应用改进的通用荧光PCR引物进行多重STR分型

通过设计通用荧光PCR引物并结合DNA测序系统建立了小鼠的多重STR分型方案.实验针对小鼠基因组设计了两对不同的通用引物序列,标记了FAM荧光的通用序列和"加尾"的位点特异性引物共同用于小鼠的多重PCR的STR基因分型.本研究优化了通用引物和特异性引物间的比例,优化了多重STR-PCR的反应条件,并最终利用该技术方案实现了五重STR分型.实验验证了该方案在多重STR分型中的可行性.与传统的荧光检测PCR产物方案相比,应用通用方案完成多重PCR反应大大节省了实验时间与经费.     

PCR引物特异性核查系统(PSC)的构建与应用

聚合酶链式反应(PCR)虽已广泛用于分子生物学研究中,然而PCR实验中的非特异性产物问题将直接影响PCR的效率,在多重PCR实验中更是如此。为了最大限度地降低非特异性产物的出现率,同时避免用户频繁使用Blast比对检查非特异性,我们开发了基于NCBI-Blast的引物评估和模板DNA特异性结合能力评估的核查系统PSC(Primer Specificity Checking,http://biocompute.bmi.ac.cn/PSC),并基于虚拟PCR实验确定了用于引物质量核查计算的多种参数,能够在线提供多个物种的引物特异性核查结果。该系统可以有效地对引物序列可能产生的所有非特异性扩增进行预测,有助于实验前引物优化或者对非特异扩增结果进行解释,最终达到提高PCR效率的目的。     

多重PCR在质粒拷贝数检测中的应用

聚合酶链式反应(PCR)作为常规分子克隆技术已在分子生物学的各个领域得到广泛应用.然而,多重PCR技术应用于质粒拷贝数检测的研究尚未见报道.为深入探索多重PCR在质粒拷贝数测定中的应用,首先利用构建的多重PCR引物设计及评估体系分别针对细菌基因组DNA和质粒载体DNA序列设计多重PCR引物;然后以转化有不同质粒载体的大...     

多重PCR法检测对虾皮下和造血器官坏死杆状病毒

根据对虾皮下和造血器官坏死杆状病毒(HHNBV)HHNBV-XIA靶基因序列设计了4个多重PCR法用引物(P1、P2、P3、P4).采用了五种引物组合形式分别对HHNBV-XIA、HHNBV基因和PRDV-JAPAN片段进行了特异扩增,建立了多重PCR检测HHNBV方法.通过优化多重PCR法检测HHNBV条件,可从阳性感染的中国对虾fg级DNA中定性检测出皮下和造血器官坏死杆状病毒.     

在单个PCR管内快捷完成定点突变

采用大引物方法,利用质粒多克隆位点两侧的普通测序引物作为旁侧引物,在单个PCR管内,经2个步骤共34个循环进行定点突变. 该方法通过优化模板和引物的量达到降低PCR循环次数, 通过加入10个在68℃复性条件下的PCR循环达到增加突变效率而无需胶纯化.本方法达到平均62%的突变效率,而且全长扩增产物的产率很高.     

食源性致病菌多重PCR快速检测方法建立与应用

利用PCR技术,建立多组多重食源性致病菌PCR快速检测方法。设计受试菌特异性引物,反应体系中加入多对引物和多种DNA模板,采用正交试验优化PCR反应条件,进行特异性引物的PCR扩增。建立了多组多重食源性致病菌PCR快速检测方法,方法中所检测受试菌株和模拟样品均出现特异性扩增条带,结果与实际相符。所建立多组多重PCR快速检测体系符合设计要求,可以应用于食源性突发公共卫生事件的应急检测和日常样品检测工作。     

啮齿动物螺杆菌多重PCR检测方法的建立

目的建立一种可同时检测肝、胆汁、啮齿类三种螺杆菌的多重PCR方法。方法根据已公布的肝、胆汁、啮齿类三种螺杆菌16SrRNA基因序列设计三对特异性引物进行多重PCR并对反应条件进行优化。结果三对引物能分别扩增出特异性的417 bp、364 bp、324 bp目的条带。最佳退火温度为52℃,镁离子浓度为2.0mmol/L,dNTP浓度为200μmol/L,引物浓度为0.625μmol/L。在此条件下多重PCR同时检测的肝、胆汁、啮齿类三种螺杆菌敏感度均为10 fg。结论本实验建立的多重PCR是一种敏感、特异、高效的方法,为同时检测啮齿动物中肝、胆汁、啮齿类三种螺杆菌奠定了良好的基础。     

一种优化的胡杨高效多重（12重）SSR体系

微卫星多重PCR方法是一种非常经济并且高通量的基因分型技术。本研究在耐干旱、盐碱的胡杨（Populus euphratica）中开发出一套荧光标记的12重微卫星工作体系。该体系包含12条表达序列标签微卫星（EST-SSR）引物,其中3条设计于NCBI,另外9条设计于二代的转录组序列。利用该多重微卫星体系可在单一的PCR反应体系中成功扩增出12条表达序列标签的微卫星短序列片段。并在胡杨的3个自然居群96个个体中对该体系进行了验证,结果显示该体系具有很高的稳定性及多样性。同时,在杨属的5个派7个种中对其通用性进行了检验,显示这些引物具有很高的通用性,成功扩增率为79％。本研究中提供的12重多重PCR结合本实验已经公开发表的2个8重体系对揭示胡杨及其他杨树的进化历史具有重要的作用。最后,本研究认为引物的选择,扩增效率,哑等位基因的检测是多重体系开发过程中最为关键的步骤。     

一种优化的胡杨高效多重 (12重) SSR体系

微卫星多重PCR方法是一种非常经济并且高通量的基因分型技术。本研究在耐干旱、盐碱的胡杨（Populus euphratica）中开发出一套荧光标记的12重微卫星工作体系。该体系包含12条表达序列标签微卫星（EST SSR）引物,其中3条设计于NCBI,另外9条设计于二代的转录组序列。利用该多重微卫星体系可在单一的PCR反应体系中成功扩增出12条表达序列标签的微卫星短序列片段,并在胡杨的3个自然居群96个个体中对该体系进行了验证,结果显示该体系具有很高的稳定性及多样性。同时,在杨属的5个派7个种中对其通用性进行了检验,显示这些引物具有很高的通用性,成功扩增率为79%。本研究中提供的12重多重PCR结合本实验已经公开发表的2个8重体系对揭示胡杨及其他杨树的进化历史具有重要的作用。最后,本研究认为引物的选择,扩增效率,哑等位基因的检测是多重体系开发过程中最为关键的步骤。     

重要肠道病原菌多重PCR-基因芯片检测方法研究

目的:建立并初步评价一种针对重要肠道病原菌的多重PCR 基因芯片检测方法。方法：对筛选出的特异引物进行多重PCR优化,将引物分别按种属内混合和种属间混合的方案排查引物间的竞争性抑制现象,再将不同菌属的模板混合,用相对应的混合引物扩增,探寻高效特异的引物组合。分别掺入和不掺入荧光素,验证其对混合PCR反应的影响,并与芯片杂交,探寻多重PCR扩增效率对芯片杂交的影响。分析不同数量引物组合产生的杂交结果,筛选出无交叉反应的最优引物组合。结果:种属内引物混合均得到特异性扩增结果。种属间混合霍乱弧菌和空肠弯曲菌得到部分预期条带,随着混合引物数量的增加,交叉抑制现象也增多。杂交信号强度随多重PCR扩增效率的增加而增强。反应中掺入荧光素的扩增条带产量低于无荧光素的产物。可将35对混合引物拆成3个体系分别标记样品,以避免假阴性结果。结论:PCR反应中掺入荧光素降低扩增效率和杂交效率,但并不影响对杂交结果的判读和数据分析。基因芯片杂交信号强度取决于多重PCR的扩增效率。肠道病原菌多重PCR 基因芯片检测方法具有较高的特异性,混合PCR可以分别按照种属内和种属间的引物组合方案用于多病原的筛检。该基因芯片检测可以采用3个引物体系完成样品标记。     

小型猪微卫星标记多重PCR体系的建立与应用

目的建立实验用小型猪微卫星标记的多重PCR体系和进行实验猪群的遗传监测。方法利用3种不同荧光标记的微卫星引物结合ABI3700遗传分析仪测序的方法,通过筛选和优化反应条件,建立可用于实验用小型猪遗传质量控制的稳定的多重PCR反应体系。在此基础上进一步检测实验用小型猪近交群体的遗传变异以验证建立体系的效率。结果筛选出了2组理想的组合：组合1包括SW742、S0228和S0218座位,复性温度58℃和56℃;组合2包括S0155、SW902和S0227三个座位,复性温度为60℃和58℃。组合内不同座位标记不同的荧光染料。还以此检测了实验用小型猪群体中的遗传变异。结论初步建立了中国三种实验用小型猪微卫星标记检测的多重PCR体系,为快速、大通量、准确的小型猪遗传监测提供了初步的技术基础。     

Use of multiplex polymerase chain reactions to indicate the accuracy of the annealing temperature of thermal cycling

A condition for multiplex polymerase chain reactions (PCRs) of which outcomes sensitively indicate the actual annealing temperature of thermal cycling is reported. The multiplex reaction was designed to produce four different amplicons of 200, 300, 400, and 480 bp. However, the degree of amplification of each amplicon sensitively responds to a small change in the annealing temperature, by which one can predict the actual annealing temperature of thermal cycling. Deviations between the actual and the designated annealing temperatures as small as 0.5 degrees C were manifested by the banding patterns of the multiplex PCRs in simple agarose gel electrophoresis. For prediction of temperatures in a more objective manner, capillary electrophoresis was also applied to obtain numerical expressions of the relative intensities of the amplicons. By optimizing the multiplex PCR conditions, where concentrations of buffer, dNTPs, and primer pairs were major factors, satisfactory sensitivity and reproducibility of the band patterning were achieved. Blind tests demonstrated the accuracy of the prediction of actual annealing temperatures within +/-0.5 degrees C. The multiplex PCR approach will be further refined and tested for realization of an easily accessible alternative to a physical temperature measurement device in testing the performance of thermal cyclers for PCR.     

A multiplex nested PCR assay for simultaneous detection of Corchorus golden mosaic virus and a phytoplasma in white jute (Corchorus capsularis L.)

A multiplex nested PCR assay was developed by optimizing reaction components and reaction cycling parameters for simultaneous detection of Corchorus golden mosaic virus (CoGMV) and a phytoplasma (Group 16Sr V‐C) causing little leaf and bunchy top in white jute (Corchorus capsularis). Three sets of specific primers viz. a CoGMV specific (DNA‐A region) primer, a 16S rDNA universal primer pair P1/P7 and nested primer pair R16F2n/R2 for phytoplasmas were used. The concentrations of the PCR components such as primers, MgCl₂, Taq DNA polymerase, dNTPs and PCR conditions including annealing temperature and amplification cycles were examined and optimized. Expected fragments of 1 kb (CoGMV), 674 bp (phytoplasma) and 370 bp (nested R16F2n/R2) were successfully amplified by this multiplex nested PCR system ensuring simultaneous, sensitive and specific detection of the phytoplasma and the virus. The multiplex nested PCR provides a sensitive, rapid and low‐cost method for simultaneous detection of jute little leaf phytoplasma and CoGMV. Based on BLASTn analyses, the phytoplasma was found to belong to the Group 16Sr V‐C.

Significance and Impact of the Study

Incidence of phytoplasma diseases is increasing worldwide and particularly in the tropical and subtropical world. Co‐infection of phytoplasma and virus(s) is also common. Therefore, use of single primer PCR in detecting these pathogens would require more time and effort, whereas multiplex PCR involving several pairs of primers saves time and reduces cost. In this study, we have developed a multiplex nested PCR assay that provides more sensitive and specific detection of Corchorus golden mosaic virus (CoGMV) and a phytoplasma in white jute simultaneously. It is the first report of simultaneous detection of CoGMV and a phytoplasma in Corchorus capsularis by multiplex nested PCR.     

Detection and typing of BKV,JCV, and SV40 by multiplex nested polymerase chain reaction

A multiplex nested polymerase chain reaction (PCR) method was developed for detecting and differentiating simultaneously the DNA of polyomaviruses JC, BK, and SV40 in a single tube. In the first amplification step the same set of primers was used to amplify a conserved DNA region of the large T antigen gene of JCV, BKV, and SV40. The second round was carried out using a set of primers designed to obtain products of different size for each related virus. Subsequently, the sensitivity of the multiplex nested PCR was maximized by optimizing parameters such as primer, magnesium, and dNTP concentrations. The sensitivity of the method ranged between 1 and 10 copies of the polyomavirus genome. The assay was then used for detecting polyomavirus DNA in urine, serum, and biopsy specimens from renal transplant recipients. Based on the results obtained, the multiplex nested PCR developed in our study represents a useful tool for supporting the diagnosis of polyomavirus infection and could be used for epidemiological purposes and to better define the role of polyomaviruses in human pathology.     

多重PCR技术在病原检测中的应用

多重PCR能够同时扩增不同片段,具有普通PCR方法不可比拟的优势。简要论述了多重PCR在细菌病原体的检测、病毒病原体的检测、支原体和衣原体及寄生虫的检测、微生物耐药性检测等方面的应用,分析了多重PCR的影响因素及条件优化,并进一步综述了多重PCR的应用前景。     

应用红外荧光和加尾引物法进行向日葵SSR遗传分析中的多聚PCR和多聚凝胶电泳的优化

在向日葵(Helianthus annuus L.)自交系SSR遗传分析中,为了提高SSR荧光分析效率、简化分析程序和降低研究费用,我们进行了多聚PCR和多聚凝胶电泳两项技术的优化研究。结果表明,优化多聚PCR和多聚凝胶电泳的影响因子(如逐步降低的退火温度的循环数、各个多聚位点引物浓度的平衡、PCR缓冲液浓度以及Taq DNA多聚酶的浓度等)可以收到更好的实验效果。基于以上的优化研究,系统地提出了一套优化的加尾引物法的策略。同时,提出了在多聚PCR和多聚凝胶电泳中常常遇到的技术难题的有效防止和解决的方法。     

Simultaneous quantitative assessment of circulating cell-free mitochondrial and nuclear DNA by multiplex real-time PCR

Quantification of circulating nucleic acids in plasma and serum could be used as a non-invasive diagnostic tool for monitoring a wide variety of diseases and conditions. We describe here a rapid, simple and accurate multiplex real-time PCR method for direct synchronized analysis of circulating cell-free (ccf) mitochondrial (mtDNA) and nuclear (nDNA) DNA in plasma and serum samples. The method is based on one-step multiplex real-time PCR using a FAM-labeled MGB probe and primers to amplify the mtDNA sequence of the ATP 8 gene, and a VIC-labeled MGB probe and primers to amplify the nDNA sequence of the glycerinaldehyde-3-phosphate-dehydrogenase (GAPDH) gene, in plasma and serum samples simultaneously. The efficiencies of the multiplex assays were measured in serial dilutions. Based on the simulation of the PCR reaction kinetics, the relative quantities of ccf mtDNA were calculated using a very simple equation. Using our optimised real-time PCR conditions, close to 100% efficiency was obtained from the two assays. The two assays performed in the dilution series showed very good and reproducible correlation to each other. This optimised multiplex real-time PCR protocol can be widely used for synchronized quantification of mtDNA and nDNA in different samples, with a very high rate of efficiency.     

禽大肠杆菌、肠炎、鼠伤寒、鸡白痢及鸡伤寒沙门菌多重PCR方法的建立及应用

【背景】大肠杆菌病和沙门菌病是最常见的家禽细菌性疾病,给养禽业造成严重经济损失。另外,禽大肠杆菌和沙门菌也是重要的人畜共患病原菌,可通过禽类及其产品传播给人类,对人类健康造成严重威胁。加强禽大肠杆菌和沙门菌的快速鉴别检测,对养禽业和公共卫生都具有重要意义。【目的】建立禽大肠杆菌、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌、鸡白痢沙门菌和鸡伤寒沙门菌的多重PCR检测方法。【方法】通过比较分析确定禽致病性大肠杆菌、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌、鸡白痢沙门菌和鸡伤寒沙门菌的特异靶标基因,设计5对特异性引物,通过条件优化建立多重PCR方法,分析该多重PCR方法的特异性、敏感性及可靠性。【结果】该方法能特异性地鉴定禽致病性大肠杆菌、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌、鸡白痢沙门菌和鸡伤寒沙门菌,每个PCR反应的最低检出限分别为103 CFU细菌和100 pg基因组DNA。临床分离菌株检测显示,多重PCR与传统血清学方法结果一致。【结论】建立的多重PCR方法能够快速鉴别禽致病性大肠杆菌和不同血清型沙门菌,对禽大肠杆菌病和沙门菌病的流行病学调查及临床检测具有重要意义。     

藏绵羊子宫内膜炎主要致病菌多重PCR检测方法的建立与评价

本研究旨在建立一种多重PCR方法检测青海藏绵羊子宫内膜炎主要的病原菌。首先,提取5种标准菌株基因组,筛选出特异性引物;然后以标准菌株的基因组为模板,建立多重PCR方法。用无菌棉拭子涂抹藏绵羊子宫,置于LB培养液中培养并编号,48 h后提取样品基因组。运用单一PCR法对600份样品基因组进行检测,记录阳性样品;再挑取单一PCR法检测的阳性样品进行多重PCR检测,再次记录阳性样品,通过计算两种检测方法的符合率验证多重PCR方法;随机挑出30份阳性样品,进行病原菌分离鉴定菌种种类。单一PCR检测的样品中,无乳链球菌感染比例占47.33%,大肠杆菌占34.83%,金黄色葡萄球菌占6.5%,未检出沙门氏菌和化脓隐秘杆菌;多重PCR检测的阳性样品中,无乳链球菌感染比例占45.50%,大肠杆菌占33.50%,金黄色葡萄球菌占6.5%;两种检测结果相比较,多重PCR检测出的符合率均高于95%;分离鉴定的病原菌与两种PCR方法检测出的菌种结果基本一致。成功建立了多重PCR方法并检测出引起青海藏绵羊子宫内膜炎的主要病原菌为无乳链球菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。