土槿乙酸对白假丝酵母菌生物膜的抑制作用

目的探讨土槿乙酸(pseudolaric acid B,PAB)对体外白假丝酵母菌生物膜的影响。方法甲基四氮盐(XTT)法检测不同浓度PAB和AMB(两性霉素B)对白假丝酵母菌生物膜的抑制作用。血清芽管试验检测不同浓度PAB对芽管生成的影响。结果 PAB对白假丝酵母菌生物膜的SMIC50(抑制生物膜50%的药物浓度)为256~512μg/m L;1024和512μg/m L PAB对早期2 h生物膜的抑制率分别为(99.5±0.28)%和(97.1±0.38)%;512μg/m L PAB对早期(2 h)、中期(8 h)及成熟期(24 h)生物膜的抑制率分别为(97.1±0.38)%、(90.4±0.32)%和(80.1±0.67)%;不同浓度PAB的血清芽管试验显示,64μg/m L PAB可以完全抑制白假丝酵母菌的出芽生长,16μg/m L PAB可以抑制83.5%的白假丝酵母菌出芽生长。结论 PAB对体外白假丝酵母菌生物膜有抑制作用,对白假丝酵母菌的出芽生长过程抑制作用显著。     

穿心莲内酯对白假丝酵母菌菌丝的影响

目的探讨中药有效成分穿心莲内酯（Andrographolide,AG）对白假丝酵母菌菌丝的影响。方法利用稀释涂布法观察AG对固体培养基上白假丝酵母菌菌落形态的影响;倒置显微镜观察AG对白假丝酵母菌芽管及菌丝形态的影响;采用xTT还原法评价AG对白假丝酵母菌菌丝活性的影响;采用实时荧光定量PCR（qRT—PCR）检测白假丝酵母菌菌丝形成相关基因SUN41、CSHl以及CaPDE2表达量变化。结果AG能影响白假丝酵母菌菌落的形态;倒置显微镜观察表明AG能够抑制白假丝酵母菌菌丝及芽管的形成;qRT-PCR检测显示AG能使SUN41和CSHl基因表达下调和使CaPDE2上调。结论穿心莲内酯可能通过影响SUN41、CSHl与CaPDE2基因的表达而抑制白假丝酵母菌菌丝的形成。     

白假丝酵母菌生物膜的研究进展

随着医疗水平的不断发展,越来越多的医疗操作、医疗设备和药物可能导致人体正常的微生物平衡被打破,使得机会致病菌白假丝酵母菌的感染呈现逐年上升的趋势。白假丝酵母菌在宿主或医疗器械表面形成生物膜的能力是一个十分关键的毒力因素。生物膜可以帮助白假丝酵母菌成功逃避宿主免疫并产生较强的耐药性,从而导致难治性真菌感染。本文从白假丝酵母菌生物膜的形成过程、生物膜相关的主要基因和影响生物膜毒力的因素3个方面介绍近年来的研究进展,为进一步研究白假丝酵母菌生物膜的形成机制提供参考。     

VirAB在单核细胞增生李斯特菌耐药性及生物被膜形成中的作用

【背景】单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,Lm)对一些临床常用抗生素、乳酸链球菌素(Nisin)等抗菌药物的敏感性下降,然而其背后的机制仍未完全阐明。【目的】调查转运蛋白VirAB在Lm对抗菌药物的耐药性及生物被膜形成中的作用。【方法】利用同源重组技术构建Lm基因缺失突变株,比较野生株和缺失株对抗菌药物的耐药性;利用微孔板法观测突变株生物被膜形成能力的变化;利用平板泳动法研究菌株的泳动能力。【结果】与野生株相比,virAB缺失突变株对头孢类抗生素、Nisin和溴化乙锭的敏感性增加;当培养基中分别添加亚致死浓度的苯扎氯铵、卡那霉素和四环素时,突变株均表现出不同程度的生长缺陷。缺失virAB后菌株形成生物被膜的能力下降。【结论】VirAB在Lm对头孢类等抗菌药物的耐药及生物被膜形成方面具有重要作用。     

口腔黏膜真菌鉴定方法的比较

比较常见用于黏膜真菌菌种鉴别的多种方法,探寻最佳的鉴别方法。采集230例普通人群口腔黏膜样本,分别用玉米吐温-80培养观察厚膜孢子法、糖发酵生化反应法、CHROMagar假丝酵母菌显色培养基法、ITS基因的PCR-RFLP(聚合酶链反应-限制性片段长度多态性)法、ITS测序菌种鉴定法,鉴别真菌各菌株。结果显示:有56例菌株至少通过1种方法检出真菌;玉米吐温-80分离培养假丝酵母菌37株;50例菌株ITS基因测序共鉴定出8个菌种,白假丝酵母菌(C.albicans)29株,近平滑假丝酵母菌(C.parapsilosis)10株,热带假丝酵母菌(C.tropicalis)5株,Candida metapsilosis 1株,Lodderomyces elongisporus 1株,克柔假丝酵母菌(Candida krusei)1株,乙醇假丝酵母菌(C.ethanolica)1株,季也蒙毕赤酵母菌(Pichia guilliermondii)2株;CHROMagar假丝酵母菌显色培养基法鉴定出3种菌株,分别是白假丝酵母菌、热带假丝酵母菌、近平滑假丝酵母菌;PCR-RFLP法检出5种菌株,分别是白假丝酵母菌、热带假丝酵母菌、近平滑假丝酵母菌、季也蒙毕赤酵母菌、克柔假丝酵母菌,与基因的测序鉴定一致率为91%;糖发酵生化反应法阳性标本占被检出真菌例数的46.4%(26/56)。结果表明:ITS基因的测序法可以准确鉴定真菌各个菌种;PCR-RFLP法能鉴定常见的菌种,但操作繁琐;CHROMagar假丝酵母菌显色培养基法能快速准确鉴别3种常见假丝酵母菌菌种;玉米吐温-80可以准确培养鉴别白假丝酵母菌;糖发酵生化反应法,缺乏足够的敏感度和特异性,难以准确鉴别各个菌种。     

三颗针对白假丝酵母的抑制作用

目的研究三颗针对白假丝酵母的抑制作用。方法采用溴化噻唑蓝四唑法(MTT)和琼脂平板法测定三颗针对白假丝酵母的最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MFC);利用倒置荧光显微镜观察三颗针对白假丝酵母菌丝形成的影响;采用MTT法测定三颗针对白假丝酵母菌丝萌发不同时期的抑制率。结果三颗针对白假丝酵母具有较强的抑制作用。其中,采用琼脂平板法测得三颗针抑制该菌的MIC为2mg/mL,MFC为4mg/mL。三颗针能减缓该菌的生长速度或使其停止生长,且浓度越高作用效果越明显。其中4mg/mL的三颗针作用白假丝酵母6h后,能够完全抑制菌丝形成。对于24h后已经萌发为菌丝态的白假丝酵母,三颗针可抑制菌丝的继续生长,与对照组相比,4mg/mL的三颗针对于萌发2h后的白假丝酵母的菌丝抑制率为76.7%(P0.01)。结论三颗针能抑制白假丝酵母菌丝的生长和萌发。     

黄连解毒汤乙酸乙酯提取物对白假丝酵母菌黏附作用的影响

目的探讨黄连解毒汤乙酸乙酯提取物（ethyl acetateextract of Huanglianjiedu decoction,EAHD）对白假丝酵母菌黏附作用的影响。方法XTT法检测白假丝酵母菌黏附力;平板法计数导管上黏附的白假丝酵母菌CFU;倒置显微镜观察黏附的白假丝酵母菌;qRT—PCR法定量检测黏附相关基因EAP1、HWP1、ALS1、ALS3、MP65的表达。结果312μg/mL EDHA可显著抑制白假丝酵母菌在聚苯乙烯和聚酯导管上的黏附;白假丝酵母菌生长早期在EDHA作用下,菌细胞出芽数均呈现剂量依赖性降低;EDHA作用后,EAP1、HWP1均下调,ALS3、MP65均上调,ALS1几乎未变化。结论EAHD可显著抑制白假丝酵母菌的黏附作用。     

大黄素对白假丝酵母菌抑菌作用的体外实验研究

目的研究大黄素对白假丝酵母菌的活性及其产生的生物膜的抑菌作用。方法将滴有不同浓度的大黄素药液的滤纸片放在长有白假丝酵母菌的固体培养基上,观察抑菌效果的区别。在体外建立白假丝酵母菌生物膜模型,用浓度为2.500、1.250、0.625、0.312和0.165mg/mL的大黄素溶液分别作用于已建立好的白假丝酵母菌生物膜模型,观察5个浓度的大黄素对白假丝酵母菌的抑菌效果。利用激光共聚焦显微镜(CLSM)观察各个浓度下的生物膜。结果随着大黄素浓度的增加,抑菌环直径增大,抑菌率升高。CLSM观察:大黄素作用于白假丝酵母菌生物膜,使生物膜活性降低。结论大黄素对白假丝酵母菌及其生物膜有抑制作用。     

不同培养基对白假丝酵母菌生物膜芽管形成的影响

目的评估不同培养基对产生物膜白假丝酵母菌芽管产生的影响。方法收集临床产生物膜的白假丝酵母菌20株,购买3株可以产生物膜的质控菌株。比较23株白假丝酵母菌在5种不同培养基(人血清、胰蛋白胨大豆肉汤、脑心浸液肉汤、RPMI 1640、NaHCO₃溶液)的出芽菌株数量和出芽率。结果在23株产生物膜的白假丝酵母菌中,人血清和脑心浸液肉汤培养基中23株(100.0％)全部产生芽管,NaHCO₃培养基18株(78.3％)、胰蛋白胨大豆肉汤培养基16株(69.6％)和RPMI 1640培养基15株(65.2％)。芽管生成试验阳性的白假丝酵母菌中,在5% CO₂培养条件下的酵母细胞出芽率更高(孵育2 h,出芽率78.0%),芽管长度更长。结论 脑心浸液肉汤可以代替人血清作为芽管试验的诱导剂,人血清(5% CO₂)可以促进芽管的生成以及延伸芽管的长度。     

CRK1基因缺失对白念珠菌形态、黏附、生物被膜的影响

目的 研究CRK1基因缺失对白念珠菌形态、黏附、生物被膜的影响.方法 显微镜下观察,计算菌丝形成率,比较CRK1基因缺失菌（Δcrk1菌）及标准菌SC5314形成菌丝的能力;建立肠黏膜模型,计算黏附率,评价CRK1基因缺失对白念珠菌黏附的影响;MTT法及结晶紫法（CV）评价CRK1基因缺失对白念珠菌生物被膜形成的影响.结果 与SC5314相比,Δcrk1菌分别在10％胎牛血清和RPMI-1640培养条件下形成菌丝能力均较弱,两者之间有统计学差异;Δcrk1菌在60、90、120 min时对肠黏膜的黏附数明显少于标准菌SC5314,两者之间有统计学差异;通过MTT法、结晶紫法两种方法证实了,在经48 h培养后,Δcrk1菌与其标准菌SC5314相比,形成生物膜的能力弱,两者之间差异有统计学差异.结论 CRK 1基因缺失影响白念珠菌菌丝二态性的转化,进而影响黏附力和生物被膜的形成.     

乳杆菌发酵上清对耐药白假丝酵母生物膜的作用

目的研究德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii,L.delbrueckii)和发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum,L.fermentum)发酵上清液对3株耐氟康唑白假丝酵母临床分离株CA3、CA6、CA8生物膜形成和分散的作用。方法通过MIC试验,确认3株白假丝酵母临床分离株对氟康唑耐药;用96孔板构建体外白假丝酵母生物膜;用棋盘法分别检测L.delbrueckii、L.fermentum发酵上清液与氟康唑联用对3株白假丝酵母的作用;用XTT法对生物膜形成量进行定量分析;检测L.delbrueckii、L.fermentum发酵上清液与氟康唑联用对白假丝酵母时间-生长曲线的影响;显微镜拍照检测L.delbrueckii、L.fermentum发酵上清液单独和氟康唑联用对白假丝酵母生物膜形态的影响;平板培养法检测L.fermentum发酵上清液对白假丝酵母黏附作用的影响。结果 CA3、CA6、CA8三株临床分离菌株对氟康唑耐药,MIC浓度均为8μg/mL。L.delbrueckii与L.fermentum发酵上清液与氟康唑联用对3株耐药型白假丝酵母的生物膜形成与分散均未表现出协同作用,且发酵上清液与氟康唑联用效果不如发酵上清液单独处理效果好,L.fermentum发酵上清液对生物膜的分散作用较L.delbrueckii发酵上清液强。L.fermentum发酵上清液抑制白假丝酵母的初始黏附。结论 L.delbrueckii、L.fermentum发酵上清液单独应用时均对耐氟康唑白假丝酵母生物膜的形成与分散有干预作用,与氟康唑联用时未表现出协同作用,抑制耐药白假丝酵母生物膜的作用可能与抑制菌丝形成和起始黏附有关。     

肺炎克雷伯菌KP1＿4563基因突变株的构建及其生物膜表型分析

KP1_4563基因是肺炎克雷伯菌NTUH-K2044中假设的蛋白编码基因,与Ⅲ型菌毛的功能有关。本实验首先采用同源重组基因敲除方法构建肺炎克雷伯菌KP1_4563基因缺失的突变株(Kp-△4563),然后PCR扩增KP1_4563基因片段,克隆到质粒p BAD33上,将重组质粒导入Kp-△4563获得回补株(Kpc-△4563)。分别测定野生株、突变株、回补株用普通LB培养基,改良Minka培养基以及含胆汁盐的LB培养基培养时生物膜形成能力,以此来探讨KP1_4563基因以及不同培养基对肺炎克雷伯菌体外生物膜形成的影响。我们成功构建KP1_4563基因缺失的突变株和回补株Kpc-△4563。与野生株相比,突变株Kp-△4563生物膜形成能力减弱,回补株介于野生株和突变株之间。使用改良Minka培养基使菌株菌毛化以及加入胆汁盐可以增加生物膜的形成能力。这些分析表明肺炎克雷伯菌KP1_4563基因能正调控细菌生物膜的形成。体外培养使细菌菌毛化以及加入胆汁盐可以促进生物膜的形成。     

结核分枝杆菌生物膜形成相关基因的筛选与鉴定

目的:通过菌落表型变化并结合生物膜生长缺陷筛选并鉴定可能与生物膜形成相关基因.方法:利用带有Himarl转座子的MycoMarT7转座子系统建立结核分枝杆菌H37Ra随机插入突变库;筛选细菌表面结构发生变化和生物膜形成有变化的突变菌株;运用T-A克隆法并结合抗性标记挽救法获得突变菌株的随机插入基因侧翼序列从而鉴定突变基因,并运用生物信息学方法分析预测突变基因的功能.结果:通过菌落形态变化及生物膜缺陷表型筛选出39株突变株,成功鉴定其中16株突变株,涉及16个基因发生突变,其中5个与脂质代谢相关,4个与细胞壁合成相关、2个与中间代谢和呼吸作用相关、1个调节蛋白相关基因,1个毒力相关基因,1个PE/PPE家族基因,还有2个功能未知基因.结合生物膜形成缺陷分析,其中8个基因可能与H37Ra体外生物膜的形成相关.结论:成功构建库容量约为l×104结核分枝杆菌转座子随机插入突变文库,筛选获得生物膜生长受损突变株及可能与结核分枝杆菌生物膜形成相关的基因信息,为后续深入开展生物膜形成机制研究奠定基础.     

白念珠菌CaPPEl的克隆及其在酿酒酵母形态发生中的功能研究

白念珠菌的致病性与其形态转变相关,白念珠菌的形态转换受各种外界信号和细胞内信号转导途径的调控。转录因子Flo8在酿酒酵母形态发生中起重要作用,我们将白念珠菌基因组文库导入flo8缺失株中,筛选能够校正flo8缺失株侵入生长缺陷的基因,分离得到一个与酿酒酵母蛋白磷酸酯酶甲基酯酶PPEl同源的基因,命名为CaPPEl。CaPPEl的基因编码区全长1083bp,推测编码一个361氨基酸的蛋白。在单倍体酿酒酵母中,CaPPEl基因的表达可以部分回复flo8缺失株的侵入生长缺陷,但是在MAPK途径缺失株中不能进行侵入生长。在双倍体酿酒酵母中,CaPPEl基因的表达可以部分激活MAPK途径成员缺失株的菌丝生长缺陷,但却只能在flo8缺失株中产生微弱的激活作用。结果表明CaPpel在酿酒酵母的假菌丝生长和侵入生长中参与的信号转导途径不同。     

伊犁黑蜂蜂胶对不同生长状态白假丝酵母菌抑菌作用的体外研究

目的探究伊犁黑蜂蜂胶对白假丝酵母菌游离状态及其生物膜状态的影响。方法采用NCCLS M27-A2酵母微量稀释法结合平板法测定蜂胶对游离状态下白假丝酵母菌的最小抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC);玻片法在体外构建白假丝酵母菌生物膜模型,采用MTT法检测蜂胶对白假丝酵母菌生物膜状态下的最低生物膜清除浓度(MBEC)及抑制作用;激光共聚焦显微镜(CLSM)观察不同浓度蜂胶醇提取物对同一时间白假丝酵母菌生物膜的抑菌效果,并进行红蓝荧光染色定量分析。结果伊犁黑蜂蜂胶对浮游白假丝酵母菌的MIC为4mg/mL,MBC为8mg/mL;伊犁黑蜂蜂胶对生物膜状态下白假丝酵母菌的MBEC为16mg/mL,随着药物浓度的增加抑菌性逐渐增大,差异具有统计学意义(P0.05);CLSM观察,伊犁黑蜂蜂胶作用于白假丝酵母菌生物膜后可使生物膜内活菌比例降低,生物膜活性减弱,生物膜内实验菌死亡率随蜂胶浓度增加呈上升趋势,与阴性对照组比较差异有统计学意义(P0.05)。结论伊犁黑蜂蜂胶在体外对不同状态下的白假丝酵母菌均起到了明显的抑制作用。     

白念珠菌CaPPE1的克隆及其在酿酒酵母形态发生中的功能研究

白念珠菌的致病性与其形态转变相关,白念珠菌的形态转换受各种外界信号和细胞内信号转导途径的调控.转录因子Flo8在酿酒酵母形态发生中起重要作用,我们将白念珠菌基因组文库导入flo8缺失株中,筛选能够校正flo8缺失株侵入生长缺陷的基因,分离得到一个与酿酒酵母蛋白磷酸酯酶甲基酯酶PPE1同源的基因,命名为CaPPE1.CaPPE1的基因编码区全长1083bp,推测编码一个361氨基酸的蛋白.在单倍体酿酒酵母中,CaPPE1基因的表达可以部分回复flo8缺失株的侵入生长缺陷,但是在MAPK途径缺失株中不能进行侵入生长.在双倍体酿酒酵母中,CaPPE1基因的表达可以部分激活MAPK途径成员缺失株的菌丝生长缺陷,但却只能在flo8缺失株中产生微弱的激活作用.结果表明CaPpe1在酿酒酵母的假菌丝生长和侵入生长中参与的信号转导途径不同.     

高亲和性铁离子渗透酶Ftr1和Ftr2调控白念珠菌生长和形态

摘要:【目的】通过分析FTR1、FTR2基因缺失株在不同培养条件下的生长情况以及菌丝生长能力,明确高亲和性铁离子渗透酶在白念珠菌生长和形态发生中的功能。【方法】将不同基因型的菌株分别置于不同的培养基和培养温度下进行培养,对其生长速度以及菌丝的生长状态进行观察,获取相应的实验结果。【结果】FTR1或FTR2单基因缺失对于白念珠菌的生长没有显著的影响,但是FTR1、FTR2双基因缺失使白念珠菌在Spider培养基中不能生长,铁离子的增加能够恢复该双基因缺失株的生长能力。FTR1、FTR2双基因缺失株在营养贫瘠的合成培养基上生长速度也较慢。此外,ftr1/frt1菌株的菌丝生长能力增强,而ftr2/ftr2菌株的菌丝生长能力减弱。双突变株ftr1/ftr1 ftr2/ftr2的菌丝生长能力能够恢复到野生对照株的水平。【结论】Ftr1与Ftr2对白念珠菌在微量铁元素环境中的生存有着重要的作用,还参与了白念珠菌对碳源N-乙酰葡萄糖胺、乙醇和甘油等的利用。此外,Ftr1对白念珠菌菌丝生长起负调控作用,Ftr2对菌丝生长起正调控作用。因此,ftr1/ftr1 ftr2/ftr2双基因突变株的菌丝生长能力能够恢复到野生对照株的水平。     

白念珠菌SIM1基因敲除与功能研究

目的构建白念珠菌SIM1基因缺失菌,初步考察SIM1基因的功能。方法采用同源重组的方法构建SIM1基因双臂缺失菌,通过测定生长曲线、菌丝诱导、黏附上皮细胞等实验考察SIM1基因缺失菌表型。结果成功构建SIM1基因缺失菌,SIM1基因缺失后没有显著影响白念珠菌生长繁殖、菌丝及被膜形成,但白念珠菌对Caco-2细胞和KB细胞的黏附能力显著下降,对部分药物的敏感性增加。结论白念珠菌SIM1基因缺失导致细胞壁成分改变,并影响白念珠菌对宿主的黏附。     

金黄色葡萄球菌hmp基因缺失突变株的构建及抗一氧化氮能力分析

摘要：【目的】:构建金黄色葡萄球菌RN6390黄素血红蛋白(flavohaemoglobin, HMP)基因缺失突变株,研究其抗一氧化氮(Nitric Oxide, NO) 能力及其在细菌生物被膜形成中的作用。【方法】：根据同源重组技术的原理,利用PCR扩增RN6390的hmp基因上下游同源臂,经过抗生素和温度交替培养筛选hmp基因缺失突变株,利用基因组PCR、定量PCR对突变菌株进行鉴定。以硝普钠（SNP）为NO供体,检测了hmp基因缺失菌株的抗NO能力,并初步研究了hmp基因在生物被膜形成中的作用。【结果】：成功构建了RN6390的hmp基因缺失突变株,外源NO能够诱导菌株hmp基因的表达,hmp基因缺失菌株抗NO能力明显下降,但其生物被膜形成能力有明显提高。【结论】：获得了RN6390的hmp基因缺失突变株,该突变株的获得为进一步研究hmp基因的生物功能,以及细菌内源性NO的作用奠定了良好的技术平台。     

白念珠菌CaPPE1的克隆及其在酿酒酵母形态发生中的功能研究

白念珠茵的致病性与其形态转变相关,白念珠茵的形态转换受各种外界信号和细胞内信号转导途径的调控。转录因子Flo8在酿酒酵母形态发生中起重要作用,我们将白念珠茵基因组文库导入flo8缺失株中,筛选能够校正flo8缺失株侵入生长缺陷的基因,分离得到一个与酿酒酵母蛋白磷酸酯酶甲基酯酶PPEI同源的基因,命名为CaPPEl。CaPPEl的基因编码区全长1083bp,推测编码一个361氨基酸的蛋白。在单倍体酿酒酵母中,CaPPE1基因的表达可以部分回复flo8缺失株的侵入生长缺陷,但是在MAPK途径缺失株中不能进行侵入生长。在双倍体酿酒酵母中,CaPPEl基因的表达可以部分激活MAPK途径成员缺失株的茵丝生长缺陷,但却只能在flo8缺失株中产生微弱的激活作用。结果表明CaPpel在酿酒酵母的假茵丝生长和侵入生长中参与的信号转导途径不同。