β地中海贫血基因治疗的研究进展

基因治疗是根治β地中海贫血研究的重点方向。位点控制（LCR）的发现以及新型基因转移系统不断开发研制,结导入正常β珠蛋白基因以实现基因治疗的设想带来了希望但同时也产生了新课题;与此同时,分别从DNA和RNA水平对受损的β珠蛋白基因进行修正治疗的研究也在开展当中。随着珠蛋白基因表达调控机制研究不断深入,同时开发出安全高效的新型病毒载体,有可能最终实现β地中海贫血基因治疗。     

定量RT-PCR中人干细胞因子的RNA-CRS的构建

一种适用于定量RT-PCR、用ExonucleaseⅢ部分酶切剔除技术,构建人干细胞因子(hSCF)基因的RNA竞争性参考标准(RNA-CRS)的新方法：用RT-PCR技术,从HepG2细胞中扩增出全长人hSCF cDNA,并克隆入质粒pGEM-T获重组的pGEMSCF载体,经ExonucleaseⅢ和S1核酸酶适当处理,以导致hSCF cDNA中一小片段缺失,由此获得重组pGEMSCF模拟体(mimic),经体外转录得到hSCF RNA-CRS.测序表明：该RNA-CRS与hSCF mRNA比较,缺失了从第499位至608位共110个核苷酸,但二者RT-PCR反应可用同一对扩增引物,反应动力学极为相似.这种hSCF RNA-CRS可作为一种较理想的竞争性参考标准,适用于定量RT-PCR中,以对重组hSCF在真核细胞中的表达水平进行准确的定量分析.此方法亦可推广应用于其他真核基因的表达水平及/或调控的检测和研究.     

人干细胞因子基因5′旁侧序列的克隆和功能研究

人干细胞因子 ( human stem cell factor,h SCF)在多种哺乳动物干细胞的增殖、分化和移居中发挥重要作用 .利用改进的 PCR体系 ,从人类基因组 DNA中扩增出自 h SCF基因编码起始位点( + 1 81 )至 5′旁侧 - 1 1 90位点共 1 372 bp的片段 ,将其克隆至 p GEM- T载体中 ,经序列分析证明无误 .为探寻此片段中对转录调控起作用的具体区域 ,用基因缺失技术从 - 1 62 ( Bst X )位点向上游分别延伸至 - 2 73( Pst )、- 339( Sma )、- 381 ( Sac )、- 44 0 ( Eco R )、- 570 ( H inc )、-853( Bgl )及 - 1 1 90 ( Xho )等位点 ,共获 7个不同长度的 h SCF基因 5′旁侧序列片段 ,随后将这7个片段分别克隆入荧光素酶 ( luc)报告基因载体 p GL2 - Promoter.经阳离子脂质体包埋技术介导转染 He La细胞 ,培养 48h后检测 Luc活性 .结果表明 :h SCF基因 5′旁侧 - 1 1 90～ - 853区域对luc表达有明显的增强作用 ,而 - 339～ - 2 73区域则显示有抑制作用 .分别以包含这两个区域的片段为探针进行竞争性凝胶阻滞实验 ,结果均出现一个或多个特异性滞留区带 ,说明这两个区域存在转录因子的结合位点 .实验结果表明 ,h SCF基因 5′旁侧 - 1 1 90～ - 853区域富含 AT,是一典型基质结合区 ,而 - 339～ - 2 73区域为一新的沉默子 ,在     

非连续聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定HbE及HbA2

应用非连续聚丙烯酰胺凝胶电泳成功地分离了HbE变异链(β^E)与α链、δ与 ^Gγ链,测定了20例正常人溶血液δ链的含量(1.12±0.44％)。并对1例HbE/β⁰-地贫家系4位成员的HbE和HbA₂含量进行了同时分别测定,其结果表明该方法稳定、可靠、易行。     

β珠蛋白基因5′远端新沉默子的结构和功能

通过凝胶滞留分析和荧光素酶报告基因检测系统,鉴定出人类β珠蛋白基因5′旁侧远端帽位上游－2132－－1822bp间存在一个活性沉默子片段（310bp）。通过DNA足迹分析,对其DNA序列与从Hela细胞核中提取的DNA结合蛋白（核蛋白）的相互作用进行了研究,结果显示该DNA片段中存在两个相邻的核蛋白结合位点,分别为帽位上游－2017－2011bp间序列“CTTCCCGC”和－2006－－1997bp间序列“CACTTTATTT”。采用人工设计的突变引物,分别将上述两段序列定点诱变为“CTTAAGC”和CACTTAAGTT”,从而形成两种突变型310bp片段,经竞争性凝胶滞留分析,显示这两种突变型片段以及它们分别经限制酶BspTI消化产生的4个小片段均丧失了与野生型310bp片段探针竞争核蛋白的能力;而采用人工合成包含正常“CTTCCGC”和“CACTTTATTT”序列的双链寡核苷酸片段进行性凝胶滞留分析,结果显示它具有与野生型310bp片段探针竞争DNA结合蛋白的能力,从而验证了这两段序列是存在着相互作用的核蛋白结合位点。与此同时,采用DNA结合蛋白纯化试剂盒,对Hela细胞核蛋白提取物中的特异性DNA结合蛋白进行亲和素磁性分离纯化,经蛋白质SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳结合银染鉴定,结果显示确实存在两种DNA结合蛋白分别与此沉默子的活性片段,它们的分子量分别为37kD和81kD,而它们的特性和作用机理用待进一步深入研究。     

人类β珠蛋白基因簇表达的转录调控

人类β珠蛋白基因簇的表达具有明显对空调控特征,即具有严格的红系组织特异性和不同发育阶段特异性,同时尚需精确调控,以使α／β珠蛋白链合成比趋向平衡并定量聚合成功能蛋白Ｋ血红蛋白,因此,它是研究真核基因表达调控及基因表达与细胞分化关系的理想模型,本文拟综述在转录水平人类β珠蛋白基因表达调控研究的进展,产对该领域的发展方向进行预测,以期逐步深入研究并最终阐明其表达调控机制,并籍此文报道近年来我们在此领域     

K562细胞中锌指蛋白cDNA基因片段的克隆

 Ｋ５６２细胞中锌指蛋白ｃＤＮＡ基因片段的克隆刘智,朱定尔,谢慎思,朱小湘,肖广惠,陈汉春（湖南医科大学分子生物学研究室,长沙４１００７８）１９８５年,Ｍｉｌｌｅｒ等［１］等分离并测定了非洲爪蟾卵母细胞转录因子ⅢＡ（ＴＦⅢＡ）的ｃＤＮＡ序列,推出蛋白质...     

人脑醛糖还原酶的纯化和一些基本性质

使用DEAE纤维素柱层析、PBE-94层析聚焦、NADP~+-Sepharose 4B亲合层析及SephadexG-100凝胶过滤分离纯化了人脑醛糖还原酶。在DEAE层析中,用咪唑-HCI缓冲液替代了磷酸缓冲液,改善了分离效果。在聚丙烯酰胺及SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳中,纯化的人脑醛糖还原酶均呈一条区带。它的pI为5.6,最适pH为6.5,分子量为36,000,底物特异性和氨基酸组成与其它哺乳动物的醛糖还原酶有相似性。开链式醛糖是醛糖还原酶的真正底物,它在开链式和半缩醛的平衡体系中占比例极小,因而推知醛糖还原酶对此底物有很高的K_(cat)和K_(cat)/K_m值,能有效地将它们还原成相应的醇。     

β珠蛋白基因5'远端新沉默子克隆及定点诱变

通过凝胶滞留分析和荧光素酶报告基因检测系统,鉴定出人类β珠蛋白基因5'旁侧远端帽位上游-2 132～-1 82 2 bp间存在一个活性沉默子片段(310 bp),将其亚克隆至pUC-T载体中,然后采用人工设计的突变引物,将经DNA足纹分析确定的两个结合位点的核心基序(β珠蛋白基因帽位上游 -2 017～-2 011 bp间的"CTTCCGC"序列和-2 006～-1 997 bp间的"CACTTT ATTT"序列) 分别定点诱变为"CTTAAGC"和"CACTTAAGTT"两个突变序列,从而构建成两种突变型310 bp片段,可用于对活性沉默子位点的结构与功能及β珠蛋白基因表达调控机制的深入研究.