溶藻弧菌毒力菌株SSH文库的构建

[目的]通过构建基因文库为溶藻弧菌毒力基因的鉴定、致病机理的阐明奠定基础。[方法]应用抑制性差减杂交技术(suppression subtrative hybridization,SSH),以毒力菌株HN08155为测试子(Tester),构建了溶藻弧菌毒力菌株HN08155的SSH差减文库。[结果]文库共含有2 873个克隆;通过菌落PCR鉴定,2 786个克隆能扩增出250~1 000bp大小的目标片段;通过Southern斑点杂交,确定毒力菌株特异基因的阳性克隆347个,经测序和同源性比对分析,其中135个克隆的序列含有已知的77个基因,其中46个基因主要为代谢途径的多种酶类的编码基因,23个基因为其它基因,8个为毒力相关功能基因。[结论]这些毒力相关功能基因包括丝氨酸蛋白酶基因prk A、热休克蛋白基因dna J、趋化因子基因che W、甲基受体趋化蛋白(methyl-accepting chemotaxis protein)基因、双组分感应子(two-component sensor)基因、Ⅳ型菌毛(typeⅣpilin Pil A)基因、生物膜相关的表面蛋白(biofilm-associated surface protein)基因和外膜蛋白(outer membrane protein)基因;该文库中还含有166个未知新基因,占文库中总基因数的68.44%,溶藻弧菌的毒力基因很可能存在于这个文库中的未知新基因中。     

文昌鱼性腺差减cDNA文库的构建

本研究以日本文昌鱼(Branchiostoma japonicum)性腺cDNA为材料,应用抑制性差减杂交技术构建文昌鱼雌雄性腺的差减cDNA文库.正向差减杂交以卵巢为试验方、精巢为驱动方,反向差减杂交以精巢为试验方、卵巢为驱动方,将所获差减cDNA片段克隆插入质粒表达载体,转化大肠杆菌DH5α,最后获得的正、反向差减文库分别含459、243个重组子.PCR 扩增鉴定正、反向差减cDNA文库的插入片段,其中90%左右的克隆皆能扩增出有效产物,插入片段范围为200-600 bp,符合差减文库PCR产物片段的大小.随机选取30个阳性克隆测序分析,得到26有效基因片段,进一步从中选取16个序列,用实时定量PCR对文库质量进行验证,结果表明所建文库能够达到富集雌雄性腺差异表达基因的目的.文昌鱼性腺差减文库的构建,为进一步分离、鉴定性腺分化和发育相关基因奠定了基础[动物学报 54(3):482-48 8,2008].     

杉木木材形成过程特异表达基因的鉴定与分析

为了获得杉木木质化过程中特异表达的基因, 本研究利用抑制差减杂交技术, 以杉木突变体独干杉无性系为测试方(Tester), 正常的句容0号无性系为驱动方(Driver), 构建了正向差减文库, 获得了618个克隆。利用通用引物T7和SP6进行PCR及EcoRⅠ酶切鉴定文库重组子, 同时, 利用点杂交技术, 以正向差减、反向差减及未差减的测试方和驱动方四种探针, 进行了进一步的筛选阳性克隆。用定量PCR对结果进行了初步验证。260个单一ESTs中60%的与已知蛋白具有显著同源性, 可分为4个主要类别: 新陈代谢、细胞壁生成和结构重构、信号传导和胁迫。系统分析参与杉木木材形成的基因对了解木质部分化的分子机制具有重要意义, 是了解木材形成遗传控制的直接信息来源, 也是改良材形和纤维性质的潜在候选基因。     

奉节脐橙果皮褐变差减文库的构建及初步分析

以奉节脐橙果实为材料,采用抑制差减杂交技术,分别以褐变与未褐变柑橘果皮作为检测方和驱动方,成功构建了果皮褐变的差减cDNA文库,对部分克隆进行了序列测定并与GenBank进行了同源性比较。选择其中的4个基因:钙结合蛋白同源基因、半胱氨酸蛋白酶同源基因、NAC蛋白质家族同源基因和膨胀素同源基因进行半定量RT-PCR分析,结果表明它们在褐变果皮中的表达量均高于未褐变果皮,说明这些基因的增强表达可能与脐橙果皮褐变有密切关系。     

中华绒螯蟹卵巢差减cDNA文库的构建

应用抑制性差减杂交技术构建中华绒螯蟹卵巢两个发育时期的差减cDNA文库。正向差减杂交以Ⅲ期卵巢为试验方、Ⅱ期卵巢为驱动方,反向差减杂交以Ⅱ期卵巢为试验方、Ⅲ期卵巢为驱动方;将所获差减cDNA片段克隆入质粒表达载体,转化大肠杆菌JM109。最后获得的正、反向差减文库分别含863、360个重组子。PCR扩增鉴定正、反向差减cDNA文库的插入片段平均大小分别为360和160bp,表明所构建的差减言语库适合进一步研究中华绒螯蟹卵巢发育相关基因。     

用抑制差减杂交法分离和克隆梭梭幼苗受渗透胁迫诱导相关基因的cDNA片段

以Hoagland溶液培养的梭梭幼苗（H）为对照群体,甘露醇处理的梭梭幼苗（M）为目标群体,进行抑制差减杂交。用经过H cDNA差减的M cDNA构建了一个含有大约400个独立克隆的差减文库;采用差减前的H cDNA和M cDNA以及正向／反向差减杂交后的cDNA为模板标记探针,对随机挑取的100个重组质粒进行差示筛选,获得了21个阳性侯克隆,从这些阳性候选克隆中随机挑取了8个进行Northern blot分析。证实其中3个候选克隆代表了在M中特异表达或表达增强的基因,序列分析和同源性比较表明它们与逆境胁迫有关;而另外5个候选克隆无Northern杂交信号,推测它们为低丰度转录本。     

褐飞虱唾液腺中水稻抗性适应基因的分离

褐飞虱Nilaparvata lugens (Stål)是一种危害水稻的重要害虫, 在取食水稻时其唾液腺分泌的一些物质能激发水稻产生一系列生理生化反应。为了从褐飞虱唾液腺中得到编码这些分泌物的基因, 本研究运用抑制差减杂交法（suppressed subtractive hybridization, SSH）和镜像选择（mirror orientation selection, MOS）法, 分别以取食抗虫水稻B5和敏感水稻TN1的褐飞虱唾液腺cDNA为tester和driver, 构建了一个含有768个克隆子的抑制差减杂交文库。经筛选得到102个EST, 插入序列长250~1 000 bp, 代表35个单基因。其中28个表达上调, 7个表达下调。经GenBank里的blastx在线分析工具分析, 除了约1/3的转录序列没有相匹配的蛋白质外, 其他EST所代表的氨基酸序列与已知蛋白存在不同程度的相似度, 如海藻溏酶、 卵黄蛋白原、 Ca²⁺结合蛋白、 组织蛋白酶B （cathepsin B）、 黏液样蛋白（putative mucin-like protein）、 羧酸酯酶（carboxylesterase）和碳酸酐酶（cah-3 carbonic anhydrase）等, 且多数蛋白含有信号肽, 推测与分泌有关。本研究将为进一步研究刺吸式昆虫中的激发子蛋白奠定了一定的基础。     

应用抑制性消减杂交技术筛选流感病毒感染宿主应答基因

从宿主系统寻找病毒感染特异性相关的生物大分子是研究病毒药物靶标和诊断标志物的新方向 .为了筛选宿主细胞中流感病毒感染特异性基因 ,采用抑制性消减杂交技术 (SSH) ,以流感病毒A 鲁防 93 9(H3N2 )感染MDCK细胞及正常MDCK细胞为材料 ,构建病毒感染特异性差减cDNA文库 ,PCR法扩增鉴定其中插入片段大小 .从差减文库中随机挑取 10 0个克隆进行测序 ,用生物信息学方法对其同源性和基因功能进行分析和预测 .结果显示 ,成功构建了流感病毒感染特异性差减cDNA文库 ,文库中cDNA片段长度在 2 5 0～ 10 0 0bp之间 .从文库中随机选取 10 0个克隆测序 ,获得了 95个有效序列 ,经blast同源性分析发现 ,大部分基因为参与宿主细胞能量代谢和蛋白质生物合成过程中的基因 ;其中 19个为无任何功能线索的新基因片段 .流感病毒感染特异性差减cDNA文库的建立和筛选出病毒感染应答候选新基因cDNA片段 ,为发现新型流感病毒药靶和诊断标志物以及病毒感染机制研究打下基础     

巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）微管相关蛋白全长cDNA克隆及表达分析

从巴西橡胶树Hevea brasiliensis差减cDNA文库中分离到微管相关蛋白（Microtubule-associated protein,MAPs）基因片段,根据该基因片段序列信息,设计特异引物,采用cDNA末端快速扩增技术RACE（Rapid Amplification ofcDNA Ends）进行差异片段的5＇和3＇端的扩增,获得了长度为788bp的全长cDNA,该基因在GenBank中的登录号为AY461412.序列分析表明该基因包含完整的开放阅读框,编码144个氨基酸,与微管相关蛋白基因家族具有很高的同源性,推测该基因是微管相关蛋白基因.半定量RT-PCR检测证实它在胶乳中的表达强于叶中,胁迫处理（伤害及乙烯处理）使其表达上调.     

渗透胁迫下白花柽柳消减文库的构建及分析

用PEG6000对白花柽柳进行渗透胁迫,以其叶部cDNA为试验方（tester）,正常生长的白花柽柳叶部cDNA为驱动方（driver）,利用抑制性消减杂交技术（SSH）构建了渗透胁迫下白花柽柳的消减文库。提取重组质粒经PCR检测,插入片段大部分集中在250～650 bp之间。通过对文库阳性克隆的随机测序,获得了如脯氨酸转移蛋白、钙依赖蛋白激酶、亮氨酸拉链蛋白、类转录起始因子蛋白等23个与渗透胁迫有关的EST,它们涉及了植物的渗透调节、信号传递、基因调控、活性氧清除、新陈代谢等生理生化过程。     

用改良消减杂交结合选择性PCR法构建老年性白内障消减cDNA文库

为构建含较多大片段的高质量的老年性白内障消减cDNA文库 ,利用生物素标记、磁珠分离的改良消减杂交法获得差异cDNA .利用选择性PCR法扩增其中大片段差异cDNA ,将其与T 载体进行T A连接并转化入大肠杆菌 ,成功构建老年性白内障消减cDNA文库 .共获得 4 0 0 0余个克隆 ,随机挑取的 2 2个克隆中 ,≥ 10 0 0bp的片段有 7个 ,占 31 8% ,≥ 75 0bp有 15个 ,占 6 8 2 % .将≥ 75 0bp的 15个克隆进行反向点杂交 ,排除其中假阳性克隆 ,阳性克隆经测序并与GenBank比较 ,得到 6个已知基因、1个新基因 ,6个已知基因中 4个为全长基因 ,说明所得cDNA片段较大 ,文库质量较高 .改良消减杂交法结合选择性PCR法可以快速有效地获得大片段高质量的消减cDNA文库 ,为进一步筛选、鉴定老年性白内障致病相关基因奠定了基础     

大豆花叶病毒胁迫诱导的消减文库构建及初步分析

大豆花叶病毒病是危害大豆产量和品质的主要病害之一 ,通过分子手段研究大豆花叶病毒病基因的抗病相关基因表达可以辅助抗病育种工作。利用SSH技术 ,对抗大豆花叶病毒病的大豆品种 814 3进行分析 ,构建大豆花叶病毒胁迫诱导表达的cDNA文库 ,并对文库进行初步分析。     

应用抑制性消减杂交技术克隆大鼠肝再生过程中特异表达基因

应用抑制性消减杂交技术成功地构建了高消减效率的正向消减cDNA文库,从随机挑取的50个克隆中有31个均检出了60~400bp插入片段,对这些插入cDNA片段进行测序后经Genbank同源性检索,表明其中7个片段为未知新序列。大鼠肝切除后肝再生cDNA正向消减文库的建立为进一步大批量筛选、克隆肝再生特异性表达的未知新基因奠定了基础,初步筛选出的特异性表达的序列标记为进一步研究肝再生中基因的功能提供了依据。 Abstract:The cDNA from rat regenerating liver tissue was used as the tester and that from normal liver was used as the driver.A highly efficient subtractive cDNA library was constructed by suppression subtractive hybridization(SSH).After screening,31 clones from 50 clones which were derived from the cDNA library were inserted by 60~400bp cDNA fragments.24 cDNA fragments corresponded to known genes and 7 cDNA fragments were unknown sequences(GenBank accession number:BG447490~447496).     

利用抑制消减杂交分离受褐飞虱取食下调的水稻基因

为了分离受褐飞虱取食抑制的水稻基因,采用抑制消减杂交的方法,以正常生长的水稻幼苗为目标群体,以褐飞虱胁迫32 h的水稻幼苗作为对照群体,构建了含200个重组质粒的SSH cDNA文库.随机挑选50个重组质粒进行反向Northern差异筛选后,再经Northern杂交验证,得到2个受褐飞虱取食抑制的基因:一个是Lhca,编码水稻光系统Ⅰ天线蛋白;另一个基因(bpHd002)与肌苷-5'-单磷酸脱氢酶基因有同源性.以BpHd002为探针筛选水稻幼苗cDNA文库分离出该基因的全长cDNA(BpHd002A).其长度为1 285bp,含有一由519 bp组成的完整的阅读框,编码的蛋白质具有两个CBS结构域.     

申克孢子丝菌酵母相和菌丝相cDNA消减文库的构建

目的 筛选与申克孢子丝菌酵母相与菌丝相双相转换相关的差异表达基因,为探讨其双相转换的分子的机制奠定基础.方法 应用抑制性消减杂交技术,构建高特异性的申克孢子丝菌菌丝相（mycelium,M）和酵母相（yeast,Y）的正反cDNA消减文库,并对其差异表达的基因进行生物信息学分析.结果 M＋Y文库获得751条表达序列标签,平均长度为690.98 bp,经拼接后获得101条非冗余序列.Y＋M文库获得875条表达序列标签,平均长度为575.9 bp,拼接获得249条非冗余序列.经BLASTN比对,这些差异表达基因中,某些结构基因和功能不明的细胞分子类基因可能与双相转换有关.结论 成功构建了高特异性的申克孢子丝菌菌丝相和酵母相的正反cDNA 消减文库,为进一步筛选申克孢子丝菌的双相转换基因奠定了基础.     

干旱胁迫下刚毛柽柳消减文库的构建及分析

以干旱胁迫下的刚毛柽柳根部组织cDNA为tester,正常生长的刚毛柽柳根部组织cDNA为driver,利用抑制性消减杂交技术(SSH)构建了干旱胁迫下刚毛柽柳根部组织的消减文库。文库克隆的重组率为95%,插入片段大部分集中在250~600 bp之间。通过对文库阳性克隆的随机测序,获得了如Mn-SOD、myb相关蛋白、锌指蛋白等17种与干旱胁迫相关的基因,它们涉及了植物的渗透调节、信号传递、转录调控、活性氧清除等方面。所得EST序列已被GenBank收录。实验为抗逆基因克隆和系统研究干旱胁迫下柽柳根部基因的表达奠定了基础。     

干旱胁迫下黄檗幼苗cDNA消减文库的构建和分析

以干旱胁迫下的黄檗幼苗cDNA 为tester, 正常生长的黄檗幼苗cDNA为driver, 利用抑制性消减杂交技术(suppression subtractive hybridization, SSH)构建了干旱胁迫下黄檗幼苗的消减文库并对其进行了EST序列分析。从消减文库中随机挑取20个阳性克隆, 提取质粒进行酶切和PCR鉴定, 显示文库克隆的重组率大于95%, 插入片段大小大部分集中在300~800bp之间。随机挑取816个克隆进行测序, 得到265个基因。将其进行同源性分析, 划分为16类。获得了热激蛋白70、脱水响应蛋白(RD22)、通用胁迫蛋白、金属硫蛋白(MTII), 晚期胚胎丰富蛋白(LEA14)等44种与干旱胁迫相关的基因,它们涉及了植物的渗透调节、信号传递、转录调控、活性氧清除等方面。本研究为抗逆基因克隆和系统研究干旱胁迫下黄檗基因的表达奠定了重要的理论基础。     

干旱胁迫下黄檗幼苗cDNA消减文库的构建和分析

以干旱胁迫下的黄檗幼苗cDNA 为tester, 正常生长的黄檗幼苗cDNA为driver, 利用抑制性消减杂交技术(suppression subtractive hybridization, SSH)构建了干旱胁迫下黄檗幼苗的消减文库并对其进行了EST序列分析。从消减文库中随机挑取20个阳性克隆, 提取质粒进行酶切和PCR鉴定, 显示文库克隆的重组率大于95%, 插入片段大小大部分集中在300~800bp之间。随机挑取816个克隆进行测序, 得到265个基因。将其进行同源性分析, 划分为16类。获得了热激蛋白70、脱水响应蛋白(RD22)、通用胁迫蛋白、金属硫蛋白(MTII), 晚期胚胎丰富蛋白(LEA14)等44种与干旱胁迫相关的基因,它们涉及了植物的渗透调节、信号传递、转录调控、活性氧清除等方面。本研究为抗逆基因克隆和系统研究干旱胁迫下黄檗基因的表达奠定了重要的理论基础。     

日本血吸虫期别差异表达基因文库的构建及分析

为从期别差异表达基因分析入手研究血吸虫的生长发育机制,应用抑制性消减杂交 (suppressed subtractive hybridization , SSH) 技术首次构建了日本血吸虫尾蚴、虫卵和成虫的期别差异表达基因文库 . 经消减效率分析和三种文库克隆的 EST 的期别差异性鉴定,表明所建文库质量较高,为在整个基因组水平分离血吸虫的差异表达基因提供了重要材料 . 由三个文库选择 257 个插入片段大于 500 bp 的克隆测定了 EST 序列 . 同源性分析结果表明 257 个 EST 代表 182 种血吸虫基因,其中有 22 种为血吸虫已知基因,有 128 种为血吸虫已知 EST ,有 32 种为新发现的血吸虫基因 . 对 EST 编码蛋白的功能预测结果显示：尾蚴消减文库的基因多与运动、能量代谢、转录调节及致病性相关;虫卵消减文库的基因可能参与信号转导、细胞粘附、蛋白质和碳水化合物的代谢以及抗氧化反应;成虫消减文库的基因多参与蛋白质的合成、转运及分解代谢,参与虫体的运动等 . 大规模分离、分析血吸虫期别差异表达基因将对从分子水平去解读血吸虫的生长发育机制,筛选高效疫苗候选抗原、药物靶标及诊断制剂有重要意义 .