家养水牛30个微卫星标记的多重PCR体系建立及其多态性检测

利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结合硝酸银染色方法, 从30个微卫星标记中筛选出9组多重PCR体系, 其中4组三座位组合, 5组二座位组合; 在此基础上进一步检测了这些标记在中国海南兴隆水牛中的遗传变异性。结果显示其中26个标记具有多态性, 而其余4个标记(CSSM045, ILSTS008, RM099和HMH1R)为单态, 群体平均等位基因数4.7, 平均期望杂合度为0.534。所筛选出的多重PCR组合为家养水牛的群体遗传多样性 检测和亲子鉴定等研究提供了技术基础。     

大河猪76个STR基因座的遗传多态性

大河猪是中国西南中海拔地区代表性猪种之一,长期以来在当地养猪生产中发挥了重要作用。为了阐明其群体遗传变异情况,为进一步有效保护和合理利用提供科学依据,采用分布在家猪19对染色体上的76个微卫星标记对该猪种60个随机抽样个体进行了微卫星PCR–聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。共检测到347个等位基因,所有座位都呈现出多态性,每个座位的等位基因数在3—10个之间,平均每个座位等位基因数4.57个,有效等位基因数3.50个,群体平均杂合度及平均多态信息含量分别为0.696 2±0.071 6和0.644 1±0.091 4。结果表明,大河猪群体遗传多样性较丰富,选择潜力较大。     

基于微卫星多重PCR技术的黄喉拟水龟亲子鉴定

利用黄喉拟水龟(Mauremys mutica)微卫星标记,筛选出16对微卫星引物,通过优化各引物比例、荧光接头浓度、退火温度和循环次数,建立了基于2组各含8个微卫星位点多重PCR体系的黄喉拟水龟亲子鉴定技术。应用2组微卫星多重PCR体系,通过ABI3130遗传分析仪以及cervus3.0软件对428只黄喉拟水龟进行了个体基因型检测和遗传多样性分析,结果显示,群体的平均等位基因数为14.190,平均多态信息含量为0.748,平均观测杂合度和期望杂合度分别为0.687、0.771。对89只候选母本及296只子代进行亲子鉴定分析,结果显示:在父本信息未知时,母本鉴定率为87%;母本获得的子代个数范围为1-12,个体间表现出巨大的差异,这为选择育种提供了物质基础。黄喉拟水龟多重PCR亲子鉴定技术的建立为群体遗传多样性分析、家系鉴定管理和选择育种提供了有效的技术手段。       

筛选适用于小型猪遗传检测的微卫星位点

目的筛选用于封闭群小型猪遗传检测的微卫星位点。方法从资料和GenBank中选取扩增效果好、等位基因多、均匀分布于小型猪18条常染色体和X染色体上的100个微卫星位点,合成引物,对封闭群小型猪基因组进行PCR扩增及条件优化。PCR产物采用琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳和STR扫描技术进行分析和比较,选择多态性好的位点。结果筛选出32个分布于不同染色体且等位基因多的微卫星位点。结论筛选出了应用于封闭群小型猪遗传检测的微卫星位点。     

茶花鸡群体遗传多样性

茶花鸡是我国具有独特遗传特性的地方家禽品种,为了进一步阐明其群体遗传变异和遗传结构状况,采用了33个家鸡特异性的微卫星标记对该鸡种自然群体中30个个体进行了多态性电泳检测。33个微卫星座位共检测到105个等位基因,所有座位都呈现出多态性,每个座位的等位基因数在2~5个之间,平均每个座位等位基因数3.20个。群体平均杂合度和平均多态信息含量分别为0.612 9和0.527 6。结果表明,茶花鸡自然群体遗传多样性较丰富。     

云南南部地区野猪群体的遗传多样性

野猪(Sus scrofa)是家猪的祖先,也是野生动物遗传资源和生物多样性的重要组成部分.为了阐明其群体遗传变异,以对其进一步有效保护和合理利用提供科学依据,本研究采用分布在家猪19条染色体上的76个微卫星标记对云南南部地区野猪群体65只个体进行了群体遗传变异分析.共检测到349个等位基因,每个座位的等位基因数从3到9不等,有效等位基因数在1.683 5-8.066 7之间,平均每个座位等位基因数(4.592 1±1.145 2)个,有效等位基因数(3.709 9±0.990 4)个,群体平均表观杂合度、期望杂合度及平均多态信息含量分别为(0.949 2±0.113 5)、(0.711 6±0.078 7)和(0.663 4±0.092 1).结果表明,本实验检测到的野猪群体遗传多样性较丰富.     

8个亚洲水牛群体的遗传结构分析

应用13个微卫星标记结合荧光–多重PCR技术, 对德昌水牛、兴隆水牛、富钟水牛、温州水牛、东流水牛、福安水牛和两个引进品种摩拉水牛、尼里－拉菲水牛进行遗传结构分析。结果表明: 8个水牛群体在13个微卫星座位中共检测到157个等位基因, 其中7个群体具有各自的特有等位基因, 其和为23; 8个群体的有效等位基因数在2.2908～4.2308之间, 杂合度在0.4951～0.7194之间, 多态信息含量在0.4495～0.6776之间; 有11个座位为高度多态座位, 是适合分析水牛遗传多样性的多态标记; 聚类分析表明富钟水牛和东流水牛先聚在一起, 再与兴隆水牛聚在一起, 然后与温州水牛和福安水牛聚在一起, 德昌水牛独自聚为一类; 两个引进品种聚为一类。     

不同猪种肠毒素大肠杆菌（ETEC）F4受体的微卫星标记遗传效应分析

从猪13号染色体选取与E.coli F4受体基因连锁的4个微卫星座位研究中外猪种间的遗传差异性,并分析不同基因型与F4受体黏附表型的关系。结果表明,4个猪种在4个基因座均具有高度多态性,杂合度（H）在0.6117～0.7500之间,多态信息含量（PIC）达0.5749以上;同时中外猪种基因频率存在差异,微卫星座位连锁越紧密,差异性越大。微卫星S0222不同基因型间在沙子岭猪F4ab血清型黏附表型中差异显著;SW458座位AC基因型在沙子岭、大白两个品种中无黏附表型,可望作为对E.coliF4抗性基因的遗传标记。     

长江水系草鱼遗传多样性的微卫星DNA分析

利用已发表的鲤微卫星引物在草鱼中进行PCR扩增,结果有5对引物(6个座位)能成功扩增并且有较高多态性,等位基因数在3-7个之间。这些异种扩增的草鱼微卫星符合孟德尔遗传规律。测序证明草鱼中的微卫星核心重复序列部分与鲤中的原始核心序列相似,也有一些变化。随后用这6个多态微卫星座位研究了来自长江水系的四个草鱼群体的遗传结构,结果显示每个群体的平均等位基因数在38与48之间,平均观测杂合度(Ho)在04000与05741之间,平均期望杂合度(HE)在04773与06489之间,有多个座位在不同的群体中偏离哈代-温伯格平衡。遗传距离分析表明四川群体与洞庭湖群体遗传距离最远,而嘉鱼群体与鄱阳湖群体遗传距离较近。分子变异分析(AMOVA)表明,群体内遗传变异与群体间遗传变异分别占总遗传变异的9560%与440%,固定系数(FST)为0044,这表明长江水系草鱼目前的群体分化很微弱。       

三角帆蚌微卫星多重PCR体系的建立及其应用

为了提高三角帆蚌微卫星分析效率,从已开发的微卫星标记中构建了三组四重PCR,并将稳定的多重PCR体系用于56个三角帆蚌紫色选育系的遗传多样性研究。结果表明该群体的平均等位基因数18.75,平均有效等位基因数为9.010,平均多态信息含量为0.857,平均观测杂合度和期望杂合度分别为0.809和0.876,香农多样性指数为2.422。运用Cervus v3.0软件对3个三角帆蚌全同胞家系共114个个体进行亲子鉴定,结果显示,使用该3组微卫星多重PCR体系进行亲子鉴定准确率为100%。该三角帆蚌微卫星多重PCR应用于三角帆蚌群体遗传多样性分析、亲子鉴定和家系管理等,可提高工作效率,降低实验成本。     

丝羽乌骨鸡微卫星标记多重PCR体系的建立与初步应用

采用多重PCR的方法, 对其反应条件进行优化, 以获得用于丝羽乌骨鸡遗传分析的稳定PCR体系。18个微卫星标记共获得5个扩增效果理想的组合, 其中3个为四重PCR, 2个为三重PCR。将扩增产物进一步合并为3组, 用ABI 3100-Avant遗传分析仪检测。实验结果表明, 所选用的微卫星标记表现出丰富的多态性, 可成功地应用于丝羽乌骨鸡的遗传分析。     

豚鼠基因组26个多态性微卫星标记的筛选

目的筛选豚鼠基因组的多态性微卫星标记,为豚鼠遗传质量控制及基因定位等工作奠定基础。方法采用磁珠富集法和豚鼠基因组数据库筛选法获取微卫星位点序列,通过分析和初步筛选,挑选部分候选位点,根据其序列设计引物,对5种不同来源的豚鼠基因组DNA标本进行PCR扩增,以期获得多态性分子标记。结果本实验采用磁珠富集法共获得微卫星序列304个,设计引物125对,最终获得多态性位点1个,暂未发现多态性的特异性位点17个;用数据库筛选法共获得微卫星序列292个,设计并合成相应引物178对,最终发现多态性位点25个,暂未发现多态性的特异性位点28个。结论本实验获得26个多态性微卫星标记,45个潜在的候选标记,为微卫星标记在豚鼠遗传质量监测及突变基因定位等工作的应用奠定了基础。     

A universal microsatellite multiplex kit for genetic analysis of great apes

DNA profiling with microsatellite markers is a commonly used genetic method of studying the great apes. An efficient method of generating the genetic data is amplification of multiple microsatellites in a single PCR reaction. Here we describe a PCR multiplex in which 9 genetic markers can be amplified simultaneously, thereby saving time, expenses and DNA. This marker system can discriminate between all the great ape species except bonobos and chimpanzees. Furthermore, the cumulative probability of identity values were low for all 4 species tested.     

三种小型猪线粒体DNA控制区的比较研究

目的分析五指山小型猪、巴马小型猪和贵州香猪线粒体DNA控制区碱基序列,比较研究不同猪种的遗传标志。方法应用PCR技术分别对这三种小型猪的血液总DNA样品中线粒体DNA D-loop区进行扩增,测序比对。结果猪的线粒体DNA D-loop区分三个区域。I区（靠近5’端区域）704bp,五指山小型猪在此区共有6个变异位点,通过6个变异位点中归纳出3个单倍体,而巴马小型猪在此区有9个变异位点,通过9个变异位点归纳出4个单倍体,贵州香猪在此区共有6个变异位点,通过6个变异位点归纳出3个单倍体。Ⅱ区（串联重复序列区）,五指山小型猪、巴马小型猪和贵州香猪序列相同。Ⅲ区（靠近3’端区域）三种小型猪的序列几乎相同。结论五指山小型猪、巴马小型猪和贵州香猪三种小型猪之间线粒体DNA碱基序列变异位点较少,五指山小型猪和巴马小型猪亲缘关系较近。     

Virulotyping of <Emphasis Type="Italic">Salmonella enterica</Emphasis> subsp. <Emphasis Type="Italic">enterica</Emphasis> isolated from indigenous vegetables and poultry meat in Malaysia using multiplex-PCR

The increased occurrence of Salmonella occurrence in local indigenous vegetables and poultry meat can be a potential health hazards. This study is aimed to detect the prevalence of twenty different virulence factors among Salmonella enterica strains isolated from poultry and local indigenous vegetables in Malaysia via an optimized, rapid and specific multiplex PCR assay. The assay encompasses a total of 19 Salmonella pathogenicity islands genes and a quorum sensing gene (sdiA) in three multiplex reaction sets. A total of 114 Salmonella enterica isolates belonging to 38 different serovars were tested. Each isolate in under this study was found to possess up to 70% of the virulence genes tested and exhibited variable pathogenicity gene patterns. Reproducibility of the multiplex PCR assay was found to be 100% and the detection limit of the optimized multiplex PCR was tested with lowest detectable concentration of DNA 0.8 pg μl⁻¹. This study demonstrated various Salmonella pathogenicity island virulence gene patterns even within the same serovar. This sets of multiplex PCR system provide a fast and reliable typing approach based on Salmonella pathogenicity islands, thus enabling an effective monitoring of emerging pathogenic Salmonella strains as an additional tool in Salmonella surveillance studies.     

A standard panel of microsatellites for Asian seabass (Lates calcarifer)

Microsatellites are the most popular markers for parentage assignment and population genetic studies. To meet the demand for international comparability for genetic studies of Asian seabass, a standard panel of 28 microsatellites has been selected and characterized using the DNA of 24 individuals from Thailand, Malaysia, Indonesia and Australia. The average allele number of these markers was 10.82 ± 0.71 (range: 6–19), and the expected heterozygosity averaged 0.76 ± 0.02 (range: 0.63–1.00). All microsatellites showed Mendelian inheritance. In addition, eight standard size controls have been developed by cloning a set of microsatellite alleles into a pGEM‐T vector to calibrate allele sizes determined by different laboratories, and are available upon request. Seven multiplex PCRs, each amplifying 3–5 markers, were optimized to accurately and rapidly genotype microsatellites. Parentage assignment using 10 microsatellites in two crosses (10 × 10 and 20 × 20) demonstrated a high power of these markers for revealing parent‐sibling connections. This standard set of microsatellites will standardize genetic diversity studies of Asian seabass, and the multiplex PCR sets will facilitate parentage assignment.     

应用40对微卫星引物对6种近交系小鼠遗传背景进行监测的研究

采用40对引物的微卫星DNA PCR遗传质量符合要求的BALB／C－nu0nu-,DBA/2,SCID,T739,TA2,615等6种近交系小鼠进行遗传监测,结果26对引物有稳定的扩增结果,5对引物表现为单态性,21对引物表现出多态性,其中D2Nds3,D3Mitl5,D3Mitl7,D3Mit18,D16Mit7等6对引物表现出显著的多态性,反映了各品系小鼠独特的遗传背景,可应用于区别小鼠品系,监测系间的遗传污染,为有关小鼠品系积累了遗传背景资料,有助于将实验动物的遗传监测从表墼这度到DNA水平。     

中国三种实验用小型猪线粒体DNAD-loop多态性分析

分析中国三种实验用小型猪线粒体DNA（mtDNA）D-loop的多态性,建立各品种品系猪的遗传标记,为各品种、品系猪的鉴别提供依据。应用PCR技术分别对西双版纳近交系小耳猪、广西巴马小型猪、贵州小型香猪和长白猪的血液总DNA样品中mtDNAD-loop进行扩增,用23种限制性内切酶消化,观察其酶切多态。PCR扩增其mtDNAD-loop5′端227bp高变区域,应用PCR?SSCP和PCR直接测序分析,观察其单链构象多态和序列多态。结果显示：三种小型猪之间未见酶切长度多态、单链构象多态和序列多态。与长白猪之间表现出单链构象多态和序列多态。本研究认为：三种实验用小型猪之间mtDNA多态性贫乏,证明其亲源关系很近,在母系起源和进化上有一致性,应用PCR RFLP、PCR SSCP和PCR直接测序分析,尚不能作为三种实验用小型猪品种、品系鉴定的依据,但与长白猪等欧系猪比较有一定差异。 Abstract：the present study is to analyze the polymorphism of the mtDNA D-loop in three breeds of laboratory miniature pigs in China , and to establish its cytoplasmic DNA markers to distinguish among them . The polymorphism of mtDNA D-loop and its 5′-end high variable regions were detected by PCR-RFLP , PCR-SSCP and PCR-direct sequencing on Xishuangbanna Small-ear inbred pig, Guizhou miniature Xiang pig , Guangxi Bama miniature pig and Landrace.There was no polymorphism obtained among or within three breeds of Chinese laboratory miniature pigs besides Landrace. It is concluded that the polymorphism of mtDNA D-loop within the three breeds of Chinese laboratory miniature pigs is poor , These methods cannot be used to distinguish among them , but it can be used to distinguish them from Landrace.     

应用xMAP液态芯片多重快速检测四种病原微生物的研究

目的：建立一种多重、快速、特异性好、灵敏度高的病原微生物检测方法。方法：根据GenBank数据库中的小肠结肠炎耶尔森氏菌、单核细胞增生性李斯特菌、产气荚膜梭菌、鼠疫耶尔森氏菌基因序列,分别针对ail、hly、cpe、3a基因设计4对引物和4条探针。通过重叠PCR扩增各目的基因并构建重组质粒,以该重组质粒DNA为模板,通过多重PCR同时扩增上述4个基因,建立xMAP液态芯片检测技术,在此基础上对标准菌株基因组DNA进行检测并验证该方法的特异性和敏感性。结果：xMAP液态芯片对质粒DNA和标准菌株基因组DNA的检测结果与多重PCR结果一致。该方法能在3.5 h内同时完成对4种病原菌的检测,特异性好,且敏感性要高于PCR方法,灵敏度最高可达200CFU/ml。结论：xMAP液态芯片技术是病原微生物的多重快速检测的新方法,具有很好的应用价值和前景。