几种固氮菌nifA基因片段的同源性分析

参照已知数种固氮菌nifA基因的DNA序列,选择其中间区域的两个保守性较强的序列合成引物,利用肺炎克匠杆菌(Klebsiella pneumoniaef)、棕色固氮菌(Azotobacter vinela-ndii)、巴西固氮螺菌(Azospirllum brasilense)、草螺菌(Herbaspirillum seropedicae)和深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)的总DNA进行聚合酶链反应,结果均扩增出约450bp大小的片段,经证实为各种固氮菌的nifA基因部分片段。 核酸印迹分子杂交结果显示出nifA基因在不同固氮菌中的同源性不强。     

肺炎克氏杆菌的nifA基因产物在巴西固氮螺菌中的功效

通过三亲本杂交将质粒pCK3{携带改变了启动子的肺炎克氏杆菌(Klebsiella pneuma-niae)nifA 基因]引入巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)Yu62菌株中,由此获得的转移接合子巴西固氮螺菌Yu62-4菌株在6．0 mmol/L以上NH+4浓度下,能表现出微弱的固氮酶活性(相当于无NH+4时活性的0．3-0．5％),而野生型Yu62则全部丧失固氮酶活性。固氯酶的丙烯酰胺凝胶电泳和铁蛋白的免疫杂交实验表明,转移接合子Yu62-4在高NH+4(50mmol／L)下,虽有铁蛋白合成,但合成量比无NH+4时少得多,而且有一部分铁蛋白未被共价修饰;野生型菌株Yu62在此NH+4浓度下无铁蛋白合成。实验结果表明：外源(来自肺炎克氏杆菌)的基因产物在巴西固氮螺菌Yu62中不能有效地解除NH+4对该菌固氮酶合成的阻遏作用。本文分析了出现这种现象的原因。     

肺炎克氏杆菌nifA基因在巴西固氮螺菌固氮基因表达的铵调节中的作用

固氯螺菌(Azospirillum)是一类仅在限铵和微好氧条件下固氮的微生物,它可与许多禾本科作物联合共生⑴,具有较大的应用潜力。铵作为固氮作用的调节信号,在固氮螺菌的实际应用中是首要的限制因素。在固氯螺菌中,铵不但具有与肺炎克氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)相似的阻遏固氮酶合成的作用,而且还对已合成的固氮酶进行活性调节⑵。研究表明,其固氮酶翻译后活性调节的机制类似于深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)⑶,即在有铵条件下其固氮酶铁蛋白的一个亚基被共价修饰而丧失活性,这一过程是可逆的。由于铵在固氮螺菌中双水平地调节固氮作用,使得在野生菌株中研究其固氮基因表达水平上的调节较为困难。Zhang等⑷利用区域定位诱变技术获得了巴西固氮螺菌Sp7（A．Brasilense Sp7)的draT-突变株,在该突变株中铵不再影响固氮酶的活性,这为其固氮基因表达调节的研究提供了一个良好的材料。本文将组成型表达的肺炎克氏杆菌nifA基围引入该突变株中,通过分析讨论铵对巴西固氮螺菌固氮基固表达的调节作用方式。     

生物固氮

961447 肺炎克氏杆菌nifA基因在巴西固氮螺菌固氮基因表达的铵调节中的作用[中]/何路红…//生物工程学报.-1995,11(4).-385～388 按三亲交配法将pCK3转入巴西固氮螺菌UB3     

耐热酵母与酿酒酵母原生质体融合的研究

酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)396是利用甘蔗糖蜜生产酒精的生产菌株,假丝酵母(Candida sp·)C₆是我们从云南温泉底泥中筛选到的一株能在45℃生长良好的耐热酵母,我们应用原生质体融合技术进行了两菌株属间融合的研究。通过亚硝基胍(NTG)诱变得到的营养缺陷型菌株396(arg^－)和C6(lys^-),其融合频率为O．91×10^-5。从检出的融合子中挑选6株进行考核、其细胞体积平均为亲株的1．3倍,DNA含量平均为亲株的1．6倍,培养特征、形态、大小和生理生化特征表现不一,特别是糖类的同化试验。除F₂、F₁₄外,其他4株可以排除异核体形成的可能性。比较了在28℃,40℃和45℃培养条件下出发亲株396、C₆、直接亲株396(arg^-)C₆(lys^-)和融合子F₁、F₇、F₁₂,F₁₃的生长曲线、基质利用率和乙醇产率等,得到一株在40℃培养条件下糖的利用率为94．3％、乙醇产量为59．7g／L的属间融合株F₁₃。     

一个圆褐固氮菌的转导系统

分离了圆褐固氮菌(Azotobacter chroococcus)无荚膜变异株Aw的营养缺陷突变株和不固氮突变株以及Aw的噬菌体。以Aw菌株为给体,Aw的各种突变株为受体,通过噬菌体转导,证明圆褐固氮菌噬菌体AC-5.1是一株普遍性转导噬菌体。通过AC一5.1的转导,这些突变株都能成为原养型并恢复固氮能力。     

放线菌种间原生质体电融合育种

以龟裂链霉菌(S．Rimosus,Otc^r,Sm ^s)和灰色链霉菌(S．Griseus,Sm^r,Otc^s)为原始出发菌株,经NTG诱变处理,获得前者(Asp^-)和后者(cys^-)营养缺陷型突变株,制成10⁹个／m1等量原生质体混合液,在岛津细胞融合装置SSH—C¹¹融合槽(电极间距为0．5mm)内,以频率lMHz、强度800V／cm的高频交流电场作电介质,电泳15s形成原生质体珠串,旋即施加电场强度6 kV／cm、短时程20μs的直流高压方形电脉冲触发原生质体融合,在R₃再生培养基上选取34971个菌落,移植于双抗基本培养基,检出四个双抗原养型融合子。它们具有亲株的优良生物学特性,生长速度较快,产素能力大,抗菌活性高。生物显影结果表明,它还产生两个亲株所不具有的抗菌活性物质。     

微生物发酵生产十一烷1，1 1二羧酸的研究

从热带假丝酵母(Candiada tropicalis)T25—14经过紫外线和亚硝酸的多次诱变,获得4株产十一烷l,11二羧酸(DC₁₃)较多的突变株,其中最优的NP-159株以20％(V／V)正十三烷(nC₁₃)为碳源摇瓶发酵4天,DC₁₃达80g／L左右。在16L罐上,以30％(V／V)nC₁₃发酵6天,DC₁₃高达139g／L,回收残烃后,对nC₁₃的转化率为80％以上。后处理收率为78．9％,DC₁₃的纯度为95．3％。     

安徽虫瘟霉对桃蚜的生物测定与时间一剂量效应分析*

用“孢子浴”法将人工培养的安徽虫瘟霉(Zoophthora anhuiensis)对桃蚜(Myzuspersicae)接种而进行定量生物测定(18℃,光周期为L：D 12：12),包括10个剂量(1．5～197．7个分生孢子／mm²),每剂量处理蚜虫64～120头,逐日观察记载死亡数至第7d。接种后第3d在高剂量处理中始见少量死蚜,第4～6d为死蚜盛期。所获数据很好地拟合时间一剂量一死亡率模型,由模型参数估计出该菌作用于桃蚜的时间效应随剂量增大而减小,在37.1～197.7个分生孢子／mm² 的剂量范围内LT₅₀值为4.5～6.7d．剂量效应在接种后随时间递减,第5～7d的LD₅₀分别为86.8、43.7和34.1个分生孢子／mm²。结果表明,安徽虫瘟霉是一种较为理想的杀蚜微生物,在寄主体内的潜伏期为4～5d。     

微生物传感器测定维生素B12的研究

将大肠杆菌(Escherichia coli)215用吸附法固定于醋酸纤维素膜上,与氧电极配合组成微生物电极,建立了对维生紊B₁₂的快速测定系统。测定浓度范围5×10^-6mg—2．5×10^-5mg／ml;测定温度范围在28—39℃;最适Ph为6．7—7．8,测定一个样品所需时间为2h,比常用的生物学测定方法所需时间缩短10倍以上。该系统对维生素B₁₂重复测定的相对误差为±3％。固定化菌体在－25℃保存25天后再进行测定,应答电流不低于初始值的92%。     

转化三硝基甲苯(a-TNT)的细菌及其应用

从长期被TNT粉尘及废水污染的土壤及生活污永中,分离筛选出93株好氧、厌氧及兼性好氧细菌。它们能将浓度为100一130毫克／升的TNT 90％以上转化。其中部分菌株能利用TNT作为生长的唯一碳源和氮源。我们对47株好氧及兼性好氧细菌进行了鉴定,分别属于柠檬杆菌属(Citrobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、肠杆菌属(Enterobacter)、克氏杆菌属(Klebsiella)、埃希氏杆菌属(Escherichia)和假单胞葭属(Pseudomon~)。各属选一代表菌株进行培养试验,考察它们转化TNT的生理条件及转化rNT的速度。从其中选出10株菌应用于TNT废水生化处理小型试验,取得较好效果。出水的TNT、BOD、COD等项指标均低于国家的排放标准。     

摇瓶的体积氧传递系数和氧通透率的测定

通过设计特殊摇瓶,用亚硫酸钠法测出摇瓶的体积氧传递系数和氧透过纱布层的通透率。以氧电极测其内外氧的分压降后,可以算出摇瓶表观体积氧传递系数(k_La)app及真实体积氧传递系数k_La,并进一步求出氧通透率。由实验得出：氧分压降低6．1％,氧传递系数增加一倍;在37c、220r／min、500m1摇瓶(内盛液50m1)8层纱布的氧通透率Pm=43．7moI／m²·h·arm;并且关联出摇瓶容积V、装液量VL、转速n、摄氏温度t之间的模型式：(k_La)_app=1．84×10^-7[t]1.8479·[n]2.3906.(VLV]-0.6360(kLa)=2．02×10^-7[t]1.8525·[n]2.39441·[VLV]-0.6370     

食用真菌核荧光染色技术的研究

本文报道荧光染料双苯并咪唑Hoechst 33258(bisbenzimlde),应用于香菇(Lentinusedodes)、平菇(pleurotus ostreatus)、金针菇 (Flammulina velutipes)、木耳(vAurtculariaaurieula),毛木耳(A．Polytricha)等5种食用菌菌丝体。担孢子、分生孢子核的荧光染色研究。配制染液的Mcllvaine缓冲液pH值、缓冲液含0.6M MgSO₄·7H₂O、菌丝生长期、孢予贮存期亦与染色效果密切相关。我们观察到,使用插片法,爬片2／5的菌丝体,pH7.0一7.4 Hoechst 33258染液,染色3分钟为菌丝体核荧光染色的最佳效果。新鲜的担孢子,分生孢子、使用pH 6.8含0.6 M MgSO₄·7 H₂O Hoechst 33258染色液染色3分钟比使用pH 6.8 Hoechst 33258的染液有明显增效作用。     

真菌-氧化氮还原酶细胞色素P-450nor 2 cDNA序列的测定

在真菌的反硝化作用中,一种细胞色素P-450起着一氧化氮还原酶的作用,被称为细胞色素P-450nor^[1]。最近的研究发现：真菌细胞色素P-450nor有三种类型。除了缣孢菌(Fusarium oxysporum)P+450nor(即F．P-450nor)外。还有两种存在于柱孢菌(Cylindrocarpon tonkinense)．即C. P-450norl和2^[2]。 F．P-450nox和C．P-450norl能以NADH为直接的电子供体,使NO还原生成N₂O。C. P-450nor2不仅能直接利用NADH。而且能直接利用NADPH．还原NO生成N₂O。F. P-450nor基因已被克隆和测序^[3-4]。本文测定了C．P-450nor2的eDNA编码区全序列,3’非编码区部分序列和5’引导序列。     

水稻基因文库的构建

本文以λ系列EMBL4DNA作载体,在国内条件下建成了水稻(Oryza sativa)“Mudgo”褐稻虱抗性品种(λMBL4／OSM(Bam-Sau3A)]和“南粳15”水稻白叶枯病抗性品种[λ—EMBL4/OSNG15(Bam-Sau3A]的两个基因文库。所得重组子值分别为1．6×10⁶pfu和9．6×10⁶pfu,均超过了建库要求的理论值。     

枯草芽孢杆菌B115优化培养及其对气单胞菌的抗菌效果的研究*

采用正交实验设计确定了枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B115的基础培养基成份为:胰蛋白胨1%,酵母膏0.25%,氯化钠0.5%;添加成份最优组合为(NH₄)₂SO₄0.1%,(K₂HPO₄+KH₂PO₄)(1.4+0.6)%和柠檬酸三钠0.1%;添加成分最优组合与基础培养基培养产量比较,表明添加K⁺     

喷射自吸管式生化反应器研究

本文研究了喷射自吸管式生化反应器的吸气及所液传质特性,提出了吸气量(Qs)和容积氧传递系数(kLa)的数学表达式：Qg=5.2×10^-2W^0.144_cLR^0.079_cD(L-D)^0.328D²_nPoπ——P^o_gTo[(D-Dn)²-1](Pn-Pl)-1)(Kla)₁=0.999(W-V)^0.38V^0.90_sg(L-D)^-0.16(Kla)2=1.003(W-V)^0.71V^0.28_sg(L-D)^-0.32(加C圈)反应器的具优工况为：L/D=320-400,D/D=2.7—3。8,Pn=5—13×10⁴N/m²。Kla最高达4280h^-1,比能耗为0.72—2.16×10³kJ/kgO₂用于培养饲料酵母,酵母浓度达40.04kg/m³.最大生长速率为6.24kg/m³·h,比能耗为1.66—2.52×10³KJ/kg DBM.空气利用率为10—20%.是一般生化反应器的2—4倍。     

变异株B．S．796生产σ淀粉酶工艺条件的研究

从枯草杆菌Bacillus subtilis209出发,选育出B．S．796变异株。该菌在麦芽糖6％,豆粕水解液6—7％, Na₂HPO₄·12H₂OO．8％, (NH₄)₂SO₄ O．4％, CaCl₂ O．2％,NH₄Cl0．15％,pH6．5—7．O的培养基(麦芽糖培养基)中可获得较高的a-淀粉酶活性,在1．5m3发酵罐中试验a-淀粉酶活性平均可达477u／ml(比原菌提高40．6%)。按上法所得发酵液能快速通过板框压滤机,过滤回收率高达95％,提取总收率约为78％。     

水稻抗稻瘟病基因Pi-d(t)1、Pi-b、Pi-ta2的聚合及分子标记选择

冈46B(G46B)是水稻生产应用中的一个农艺性状十分优良的保持系 ,其主要的缺陷是稻瘟病抗性较弱 ,通过对地谷 ,BL-1,Pi-4号等三个分别含抗病基因Pi-d(t)¹、Pi-b、Pi-ta² 的稻瘟病抗性材料与G4-6B聚合杂交 ,并利用抗病基因连锁的分子标记对杂交后代进行辅助选择 ,在聚合杂交的F2代及B1C1代群体中共获得了 15株含Pi-d(t)¹ 、Pi-b、Pi-ta² 等三个抗稻瘟病基因的材料 ,其可能的基因型分别为 :三基因杂合体Pi-d(t)¹ pi-d(t)¹ Pi-bpi-b-Pi-ta² pi-ta²4株 ,双基因杂合体 10株 ,其中Pi-d(t)¹ Pi-d(t)¹ Pi-bpi-b-Pi-ta² pi-ta²6株 ,Pi-d(t)¹ pi-d(t)¹ Pi-bpi-b-Pi-ta² Pi-ta² 3株 ,Pi-d(t)¹ pi-d(t)¹ Pi-bPi-b-Pi-ta² pi-ta² 1株 ,双基因纯合体Pi-d(t)¹ Pi-d(t)¹ Pi-bpi-b-Pi-ta² Pi-ta²仅1株 ,这一研究结果为进一步改良G46B的稻瘟病搞性奠定了基础,同时这一研究结果表明利用分子标记可快速、有效地实现多个抗病基因的聚合,大大提高水稻抗病育种的效率。     

基于基因组的一株土壤固氮菌分离菌株鉴定及其促生作用

[目的] 为获得高效固氮菌株,充分研究利用土壤固氮菌资源。[方法] 选取固氮能力较高的紫色土发育水稻土,采用富集纯化法分离固氮微生物菌株。通过16S rRNA基因系统发育分析和全基因组相关指数比较对新分离菌株进行物种鉴定。采用乙炔还原法和¹⁵N₂示踪法定量测定新分离菌株的固氮能力,通过培养特性和接种效果初步研究固氮菌株的促生作用。[结果] 从紫色土发育水稻土中分离得到1株可在无氮培养基上快速生长的菌株P208。基于16S rRNA基因和基因组92个核心基因的系统发育分析结果表明,新分离菌株P208与Azotobacter chroococcum IAM 12666^T（=ATCC 9043^T）系统发育距离最近（16S rRNA基因相似度为99.79%）。菌株P208与A.chroococcum ATCC 9043^T的基因组平均核苷酸一致性（ANI）、平均氨基酸一致性（AAI）和数字DNA-DNA杂交值（dDDH）高于物种分类阈值（ANI>95%-96%,AAI>95%-96%,dDDH>70%）,最大唯一匹配指数（MUMi）低于物种分类阈值（<0.33）,得出新分离菌株P208为褐球固氮菌（A.chroococcum）。A.chroococcum P208固氮活性为模式菌株A.chroococcum ATCC 9043^T的2.61倍。除固氮能力外,A.chroococcum P208具有IAA生成、溶磷活性和铁载体生成等促进植物生长潜力的培养特性,室内培养条件下接种A.chroococcum P208能够促进水稻、小麦幼苗根系的生长。[结论] 从固氮能力较强的水稻土中分离纯化得到1株具有较强固氮、促生潜力的固氮菌,具有潜在的开发应用价值,可为研究利用生物固氮提供微生物资源。