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1.
禽致病性大肠杆菌毒力基因多重PCR方法的建立和应用   总被引:1,自引:0,他引:1  
【目的】建立禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)黏附相关基因、侵袭及毒素相关基因、抗血清存活相关基因及铁转运相关基因的多重PCR方法,实现禽致病性大肠杆菌毒力基因的简便、快速检测。【方法】根据GenBank公布的基因序列,设计合成18对特异性引物,通过条件优化,建立四组多重PCR体系,并通过模板倍比稀释检测各组多重PCR的灵敏性。利用多重PCR检测100株APEC毒力基因的分布,验证多重PCR方法的可行性。【结果】根据PCR扩增片段大小判定,上述四组多重PCR体系均能同时扩增出该组中的各个毒力基因,且灵敏度分别为:103CFU、103CFU、105CFU、105CFU细菌和1ng、1ng、10ng、10ng DNA。100株APEC的毒力因子检测结果显示,多重PCR和单基因PCR结果一致。【结论】建立的四组多重PCR方法能够简便、快速地检测禽致病性大肠杆菌的毒力基因,可用于毒力基因的鉴定以及流行病学调查。  相似文献   
2.
【目的】双组分系统Rcs感受外界环境变化,并调控细菌的适应性及生存等。本文探讨Rcs双组分系统传感器激酶RcsC对禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli,APEC)相关生物学特性及致病性的影响。【方法】采用Red同源重组的方法构建rcsC基因缺失株,并利用互补质粒构建互补株,然后比较野生株、基因缺失株与互补株的生长特性、运动性、生物被膜、凝集沉淀能力、致病力及毒力基因转录水平的差异。【结果】rcsC基因缺失不影响APEC的生长速度,然而,缺失RcsC导致APEC的运动能力升高、生物被膜形成能力降低和凝集能力增强。凝集试验结果显示rcsC基因有助于APEC的凝集沉降。细胞黏附入侵结果表明,rcsC在APEC侵袭DF-1细胞过程中发挥作用,而对黏附能力无影响。动物感染试验结果表明rcsC基因缺失能显著降低APEC的毒力。荧光定量PCR检测结果表明,rcsC基因缺失株中ompA、aatA、fyuA和luxS基因的转录水平均显著降低,而fimC和tsh基因的转录水平显著升高。【结论】RcsC参与调控APEC的运动性、生物被膜形成、凝集沉降和致病力。  相似文献   
3.
[背景]布鲁菌病是由布鲁菌感染引起的一种人兽共患传染病,对畜牧业发展和人类健康有着巨大的威胁。利用新型报告基因NanoLuc荧光素酶构建一种可以检测布鲁菌基因启动子活性的质粒,对于研究布鲁菌毒力基因的调控表达具有重要意义。[目的]制备NanoLuc荧光素酶多克隆抗体,构建一种基于NanoLuc荧光素酶报告布鲁菌基因启动子活性的质粒,并通过测定bcsp31基因启动子和virB启动子活性验证该方法的可行性。[方法]构建NanoLuc荧光素酶原核表达载体pET-Nluc,纯化蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体;以广宿主质粒pBBR1MCS为骨架,构建质粒pNluc、pBcsp31-Nluc和pVirB-Nluc,通过电转化构建S2308(Nluc)、S2308(Bcsp31-Nluc)和S2308(VirB-Nluc)重组菌株,在体外培养条件下测定bcsp31基因启动子和virB启动子活性;比较分析virB启动子在胞内感染条件下和体外培养条件下的活性。[结果]通过原核表达获得NanoLuc荧光素酶重组蛋白,并制备得到效价高于1:100 000的多克隆抗体;成功构建pNluc、pBcsp31-Nluc和pVirB-Nluc质粒以及S2308(Nluc)、S2308(Bcsp31-Nluc)和S2308(VirB-Nluc)重组菌株;体外培养条件下测定bcsp31基因启动子和virB启动子活性,结果显示pNluc质粒可以精确报告其活性;测定virB启动子在胞内诱导条件下和体外培养条件下的活性,结果显示virB启动子活性在胞内感染条件下明显增强。[结论]构建了基于NanoLuc荧光素酶报告布鲁菌基因启动子活性的质粒,并验证其可以精确反映布鲁菌基因启动子活性,为研究布鲁菌毒力基因以及揭示其致病机制奠定了基础。  相似文献   
4.
[背景] 鸭疫里默氏杆菌感染是危害水禽业最严重的细菌传染性病之一,鹅源鸭疫里默氏杆菌病的发病率有逐渐增高趋势,给养鹅业带来了巨大经济损失。[目的] 为更好地预防控制鹅源鸭疫里默氏杆菌病、解决鹅养殖场临床用药问题及进一步探究鸭源和鹅源鸭疫里默氏杆菌之间的关系。[方法] 对江苏地区的发病鹅进行鸭疫里默氏杆菌的分离培养、多重PCR方法鉴定及生化试验,并对分离获得的10株鸭疫里默氏杆菌进行药敏试验、血清型鉴定及雏鸭致病性试验。[结果] 药敏试验结果显示,鹅源分离菌株对大观霉素、磺胺异噁唑、头孢曲松、头孢拉定、氟苯尼考最敏感,对新霉素、卡那霉素、丁胺卡那霉素、庆大霉素和克林霉素耐药性最高且多重耐药性严重。血清型鉴定表明,江苏地区分离的10株鹅源鸭疫里默氏杆菌主要以血清型2型为主。雏鸭致病性试验表明,鹅源鸭疫里默氏杆菌分离株均引起雏鸭不同程度发病,其中3株鹅源临床分离株经1×107 CFU/羽攻毒后可引起雏鸭100%的致死率。[结论] 为鹅源鸭疫里默氏杆菌的预防控制、临床治疗及进一步研究鸭源和鹅源鸭疫里默氏杆菌之间的关系提供依据。  相似文献   
5.
【目的】wzz参与很多革兰氏阴性菌O抗原的合成,并对细菌的致病性具有调控作用。在禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)中,存在Wzz蛋白超家族基因wzz E,目前尚未开展该基因对APEC脂多糖(LPS)的合成及致病作用研究,因此本研究开展了wzz E对APEC LPS合成以及生物学特性影响的研究。【方法】通过构建APEC DE17株的wzz E缺失株,开展对野生型和缺失株的LD50、黏附与入侵DF-1细胞、脂多糖表型及内毒素毒价等相关生物学特性的影响研究。【结果】结果表明,缺失wzz E的APEC,不影响细菌的生长特性。野生型、缺失株及回复株的LPS表型无明显差异。DE17Δwzz E与DE17的黏附与入侵结果无显著差异。血清型鉴定结果表明,缺失wzz E,不影响细菌的血清型。内毒素毒力检测结果DE17、DE17Δwzz E及CΔwzz E内毒素的毒价一致,为4×10~5 EU/mg。对7日龄樱桃谷鸭进行攻毒,测定各菌株的LD50,结果表明,与野生型相比,DE17Δwzz E缺失株毒力下降了10倍。【结论】wzz E缺失对LPS的表型无显著影响,但wzz E参与APEC的致病过程,然而wzz E对APEC毒力的调控机制仍有待进一步研究。  相似文献   
6.
【目的】构建禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)VI型分泌系统2(Type VI secretion system 2,T6SS2)结构基因vgrG缺失株,研究其对APEC生物学特性及致病性的影响。【方法】通过Red同源重组方法构建DE719菌株vgrG基因缺失株,并利用低拷贝质粒pSTV28构建互补株。比较分析野生株、缺失株与互补株的生长特性、运动性、生物被膜形成能力、黏附侵袭能力、动物致病力等差异。【结果】vgr G基因缺失不影响DE719的生长速度、运动能力及生物被膜形成能力。致病性试验表明缺失vgrG导致体内定殖能力及致病力显著下降,然而对DF-1细胞的黏附能力增强。【结论】T6SS2核心组分VgrG在APEC感染过程中发挥重要作用,为了解APEC的致病作用提供参考。  相似文献   
7.
【背景】鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)可感染雏鸭、鹅、火鸡等多种禽类,引起急性或慢性传染病。RA血清型众多且各血清型之间缺乏有效的交叉保护。细菌脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)位于革兰氏阴性菌细胞壁的外侧,其组成和结构变化决定了细菌表面抗原决定簇的多样性。【目的】制备血清2型鸭疫里默氏杆菌LPS单克隆抗体并对其特性进行研究。【方法】以血清2型RA NJ3株免疫BALB/c小鼠,细胞融合后以RA NJ3株LPS作为包被抗原,筛选出能够稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,通过体内诱生腹水法制备抗体,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测单克隆抗体效价,玻片凝集试验和Westernblot检测单抗特异性。【结果】获得两株能稳定分泌抗血清2型鸭疫里默氏杆菌LPS单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为8G5和8G10;两株单抗的亚型均为IgM/κ链。ELISA结果表明,8G5和8G10腹水效价分别为1:32 000和1:16 000。Western blot结果显示,两株单抗仅与血清2型RA菌株发生特异性反应,而与其他血清型RA菌株和禽源致病菌无反应性。【结论】研究获得的单克隆抗体具有良好的反应性和血清型特异性,可用于RA致病机制的基础研究和进一步建立RA血清型快速检测方法。  相似文献   
8.
【背景】鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)是引起雏鸭、鹅、火鸡等多种家禽、野禽发生传染性浆膜炎的病原,在全世界范围内广泛存在,危害养禽业发展,造成严重的经济损失。【目的】了解国内RA的流行现状,探究该菌的生物学特性,更好地指导防控鸭疫里默氏杆菌病。【方法】对2020-2021年从山东省、河北省、广东省、山西省等地分离的RA疑似菌株进行PCR、生化和血清型鉴定,并根据药物敏感性结果分析耐药现象,根据半数致死量(median lethal dose,LD50)测定结果分析致病力差异。【结果】共鉴定78株RA分离株,其中,血清1型4株、2型21株、10型11株、6型3株、7型17株,1株有交叉凝集现象,21株血清型未定型;药敏结果显示78株分离株对多粘菌素B、磷霉素、克林霉素等的耐药性最强,对头孢拉定、多西环素、呋喃唑酮、氟苯尼考等抗生素最为敏感,并且78株分离株均存在多重耐药性,其中77株耐药5重及以上;动物试验结果显示,RA的分离株致病力普遍较强,而且不同地区分离株、同地区不同分离株之间均存在差异,数株RA分离株的LD50在104-107 CFU不等。【结论】RA在国内流行表现了强致病力及严重耐药情况,本研究结果为更好地预防控制、临床用药及后续致病机制研究提供了参考依据。  相似文献   
9.
【背景】许多研究表明,支原体的NADH氧化酶(NADH oxidase,NOX)不仅在胞浆中发挥生物酶学功能,也存在于细胞膜上发挥黏附宿主细胞功能。【目的】对滑液支原体(Mycoplasma synoviae,MS)的NOX进行酶学活性及亚细胞定位研究,分析其在MS致病过程中的潜在作用。【方法】对MS的NOX蛋白进行原核表达、纯化,然后对重组MSNOX (rMSNOX)的酶学活性及影响酶活的条件进行研究,测定其酶比活力、米氏常数及最大反应速率,接着用MS阳性血清及制备的rMSNOX兔多克隆抗体,分别与rMSNOX蛋白及MS全菌、膜蛋白和胞浆蛋白进行Western blotting反应,鉴定rMSNOX的免疫原性及其在MS中的分布情况。【结果】在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达rMSNOX蛋白,相对分子质量约为53 kD,并获得纯化的rMSNOX蛋白;酶活测定显示rMSNOX蛋白的酶比活力为14.17IU/mg,最适酶促温度为37℃,最适pH为7.5,双倒数法求得rMSNOX的最大反应速率V_(max)为21.8μmol/(L·min),米氏常数K_m(NADH)为244.0μmol/L;rMSNOX蛋白与MS阳性血清特异性结合,证明具有良好的免疫原性;亚细胞定位研究表明NOX蛋白主要存在于MS的胞浆中,细胞膜上有少量的分布。【结论】首次证实MS的NOX不仅具有NADH氧化酶活性,也是MS具有免疫原性的膜蛋白,为进一步探索NOX在MS致病过程中的作用提供了分子基础。  相似文献   
10.
【目的】大肠杆菌脂多糖(LPS)核心型根据其化学结构的不同分为5种,即R1、R2、R3、R4和K12。通过对禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)安徽、江苏、上海和河南等省市分离株的脂多糖核心型分布情况的研究,分析其与大肠杆菌主要毒力基因之间的潜在联系,以期为APEC的研究和防治提供参考。【方法】对分离到的76株APEC,利用PCR方法开展对LPS核心型分型鉴定和毒力基因检测;分析LPS核心型的分布和毒力基因、致病性之间的相关性。【结果】在76株APEC分离株中,68.4% (52株)为R1核心型,15.8% (12株)为R3型,11.8% (9株)为R4型,3.9% (3株)为R2型,未检测到K12核心型。毒力基因鉴定结果中yijp、mat、fimC、ibeB和ompA的检验阳性率均达到90%以上,可作为APEC的保守基因。其中LPS核心型R1与neuC、cva/cvi、irp2均具有显著正相关性(P<0.05),R3与iroN、irp2均具有显著负相关性(P<0.05),R4核心型与aatA显著正相关(P<0.05)。【结论】APEC的LPS核心型主要为R1。LPS核心型对部分毒力基因分布具有显著影响。  相似文献   
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