乳酸克鲁维酵母β－半乳糖苷酶的分离纯化及性质研究

乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)经高压破壁后的粗提液,其β-半乳糖苷酶(E．C．3．2．1．23)比活力为5．56u／mg。经硫酸铵沉淀,丙酮沉淀,PAPMA—Sepharose 4B柱层析后,乳糖酶比活力达370u／mg,纯化了66．2倍,SDS—PAGE鉴定为一条带,分子量85000Da。酶作用的最适pH在6．4—6．8之间,最适温度40℃,50℃保温15min酶活丧失90％。以邻硝基苯一β一半乳糖苷(ONPG)为底物的米氏常数为2．78mmoI／L。酶的正常水解产物半乳糖对酶活力有一定的抑制作用,核糖强烈抑制酶活力,Fe²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺、Ag⁺、PCMB和NBS都能使酶活丧失。Mg²⁺、Mn²⁺和还原剂巯基乙醇的存在能提高酶活力。     

用构建的新型BmNPV载体在家蚕高效表达人β-干扰素

构建了家蚕核多角体病毒(Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus,BmNPV)新型载体pBm92,该载体将多角体蛋白基因的起始密码ATG改变为ATT,然后在多角体蛋白基因的+12位后连接有5个外源基因的克隆位点。将HulFN-β基因克隆在多角体蛋白基因的+12位后,构建了pBmIFN+12;同时构建了HuIFN－β克隆在－3位后的转移载体pB．mIFN－3。将两种转移载体DNA分别与BmNPV基因组DNA共转染Bm—N细胞。利用重组病毒不产生多角体蛋白的特征,筛选重组病毒。用HuIFN－β基因探针与重组病毒DNA进行杂交鉴定。重组病毒BmIFN+12感染Bm-N细胞,其上清IFN活性为2．0×10⁶Iu／ml,将BmIFN+12注射5龄家蚕虫体,表达水平为5．O×10⁷Iu／ml,是HulFN-β基因克隆在多角体蛋白基因的-3位后获得的重组病毒表达量的2—4倍。构建的新型BmNPv载体能够在家蚕高效地表达HuIFN-β。家蚕虫体生产的rHulFN-β蛋白具有天然HuIFN-β的抗原性。     

人α型肿瘤坏死因子基因在昆虫细胞中的表达

将人肿瘤坏死因子α(Tumoor Necrosis Factor α,TNF-α)cDNA片段克隆到转移载体pat610上．然后与苜蓿尺蠖核型多角体病毒(Autogropha californica Nuclear PolyhedrinVirus,AcNPV)DNA共转染草地贪夜蛾细胞(Sptodoplet frugiperda)Sf21,获得含hTNF-a基因的重组病毒。以L929细胞毒方法测得重组病毒感染Sf21细胞72小时时的表达量最高,为1．0×10^-4u／lO 6细胞;同时,培养液中小牛血清浓度对hTNF－α表达量有较大影响,当浓度为6%时hTNF—α表达量最高．感染72小时表达量可达5．2×10⁴u／1O⁶细胞,ELISA实验结果证明其产物确为hTNF—α。     

重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子包涵体提取、复性和纯化的研究

由基因工程大肠杆菌表达的重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM—CSF)以包涵体的形式存在于细胞中,通过破菌、洗涤获得包涵体．再经过溶解、凝胶过滤、复性、疏水和离子交换柱层析得到了均一的产品,经高压液相和SDSPAGE电泳测定纯度均大于98％,rhGM—CSF的比活为3．2×10⁷IU／mg,纯化获得的rhGM—CSF为一酸性蛋白,等电点约为5．2,NH₂-末端前20个氪基酸序列测定结果与文献报道一致。rbGM—CSF的NH2-末端不均一．其中带Met的分子约占59．5％,第一个氨基酸为Ala的分子约占24．6％,为Pfo的分子约占14．6％。纯化过程中蛋白的纯化倍数为3．9,生物活性总得率为69．1％,工艺重复性好,易放大。     

改造稀有密码子提高SEA蛋白表达量

利用重叠PCR技术突变了sea基因上一个稀有密码子簇,将此段中稀有密码子全部更换成E.coli最常用密码子,得到sea^m。将sea和sea^m分别克隆于7ZTS表达载体上,并转化JM109（DE3）菌株。结果表明,sea基因的表达十分微弱,而sea^m基因的表达量十分高,约占菌体总蛋白的15 ％。表达产物在体内具有一定的抗肿瘤活性。     

芽孢杆菌高表达质粒的构建及其性质的研究

以B.subtilis质粒pUB110为基础构建了双标记(Km²、cm²),多酶切点接头的表达质粒pNQl22和pNQll3系列。pNQl22的分子量为3．2×10⁶道尔顿,其对cm抗性水平和cat-86基因表达水平与质粒pPL600相同,pNQll3系列质粒分子量为3．1—4．1×10。道尔顿。其对cm抗性水平高于质粒pPL600,它们所携带的cat-86基因的表达水平无论在非诱导和诱导条件下部比pPL600高约5倍。无分解代谢阻遏现象,传代稳定,因而可以用作Bacillus属基因工程的载体。     

葡萄糖氧化酶产生菌Z—l—C的分批发酵与恒化培养

本文对葡萄糖氧化酶产生菌z—I—c的分批发酵与恒化培养进行了研究。实验发现,在以葡萄糖为生长限制性基质的恒化培养中,该产生菌的维持系数为O．04 g葡萄糖／g菌体．H,生长得率系数Y^max_G=O．714 g菌体／g葡萄糖,最大比生长速率μmax=O．385h^-1,饱和常数Ks=4．76g/L,理论最适稀释度Dm=0．260h^-1,最大酶比活(E／x)max为2．16×10³μ／mg,其值较分批发酵的最大酶比活(1．5l×10³μ／mg)提高43％。当向恒化培养的补料培养基中添加0．02％的α-甲基-D-葡萄糖时,由于该葡萄糖结构类似物的诱导作用,可使(E／x)max达3．11×10³μ／mg,较分批发酵之值提高106％。     

放线菌种间原生质体电融合育种

以龟裂链霉菌(S．Rimosus,Otc^r,Sm ^s)和灰色链霉菌(S．Griseus,Sm^r,Otc^s)为原始出发菌株,经NTG诱变处理,获得前者(Asp^-)和后者(cys^-)营养缺陷型突变株,制成10⁹个／m1等量原生质体混合液,在岛津细胞融合装置SSH—C¹¹融合槽(电极间距为0．5mm)内,以频率lMHz、强度800V／cm的高频交流电场作电介质,电泳15s形成原生质体珠串,旋即施加电场强度6 kV／cm、短时程20μs的直流高压方形电脉冲触发原生质体融合,在R₃再生培养基上选取34971个菌落,移植于双抗基本培养基,检出四个双抗原养型融合子。它们具有亲株的优良生物学特性,生长速度较快,产素能力大,抗菌活性高。生物显影结果表明,它还产生两个亲株所不具有的抗菌活性物质。     

异源nifAC对根癌土壤杆菌nif基因表达的调节作用

三亲交配方法分别将载有褐球固氮菌(Azotobacter chroococcum)呈组成型表达的nifAC的质粒pCK5和肺炎克氏杆菌(Kldosiella pneumoniae)含有nifAc和nifA—ntrc基因的质粒pcK3．pSZ36和pSZ23-CA导入根癌土壤杆菌Agrobacterium tumefaciem)C58／pGV3850,所得转移接合子的生长速率和野生型相似。在10mmol／L,NH₄⁺浓度下,Western blotting测出A．Tumefaciens C58／pGV3850(pCK5)有固氮酶合成,乙炔还原法测定固氮酶活性恢复分别为73％．24％,11％和62％。这些结果表明,褐球固氨菌和肺炎克氏杆菌的固氮调节基因对土壤杆菌同氮基因表达有调节作用。其中．褐球固氮菌nifAc的调节功能最强(73％),其次是肺炎克氏杆菌nifA和nrrC的融合子(62％),肺炎克氏杆菌nifAc的调节功能较弱(24％。11％)。     

植酸酶phyAm基因结构延伸突变改善酶的热稳定性

将来源于黑曲霉N25的植酸酶基因phyA^m重组于大肠杆菌表达载体pET30b(+),以重组表达载体pET30b-F-phyA^m为模板经PCR扩增获得结构延伸突变植酸酶基因phyA^e（在植酸酶基因C端增加了来源于pET-30b-F-phyA^m载体上13氨基酸残基）。含突变基因的重组表达载体pPIC9k-phyA^e在GS115酵母中表达。纯化的突变酶PP-NP-e与野生型酶PP-NP-m8相比：PP-NPAe的最适反应温度上升了3℃,75℃处理10min,热稳定性提高21%,比活力略有提高。最适反应pH为5.6,有效pH范围pH4.6到pH6.6。比未突变酶扩大了0.4单位。     

芽孢杆菌M_(50)产生β甘露聚糖酶的条件研究

从土壤中分离到９ 株产生β甘露聚糖酶的芽孢杆菌（ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ ．） 。Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ ． Ｍ５０２５０ｍ Ｌ三角瓶摇瓶培养试验,以４ ％ 的魔芋粉为碳源,１－０ ％ （ ＮＨ４）２ＳＯ４ 为氮源,０－３５ ％Ｎａ２ＣＯ３ ,３０ ～３４ ℃培养６０ｈ 产酶达到高峰。酶活力为１８０ ～２００ｕ／ｍ Ｌ。１００Ｌ 罐发酵,在３０ ～３２ ℃,１∶０ ．７５ｖｖｍ 通气量,２００ｒ／ｍｉｎ 条件下,发酵液酶活力高达３３０ｕ／ｍ Ｌ。酶的最适反应温度和ｐＨ 分别为５０ ℃和６－０ ,低于５０ ℃,ｐＨ５ ．０ ～７ ．０ 酶稳定。Ｆｅ^３＋ 、Ａｌ^３＋ 、ＥＤＴＡ、Ｈｇ^２＋ 对酶有抑制作用,而Ｂａ^２＋ 、Ｍｎ^２＋ 对酶有激活作用。发酵粗酶液对苎麻精干麻精练,显示对精干麻的半纤维素残胶具有降解作用。     

人尿激酶原全长cDNA在中国仓鼠卵巢细胞中的稳定表达

通过磷酸钙共沉淀技术,将含有尿激酶原cDNA的表达载体(pSV₂-PrUK)与含有二氢叶酸还原酶基因的表达质粒pSV2-dhfr-或MMTV—dhfr共转染中国仓鼠卵巢细胞二氢叶酸还原酶基因缺陷株(CHO-dhfr^-)。利用选择培养基选择出二氧叶酸还原酶基因表达阳性(dhfr⁺)的转化细胞灶。用溶解圈法测定尿激酶型纤溶酶原激活剂(u—PA)的生物活性,其中两株显著高于其他株细胞,命名为CLF-14和CLF-8,表达水平依次为24Iu／10⁶细胞／48h,16Iu／10⁶细胞／48h。用ELLSA测定CLF一14和cLF-8细胞上清,表现为强阳性,阳性值比阴性对照值(P／N)大于10,CLF-14和CLF-8细胞表达量分别为0．14-o．22μg／10⁶细胞／48h和0．08-O．14μg／10⁶细胞／48h。分泌产物能被抗尿激酶(UK)血清抑制,而不被抗组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)的抗血清和正常兔血清抑制。     

葡萄糖的添加对昆虫细胞Sf21悬浮生长的影响

添加葡萄糖对昆虫细胞Sf21(Spodoptera frugiperda)悬浮生长的影响,发现补加糖量在lg／L时·能明显提高细胞生长的速度和最高密度,细胞最高密度由2．5×10⁴／ml增加到4.9×10⁶／ml; 朴加糖量在2g／L时,则有显著的抑制作用,即使增加接种密度．细胞生长的最高密度也只有2．1×10⁶／ml。当采取流加葡萄糖方法来培养细胞时,则其生长的最大密度可提高到5．2×10⁶／ml。     

水稻抗稻瘟病基因Pi-d(t)1、Pi-b、Pi-ta2的聚合及分子标记选择

冈46B(G46B)是水稻生产应用中的一个农艺性状十分优良的保持系 ,其主要的缺陷是稻瘟病抗性较弱 ,通过对地谷 ,BL-1,Pi-4号等三个分别含抗病基因Pi-d(t)¹、Pi-b、Pi-ta² 的稻瘟病抗性材料与G4-6B聚合杂交 ,并利用抗病基因连锁的分子标记对杂交后代进行辅助选择 ,在聚合杂交的F2代及B1C1代群体中共获得了 15株含Pi-d(t)¹ 、Pi-b、Pi-ta² 等三个抗稻瘟病基因的材料 ,其可能的基因型分别为 :三基因杂合体Pi-d(t)¹ pi-d(t)¹ Pi-bpi-b-Pi-ta² pi-ta²4株 ,双基因杂合体 10株 ,其中Pi-d(t)¹ Pi-d(t)¹ Pi-bpi-b-Pi-ta² pi-ta²6株 ,Pi-d(t)¹ pi-d(t)¹ Pi-bpi-b-Pi-ta² Pi-ta² 3株 ,Pi-d(t)¹ pi-d(t)¹ Pi-bPi-b-Pi-ta² pi-ta² 1株 ,双基因纯合体Pi-d(t)¹ Pi-d(t)¹ Pi-bpi-b-Pi-ta² Pi-ta²仅1株 ,这一研究结果为进一步改良G46B的稻瘟病搞性奠定了基础,同时这一研究结果表明利用分子标记可快速、有效地实现多个抗病基因的聚合,大大提高水稻抗病育种的效率。     

高活性反硝化颗粒污泥的研究

以上流式厌氧污泥床（ＵＡＳＢ）反应器中的反硝化颗粒污泥为样品,研究了颗粒污泥的基本特性。测定出颗粒污泥中的优势无机元素为Ｃａ、Ｐ．颗粒表面以球菌和短杆菌为主。反硝化菌是颗拉中的优势菌群,数量可达６．５ｘ１０^８－１．５ｘ１０^１０个／ｍｌ颗粒污泥。初步鉴定了两株脱氮菌Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．ｓｔｒａｉｎＮ_１和ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａｓｔｒａｉｎＮ_２．     

枯草杆菌中性蛋白酶基因在大肠杆菌中的表达

蛋白酶是枯草杆菌(Bacillus subtilis)产生的具有重要工业价值的水解酶。对蛋白酶基因的分离与高效率表达一直是基因工程研究领域的重要内容之一^[1-4]。蛋白酶基因的筛选可采用不同的方法,如“免疫法”、“DNA 杂交法”、“遗传互补法”等。大肠杆菌(Escherichia coli)是基因工程中最常用的宿主菌, 若能以E．Coli作为筛选蛋白酶基因的宿主苗,那么使用E．Coli的常规载体,便可直接获得完整的蛋白 酶基因。枯草杆菌的蛋白酶基因能否在大肠杆菌中表达．则是实现这一目标的关键。Koide等人^[5]报道过枯草杆菌的胞内丝氨酸蛋白酶基因在大肠杆菌中的表达。转化细胞在含有脱脂牛奶的平板上可产生十分微弱的水解圈。Ikeraara等人^[6]将Subtilisin E(枯草杆菌蛋白酶E)插人大肠杆菌的表达载体,具有活性的Subtilisin E便可分泌到大肠杆菌的细胞周质中。吴汝平撰文指出^[7]。克隆的枯草杆菌蛋白酶基因不能在大肠杆菌中表达。是因为大肠杆菌不能转录枯草杆菌的促使生长调节基因。Wang等人^[8]则认为,在大肠杆菌中观察不到野生型的中性蛋白酶基因E(nprE)的表达。是因为nprE的表达产物对大肠杆菌有致死作用．除去该基因上的核糖体结合位点,nprE便能在大肠杆菌中低水平表达,并能将表达产 物分泌至胞外。由上可知．枯草杆菌的蛋白酶基因能否在大肠杆菌中表达以及表达的位置仍然是一个众说纷纭的问题,这一问题也正是能否用大肠杆菌作为宿主菌筛选蛋白酶基因的关键。     

D-氨基酸氧化酶在不同毕赤酵母宿主菌中的表达比较

D-氨基酸氧化酶（DAAO）在转化头孢菌素C生产7-ACA和转化DL-氨基酸制备α-酮酸和L-氨基酸上起着重要的作用。采用DNA操作技术,将来源于三角酵母的DAAO基因连接至表达载体pPIC35K上,再将表达质粒pPIC35KDAAO分别整合P. pastoris的宿主细胞KM71和GS115,经筛选获得阳性重组菌PDK13（Mut^S）和PD27（Mut⁺）。重点对两种突变菌的表达条件进行了比较。结果显示：PDK13（Mut^S）株比PD27（Mut⁺）株消耗甲醇慢、诱导时间长,但对通气量要求低、表达水平高,摇瓶活力分别达到2700和2500 IU/L,14L发酵罐内活力分别达到10140和8463 IU/L。初步探索了DAAO对DL-苯丙氨酸的拆分,结果显示基因工程菌表达的DAAO具有良好的转化DL-苯丙氨酸制备苯丙酮酸和L-苯丙氨酸的能力。     

喷射自吸管式生化反应器研究

本文研究了喷射自吸管式生化反应器的吸气及所液传质特性,提出了吸气量(Qs)和容积氧传递系数(kLa)的数学表达式：Qg=5.2×10^-2W^0.144_cLR^0.079_cD(L-D)^0.328D²_nPoπ——P^o_gTo[(D-Dn)²-1](Pn-Pl)-1)(Kla)₁=0.999(W-V)^0.38V^0.90_sg(L-D)^-0.16(Kla)2=1.003(W-V)^0.71V^0.28_sg(L-D)^-0.32(加C圈)反应器的具优工况为：L/D=320-400,D/D=2.7—3。8,Pn=5—13×10⁴N/m²。Kla最高达4280h^-1,比能耗为0.72—2.16×10³kJ/kgO₂用于培养饲料酵母,酵母浓度达40.04kg/m³.最大生长速率为6.24kg/m³·h,比能耗为1.66—2.52×10³KJ/kg DBM.空气利用率为10—20%.是一般生化反应器的2—4倍。     

人β神经生长因子在大肠杆菌中的高表达

将编码人β神经生长因子(Huβ-HGF)的基因克隆到由T7噬菌体启动子控制的pET11c大肠杆菌表达载体中,重组质粒经鉴定含有Huβ-NGF基因,未解聚的表达产物经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),结果显示出二聚体27kD的蛋白带。而完全解聚的表达产物SDS-PAGE显示出一条13β5kD单体带。经凝胶电泳扫描,表达带占菌体总蛋白的14.5％。用兔抗鼠β—NGF的多克隆抗体进行的Western-Blot的结果表明,二聚体同单体都有免疫原性。在生物活性的鉴定中,菌体表达产物可以使小鸡鸡胚的背根神经节产生神经元突起,由此可以证明该表达产物有较高的生物活性。     

微生物传感器测定维生素B12的研究

将大肠杆菌(Escherichia coli)215用吸附法固定于醋酸纤维素膜上,与氧电极配合组成微生物电极,建立了对维生紊B₁₂的快速测定系统。测定浓度范围5×10^-6mg—2．5×10^-5mg／ml;测定温度范围在28—39℃;最适Ph为6．7—7．8,测定一个样品所需时间为2h,比常用的生物学测定方法所需时间缩短10倍以上。该系统对维生素B₁₂重复测定的相对误差为±3％。固定化菌体在－25℃保存25天后再进行测定,应答电流不低于初始值的92%。