应用抑制性消减杂交技术筛选流感病毒感染宿主应答基因

从宿主系统寻找病毒感染特异性相关的生物大分子是研究病毒药物靶标和诊断标志物的新方向 .为了筛选宿主细胞中流感病毒感染特异性基因 ,采用抑制性消减杂交技术 (SSH) ,以流感病毒A 鲁防 93 9(H3N2 )感染MDCK细胞及正常MDCK细胞为材料 ,构建病毒感染特异性差减cDNA文库 ,PCR法扩增鉴定其中插入片段大小 .从差减文库中随机挑取 10 0个克隆进行测序 ,用生物信息学方法对其同源性和基因功能进行分析和预测 .结果显示 ,成功构建了流感病毒感染特异性差减cDNA文库 ,文库中cDNA片段长度在 2 5 0～ 10 0 0bp之间 .从文库中随机选取 10 0个克隆测序 ,获得了 95个有效序列 ,经blast同源性分析发现 ,大部分基因为参与宿主细胞能量代谢和蛋白质生物合成过程中的基因 ;其中 19个为无任何功能线索的新基因片段 .流感病毒感染特异性差减cDNA文库的建立和筛选出病毒感染应答候选新基因cDNA片段 ,为发现新型流感病毒药靶和诊断标志物以及病毒感染机制研究打下基础     

应用抑制消减杂交和cDNA芯片技术筛选流行性感冒病毒感染相关基因

病毒基因组有限的编码能力和以病毒蛋白为靶的抗病毒药物易出现耐药性,使从病毒感染宿主筛选病毒感染相关生物大分子作为抗病毒药靶和诊断标志物成为新的研究方向。为了筛选流行性感冒（流感）病毒感染相关基因,采用抑制消减杂交（suppression subtractive hybridization,SSH)技术,以流感病毒A／鲁防／93－9（H3N2）感染的MDCK细胞及正常MDCK细胞为材料,构建病毒感染特异性差减cDNA文库。从文库中随机挑取约800个克隆,PCR扩增其中插入片段,经纯化、紫外定量后,用基因芯片自动点样仪点在氨基片上,制备cDNA芯片。将流感病毒感染的MDCK细胞和正常MDCK细胞的总RNA分别用Cy3、Cy5反转录荧光标记后,与cDNA芯片杂交,用芯片扫描仪扫描获得芯片杂交信号,经阳性对照校正和归一化处理后,以如下条件作为判定基因差异表达的标准;（a)Cy3与Cy5的信号比值大于1．5（正常细胞用Cy5标记）或小于0．67（正常细胞用Cy3标记）;（b)Cy3和Cy5信号值之一必须大于1000。经cDNA芯片筛选获得了18个流感病毒感染特异性克隆,经测序和生物信息学分析发现均为流感病毒感染相关新基因EST。流感病毒感染相关基因cDNA片段的获得,为新型病毒药靶诊断标志物发现和功能研究提供了基础。