体细胞核移植技术生产表达绿色荧光蛋白的猪转基因克隆胚胎

以转染了质粒pEGFP-N1的猪胎儿成纤维细胞与体外成熟(in vitro maturation, IVM)的猪卵母细胞构建克隆胚, 比较了细胞转染后G418筛选与否, 卵母细胞IVM持续时间及IVM时氧分压高低对克隆胚早期发育的影响. 结果如下: (ⅰ) G418连续筛选10天所得转GFP细胞的克隆胚卵裂率显著低于非筛选组(47.5% vs. 71.6%, P<0.05), 而囊胚率差异不显著(10% vs. 10.4%, P>0.05); (ⅱ) 相比于36 h IVM, 延长IVM时间至 42 h卵母细胞的核成熟明显改善(83.6% vs. 96.7%, P<0.05); 另外, 虽然IVM 42 h也使得克隆胚卵裂率(59.3% vs. 73.6%)及囊胚率(9. 3% vs. 13.2%)都略有提高, 但效果不显著 (P>0.05); (ⅲ) 7%氧IVM 42 h 的卵母细胞与20%氧处理组相比, 克隆胚的卵裂率(70.6% vs. 67.1%)以及囊胚率(11.8% vs. 12.3%)差异都不明显(P>0.05). 上述结果显示: (ⅰ) G418筛选对转绿色荧光蛋白基因(GFP)克隆胚卵裂不利; (ⅱ) IVM 36和42 h的卵母细胞对克隆胚早期发育影响不明显, 但IVM 42 h有利于核成熟, 因此构建克隆胚时仍以IVM 42 h的卵母细胞为宜; (ⅲ) 低氧对猪转GFP克隆胚早期发育无明显促进作用.     

Klf4的功能研究进展

Klf4作为真核生物转录因子,参与调控细胞增殖、分化、胚胎发育等重要生命过程,是体细胞重编程为诱导多能干细胞（iPS细胞）的重要诱导因子之一。本文综述了Klf4在细胞增殖、分化、肿瘤发生、皮肤屏障、热休克及iPS细胞诱导等方面的研究进展,为深入研究Klf4在重编程中的作用机制和功能提供参考。     

体细胞重编程为多能干细胞的研究进展

体细胞通过重编程转变成其他类型的细胞,在再生医学方面具有重要的应用前景。细胞重编程的方法主要有体细胞核移植、细胞融合、细胞提取物诱导、限定因子诱导等,这些方法可以不同程度地改变细胞命运。最近,限定因子诱导的多能干细胞（induced pluripotent stem cell。iPS）为重编程提供了一种崭新的方法,不仅可以避免伦理争议,还提供了一种更为便利的技术,为再生医学开辟了新的天地;同时,iPS技术为研究基因表达调控、蛋白质互作、机体生长发育等提供了一个非常重要的研究手段。本文主要论述了体细胞重编程的方法及iPS细胞的进展、面临的问题和应用前景。     

限定因子诱导胎猪成纤维细胞重编程为多能性细胞

尝试运用限定因子融合蛋白建立猪的诱导多能性干细胞．试验采用Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc四种限定因子经慢病毒表达载体系统介导感染猪胎儿成纤维细胞,对表达外源限定因子的猪胎儿成纤维细胞进行培养传代,逐步分离培养出集落边缘界限清晰的细胞克隆,细胞集落生长状态稳定、核型正常、碱性磷酸酶检测为阳性,免疫细胞化学检测显示,Oct4、Nanog、SSEA-1蛋白表达为阳性,体内能够分化形成含有三个胚层的畸胎瘤．结果证实分离培养的细胞克隆为猪诱导多能性干细胞,为进一步完善诱导方案和深入研究应用猪诱导多能性干细胞奠定了基础．     

自制载体冷冻小鼠原核期胚胎效果分析

目的探讨自制冷冻载体冷冻保存昆明小鼠体内原核期胚胎的可行性。方法首先,比较了两种流行的商业化载体:开放式拉长麦管(open pulled straw,OPS)和冷冻帽(cryotop)开展小鼠原核胚玻璃化冷冻保存效果。其次,以cryotop为对照,利用自制简易载体(cryotip)开展小鼠原核期胚胎的玻璃化冷冻保存。之后,利用ANOVA对各组胚胎在复苏后的体外培养卵裂率、囊胚率进行统计分析。结果 OPS和cryotop两组之间,胚胎在玻璃化冷冻/复苏后发育的2-细胞率、4-细胞率和囊胚率差异均无显著性(P0.05),但cryotop冷冻效果更接近对照组;cryotip玻璃化冷冻载体与cryotop相比,胚胎复苏后各组差异均无显著性(P0.05),数值上除了2-细胞发育率外,cryotip其他几项结果都稍微高于cryotop组。结论 OPS,cryotop,cryotip冷冻保存昆明小鼠体内原核期胚胎均是可行的;cryotop在冷冻效果上要优于OPS,笔者自制的cryotip因其成本低,制作简单,操作安全可靠,在实验中替代昂贵的商业化载体OPS和cryotop是可行的。     

供体细胞与哺乳动物体细胞核移植

哺乳动物体细胞核移植(克隆)技术在转基因动物生产、珍稀动物资源复原与保护、生物学基础研究等方面业已显示出重要的应用价值,而目前该技术还与诱导多能干细胞技术一同被认为是创制患者特异性多能干细胞,为再生医学临床"细胞治疗"提供素材的最佳手段。但是,体细胞克隆的效率仍不理想,关键机制还不清楚,严重制约了该技术的推广。因此,如何提高克隆效率已成为人们普遍关心的首要问题。在体细胞克隆技术所涉及的各环节中,供体细胞是影响克隆效率的最关键因素之一。该文从供体细胞的生物学因素和技术因素两方面进行了回顾,旨在为进一步探寻建立物种或供体细胞个性化准备方案,为提高动物克隆效率提供参考。     

哺乳动物腔前卵泡体外培养研究进展

哺乳动物卵巢中含有数以万计的腔前卵泡（preantral follicles）,仅不足1％能够发育至预排卵卵泡。建立哺乳动物腔前卵泡有效分离及体外培养技术体系,能够大量利用腔前卵泡,增加体外成熟卵母细胞数量,对哺乳动物胚胎体外生产、克隆及转基因动物生产等胚胎工程技术的研究与应用,以及在体外条件下揭示哺乳动物卵泡发育机理,都具有重要的理论意义和实用价值。鉴于卵巢质地与卵泡划、发生周期的固有差异,不同物种腔前卵泡分离方法与培养方式亦有所不同。同时,培养基类型、卵泡问相互作用、促性腺激素与细胞因子等因素均会对卵泡的体外发育产生影响。系统阐述了腔前卵泡的分离方法、培养方式以及相关因素对卵泡发育的影响,期望为从事相关研究的学者提供参考。     

重组腺相关病毒小鼠骨骼肌中近红外荧光蛋白表达及活体成像

近红外荧光蛋白因激发光和发射光波长位于近红外区,在动物组织中光吸收和光散射最低,更适宜于动物活体组织的深层成像.构建了一种携带近红外荧光蛋白(near-infrared fluorescent protein,iRFP)713基因的重组表达质粒pAAV-iRFP713,将重组表达质粒与辅助质粒共转染AAV-293细胞,包装重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)rAAV-iRFP713.重组腺相关病毒表达载体感染体外培养的癌细胞,48h后,荧光显微镜检测显示近红外荧光蛋白在癌细胞中高效表达,荧光明亮.重组腺相关病毒表达载体注射小鼠骨骼肌,48h后,用近红外荧光活体成像系统检测证明近红外荧光蛋白在小鼠骨骼肌中表达较强, 活体组织成像清晰.实验结果表明近红外荧光蛋白在体内体外均能很好地表达并荧光成像,为动物活体组织标记和成像的研究提供新方法.     

猪多能干细胞的研究进展

多能干细胞,如胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)、诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)和成体干细胞(adult stem cells,ASCs),是一类具有巨大潜能的独特细胞。猪作为试验材料,在遗传、代谢、生理生化及基因序列等方面较小鼠更接近于人类,正逐渐成为人类异种移植和再生医学研究的理想生物学模型。然而,目前对猪多能干细胞种类、来源、特征及机制的有限认识直接阻碍了其相关应用。该文将分别对猪ASCs的研究现状、猪类ESCs的分离培养、猪iPSCs的研究进展、多能干细胞间的联系和展望进行论述,以期为从事该领域研究的科研人员提供参考。     

慢病毒直接诱导形成猪iPS细胞无需限定因子

为了证实慢病毒对细胞具有遗传修饰和重编程作用,在本实验中使用慢病毒感染猪胎儿成纤维细胞.结果显示:慢病毒介导的EGFP在猪胎儿成纤维细胞中稳定和高效表达,使用添加LIF和bFGF的细胞培养液,部分猪的胎儿成纤维细胞逐渐改变原有的纤维状形态,形成圆形的细胞,细胞逐步增殖形成细胞集落,细胞集落边界清晰,在饲养层上细胞集落生长迅速,具有稳定的生长性能和正常核型,细胞碱性磷酸酶染色为阳性,表达干细胞特有的标记Oct4、Nanog和SSEA1,在体外能够形成拟胚体,在体内分化形成包含三个生殖层的畸胎瘤.作为核移植的供体细胞,克隆胚的卵裂率为53.33%、桑椹胚率为9.03%、囊胚率为2.07%、孵化囊胚的总细胞数为26.5,在桑椹胚率和囊胚率方面显著低于猪普通胎儿成纤维细胞核移植克隆胚的发育能力(P<0.05).结果证实慢病毒能够直接使猪的胎儿成纤维细胞转变成iPS细胞,因此慢病毒将成为一种理想的材料和工具用于细胞的遗传修饰和细胞重构等方面的研究.