甜菜坏死黄脉病毒内蒙分离物RNA3序列分析及编码25kD蛋白基因在大肠杆菌中的表达

以甜菜坏死黄脉病毒（ＢＮＹＶＶ）内蒙分离物的总ＲＮＡ为模板,通过反转录－ＰＣＲ扩增获得ＢＮＹＶＶＲＮＡ３全长ｃＤＮＡ。将其克隆到ｐＧＥＭ－７Ｚｆ（＋）上,得到重组质粒ｐＧＢＹ５６。序列分析结果表明,内蒙分离物ＲＮＡ３基因组全长为１７７５ｎｔ,其中包含３个开放阅读框架,分别编码２５ｋＤ蛋白、４．６ｋＤ蛋白和一种由５９个氨基酸组成的Ｎ蛋白。与法国Ｆ２分离物、德国Ｇ１分离物和日本Ｓ分离物相比,其核苷酸序列的同源性分别为９６．４％、９６．８％和９７．３％。将２５ｋＤ蛋白编码基因克隆到ｐＪＷ２上,构建了该基因的原核表达载体。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ分析结果表明,２５ｋＤ蛋白基因在Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）中经温度（４２℃）诱导后,可特异地表达２５ｋＤ蛋白     

甜菜坏死黄脉病毒RNA4 cDNA克隆,序列分析及其编码蛋白基因在大肠…

以甜菜坏死黄脉病毒（ＢＮＹＶＶ）内蒙分离物（ＮＭ）ＲＮＡ为模板,通过反转录和ＰＣＲ扩增得到了ＢＮＹＶＶ ＲＮＡ４基因组的ｃＤＮＡ克隆ｐＧＢＦ６。序列分析结果表明,ｐＧＢＦ６含有全长ＲＮＡ４ ｃＤＮＡ插入片段,大小为１４６５个核苷酸,含有一个８４９个核苷酸的开放阅读框架,编码产生由２８２个氨基酸组成的分子量为３１ｋＤａ的蛋白。与法国Ｆ２分离物ＲＮＡ４相比,其核苷酸序列和由此推导的氨基酸序列同源性分别     

甜菜坏死黄脉病毒内蒙分离物自然缺失突变体缺失区域的定位分析

以甜菜坏死黄脉病毒内蒙分离物（ＢＮＹＶＶ ＮＭ）总ＲＮＡ为模板,经ＲＴ－ＰＣＲ扩增,分别获得ＲＮＡ２、ＲＮＡ３和ＲＮＡ４自然缺失突变体ｃＤＮＡ克隆。序列分析结果表明,ＲＮＡ２自然缺失突变体在７５ｋＤ通读蛋白编码区Ｃ端缺失３４８个核苷酸（缺失位置ｎｔ１４８８￣ｎｔ１８３５）。ＲＮＡ３在其２５ｋＤ蛋白编码区内缺失３６０个核苷酸（缺失位置ｎｔ７２９￣ｎｔ１０８８）。ＲＮＡ４的自然缺失区域位于３１ｋＤ蛋白     

雀麦花叶病毒缺陷型RNA_（3b）的研究

采用ＰＥＧ沉淀和差速离心的方法提纯雀麦花叶病毒的Ｇ和Ｔ分离物。利用蛋白酶Ｋ和两相酚法制备雀麦花叶病毒的总ＲＮＡｓ。将Ｇ和Ｔ分离物ＲＮＡｓ进行琼脂糖凝胶电泳,结果发现Ｂｒ－ＭＶ－Ｇ除含有正常的ＲＮＡ组分外,还出现了另一新的ＲＮＡ＿（３ｂ）组分,其分子量为０．５０×１０￣６。ＲＮＡ＿（３ｂ）只出现在大麦寄主中,而在昆诺基上缺失。ＲＮＡ＿（３ｂ）仅依靠于其来源的Ｇ分离物的ＲＮＡｓ进行复制。以ＲＮＡ＿（３ｂ）为模板合成￣（３２）Ｐ－ｃＤＮＡ探针,和ＢｒＭＶ－Ｇ分离物的ＲＮＡｓ进行分子杂交试验表明：ＲＮＡ＿（３ｂ）属ＲＮＡ＿３的缺陷型组分,它依赖于ＢｒＭＶ－Ｇ－ＲＮＡ＿３的帮助才能在大麦寄主中复制。ＲＮＡ＿（３ｂ）的出现和缺失对ＢｒＭＶ的症状表现没有影响。     

核酸酶保护试验在黄瓜花叶病毒株系鉴定中的初步应用

采用黄瓜花叶病毒（ＣＭＶ）亚组Ⅰ株系Ｆｎｙ－ＣＭＶＲＮＡ＿２的１２０９～１６２６核苷酸片段和亚组Ⅱ株系Ｌｓ－ＣＭＶＲＮＡ＿２的２００２～２４３３核苷酸片段的ｃＤＮＡ克隆,体外转录,同时掺入￣（３２）Ｐ获得负链ＲＮＡ探针,与纯化的番茄和甜椒上的ＣＭＶ中国分离物的ＲＮＡ杂交,结果表明：ＣＭＶ番茄和甜椒中国分离物与Ｆｎｙ－ＣＭＶ的核苷酸有高度同源性,隶属于Ｆｎｙ－ＣＭＶ为代表的亚组Ⅰ株系。并利用Ｋ－ＣＭＶ株系（亚组Ⅰ,源于中国）的ＲＮＡ＿２全长ｃＤＮＡ克隆的两个ＥｃｏＲＩ位点间的核苷酸序列（１６５７～２１２５ｎｔ）作探针,与上述两种ＣＭＶ中国分离物的ＲＮＡ杂交,进一步比较分析了这两个分离物和Ｋ－ＣＭＶ株系的关系。讨论了核酸酶保护法在ＣＭＶ株系鉴定中的作用。     

黄瓜花叶病毒山东株（CMV—SD）RNA2全和cDNA克隆的构建及全序列分析

分别利用５’ＲＡＣＥ和３’ＲＡＣＥ确定了ＣＭＶ－ＳＤＲＮＡ２的５’和３’未端序列,在此基础上,利用ＲＴ－ＰＣＲ得到了ＲＮＡ２的５’端一半的ｃＤＮＡＤＱ ＢＴＧ Ｐｃ２５和３’端一半的ｃＤＮＡ克隆ＰＣ２３,并通过拼接构建了ＲＮＡ２全长ｃＤＮＡ克隆ＰＣ２Ｆ。     

传染性法氏囊病病毒VP3结构蛋白基因在大肠杆菌中的高效表达

传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）是危害养鸡业的重要病原之一,属双股双节段ＲＮＡ病毒科成员,由Ａ和Ｂ两个片段的ｄｓＲＮＡ构成,大小分别约３３００－３４００ｂｐ和２８００－２９００ｂｐ。基因片段Ａ首先编码ＶＰ２－ＶＰ４－ＶＰ３聚合蛋白,然后再断裂成ＶＰ３、...     

鸡传染性支气管炎病毒免疫原基因cDNA的克隆和序列分析

从含有鸡传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）的鸡胚尿囊液中快速提取病毒ＲＮＡ,得到约２３ｋｂ全长ＩＢＶ ＲＮＡ。运用反转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）得到１．７２ｋｂ编码全长ＩＢＶ免疫原糖蛋白Ｓ１的基因片段。进一步将此基因片段插入到质粒ｐＵＣ１９中,进行全长片段的序列分析。结果表明,ＩＢＶ北京株和Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ株的核酸同源性为９７．８％,与Ｍ４１株的核酸同源性达９８．５％。     

乙型肝炎病人重叠感染丙型肝炎的评价

应用ＥＬＩＳＡ和ＰＣＲ法检测５０２例乙肝病人血清,４０１例ＨＢｓＡｇ阳性血清中,有１１４例（２８．４％）抗－ＨＣＶ和ＨＣＶＲＮＡ双项阳性,２５例（６．２％）ＨＣＶＲＮＡ单项阳性;２１例（５．２％）抗－ＨＣＶ单项阳性。将ＨＢｓＡｇ乙肝病人分成ＨＢＶＤＮＡ,ＨＢｅＡｇ阳性组和ＨＢＶＤＮＡ,ＨＢｅＡｇ阴性组。前者抗－ＨＣＶ阳性率为１１．６％～２０．５％,ＨＣＶＲＮＡ阳性率为１６．２％～２０．５％。后者抗－ＨＣＶ阳性率为２０．２％～５５．６％,ＨＣＶＲＮＡ阳性率为２３％～６０．３％。结果说明长期携带ＨＢＶ者和慢性乙肝病人均可重叠ＨＣＶ感染。ＨＢＶＤＮＡ阳性组抗－ＨＣＶ和ＨＣＶＲＮＡ阳性率明显高于ＨＢＶＤＮＡ阳性组     

用单克隆抗体作芜菁花叶病毒不同分离物外壳蛋白抗原结构的比较研究

用芜菁花叶病毒辽宁分离物（ＴｕＭＶ－ＬＮ）,山东分离物（ＴｕＭＶ－ＳＤ）和榨菜分离物（ＴｕＭＶ－ＺＣ）作抗原,分别免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠,经脾细胞与ＳＰ２／Ｏ－Ａｇ１４骨髓细胞融合,共获得７个单克隆抗体分泌细胞株,为研究３个分离物的抗原差异,用胰蛋白酶消化ＴｕＭＶ的外壳蛋白（ＣＰ）。分别形成４、２和１条降解带,经ＳＤＳ－１５％ＰＡＧＥ后,转移至硝酸纤维薄膜上,用３个分离物的抗血清和７种单隆抗体分别做     

真菌传杆状病毒组（Furovirus）内四种病毒的细胞病理学比较研究

本文研究丁真菌传杆状病毒组（Ｆｕｒｏｖｉｒｕｓ）四个病毒成员,即甜菜坏死黄脉病毒（ＢＮＹＶＶ）、甜菜土传病毒（ＢＳＢＶ）、花生丛生病毒印度株系（ＰＣＡ－Ｉ）以及非洲株系（ＰＣＡ－Ａ）和小麦土传花叶病毒（ＳＢＷＭＶ）所引起的细胞病理变化。这四种病毒在病毒粒子聚集的结构,是否引起细胞膜聚集及聚集的结构,过氧化物酶体泡状物的形成与否及结构均有差异。另外,同一种病毒的不同株系或分离物所引起的细胞病理变化也不相同。     

中国大麦黄花叶病毒分离物的分子变异

１３个供试的中国和英国大麦黄花叶病毒（ＢａＹＭＶ）分离物,经ＲＮＡ１和ＲＮＡ２全基因组不同区域ＤＮＡ片段背地里单构象多态分析（ＳＳＣＰ）,外壳蛋白基因和ＲＮＡ２ ７０ｋＤ基因５端７０５碱基序列分析,以及此７－５碱基ＤＮＡ片段限制性内切酶图谱分析结果,它们的ＲＮＡ１和ＲＮＡ２彼此无一相同,其中ＲＮＡ２变异比ＲＮＡ１更大。由于变异十分复杂,且没有规律性,因而当前通用的分子生物学技术尚不能简单地ＢａＹＭ     

传染性法氏囊病病毒中国强毒株节段cDNA基因的克隆和序列分析

以来自哈尔滨传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）强素株（Ｈａｒｂｉｎ 毒株,Ｈ）的基因组ＲＮＡ为模板,用反转录聚合酶链反应（ＲＰ－ＰＣＲ）的方法得到了其Ａ节段的全长ｃＤＮＡ片段,分５端（１６５９ｂｐ）和３端（１４４４ｂｐ）上下两段分别克隆到ｐＧＥＭＢ－Ｔ载体上,测定了其核苷酸顺序,在长为３１０１ｂｐ中含有两个阅读枢ＯＲＦ Ａ１和ＯＲＦ Ａ２,分别编码１０１２个氨酸酸的前体蛋白（ＶＰ２－４－３）和１４５个     

小双节RNA病毒中国株基因组第二节段的序列测定及分析

１９９７年从河北省一起成人腹泻暴发病人粪便中首次分离到小双节ＲＮＡ病毒（ｐｉｃｏｂｉｒｎａｖｉｒｕｓ,ＰＢＶ）中国株。为研究该病毒复制必需的依赖ＲＮＡ的ＲＮＡ多聚酶（ＲｄＲｐ）活性机理,采用改进的单引物扩增法克隆和测序了病毒基因组第二节段。结果表明：第二节段全长１６９６个核苷酸,只有一个ＯＲＦ,占全长的９３．９％,编码５３０个氨基酸残基的蛋白,５’－ＮＴＲ ＡＴ丰富（７５．４％）,可能是本位调控元     

药物对病毒感染培养心肌细胞Ca^2＋内流及CVB3—RNA复制的影响

应用放射性同位素＾４５Ｃａ＾２＋示踪技术及光敏生物素标记ｃＤＮＡ探针杂交方法,观察了维拉帕米、黄芪、地塞米松等药物对感染柯萨奇Ｂ３病毒（ＣＶＢ３）的大鼠培养心肌细胞Ｃａ＾２＋内流及细胞中ＣＶＢ３－ＲＮＡ复制的作用。结果发现：在病毒感染４８ｈ,上述三药均可显著减少感染细胞及正常对照的心肌Ｃａ＾２＋内流;若在病毒感染后即加入上药物,经４８ｈ培养后,黄芪组细胞中的ＣＶＢ３－ＲＮＡ含量显著少于病毒对照组,     

丙型肝炎病毒RNA打点杂交检测方法同RT－PCR方法的比较

采用ＨＣＶ基因组结构区Ｃ区ｃＤＮＡ探针和非结构区ＮＳ３－４区ｃＤＮＡ探针,建立了用打点杂交（ｄｏｔｂｌｏｔｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）检测血清中ＨＣＶＲＮＡ的方法,同采用ＨＣＶ基因组５’端非编码区的一对寡核苷酸引物通过逆转录－聚合酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）检测血清中ＨＣＶＲＮＡ的方法相比较,发现两种方法都能快速早期和特异地检出血清中ＨＣＶＲＮＡ,但ＲＴ－ＰＣＲ法敏感性优于ＲＮＡ打点杂交法。对于无血清学指标的慢性ＮＡＮＢ肝炎病人的诊断,可采用这两种方法。这两种方法的敏感性在很大程度上依赖于引物和探针的敏感性,以及ＲＮＡ提取方法。ＲＴ－ＰＣＲ法适用于诊断病毒血症和复制,打点杂交法适用于研究ＨＣＶＲＮＡ量的变化,对治疗的评价,以及为实验筛选较高滴度的ＨＣＶＲＮＡ阳性样本。     

一种中国发生的真菌传小麦花叶病毒RNA－13＇末端核苷酸序列分析

以采自河南的真菌传小麦花叶病毒（ＦＷＭＶ－Ｃ）为材料,抽提病毒ＲＮＡ,合成互补ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）。对杂交筛选所得ｃＤＮＡ克隆进行亚克隆及序列分析,结果表明,亚克隆ｐＧＳＩ含有一个长度为８９１个核苷酸的不完整开放阅读框架（ＯＲＦ）和长度为２５８个核苷酸的３＇末端非编码区（ＮＴＲ）,并带有Ｐｏｌｙ（Ａ）尾序。此段序列与大麦黄花叶病毒（ＢａＹＭＶ）及法国报道的一种小麦梭条花叶病毒（ＷＳＳＭＶ－Ｆ）的ＲＮＡ－１３＇末端分别具有６７．６％和６９．９％的同源性。由所测序列编码区（１－８９１ｎｔ）可推导产生２９６个氢基酸,并与ＷＳＳＭＶ－Ｆ及ＢａＹＭＶ外壳蛋白氨基酸序列分别具有７５．９％和７１％的同源性。此结果表明,ＦＷＭＶ－Ｃ为另外一种不同于ＷＳＳＭＶ－Ｆ的大麦黄花叶病毒组（Ｂａｙｍｏｖｉｒｕｓ）病毒,所测基因组片段应为ＲＮＡ－１３＇末端序列,其中可能包括了病毒全长外壳蛋白编码区域。     

丙型肝炎病毒PNA打点杂交检测方法同RT—PCR方法的比较

采用ＨＣＶ基因组结构区Ｃ区ｃＤＮＡ探针和非结构区ＮＳ３－４区ｃＤＮＡ探针,建立了用打点杂交检测血清中ＨＣＶ ＲＮＡ的方法,同采用ＨＣＶ基因组５＇端非编码区的一对寡核苷酸引物通过逆转录－聚合酶链式反应检测血清中ＨＣＶ ＲＮＡ折方法相比较,发现两种方法都能快速早期和特异的检出血清中ＨＣＶ ＲＮＡ,但ＲＴ－ＰＣＲ法敏感性优于ＲＮＡ打点杂交法。对于无血清学指标的慢性ＮＡＮＢ肝炎病人的诊断,可采用这两种方法     

乙脑病毒全长cDNA的扩增克隆及体外转录制备感染性RNA的研究

本研究根据已知的乙脑病毒（ＪＥＶ）ＳＡ１４株基因序列设计一套引物,利用长模板ＲＴ－ＰＣＲ技术,一次扩增出了ＪＥＶ的全长ｃＤＮＡ,并采用大片段克隆技术将其克隆于载体的ＲＮＡ聚合酶启动子下游。阳性克隆转录的ＲＮＡ转染ＨＢＫ细胞后细胞产生病变,经乳鼠脑内接种及特异性免疫荧光染色证明为ＪＥＶ,这一结果表明ＪＥＶ感染性克隆的构建获得了成功。其次,合成一条含有ＲＮＡ聚合酶启动子序列的５′引物,利用长模板ＲＴ－     

乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒的同步PCR扩增

介绍了一种从人血清中同步扩增和检测ＨＢＶ－ＤＮＡ和ＨＣＶ－ＲＮＡ的方法。ＨＣＶ－ＲＮＡ反转录成ｃＤＮＡ,这种ｃＤＮＡ和从ＨＢＶ中抽提出的ＤＮＡ一起,用根据ＨＢＶ、ＨＣＶ保守区序列设计的特异引物进行同步ＰＣＲ扩增,这种方法对于检测ＨＢＶ和ＨＣＶ重复感染很有用处