MethyScan：一种甲基化特异性PCR引物设计及评估工具

DNA甲基化是重要的表观遗传现象,对基因表达发挥重要调控功能.大量研究表明,基因DNA甲基化是重要的临床诊断生物标志物.在临床上,实施快速、准确的DNA甲基化状态检测是诊断应用的前提和关键.甲基化特异性PCR(methylation specific PCR,MSP)通过将两种引物与甲基化、非甲基化模板各自特异性结合和扩增,实现基因甲基化状态的区分,是切实可行、简单便捷的临床诊断实验技术.但是,不同于常规PCR,MSP主要存在如何强化引物-甲基化/非甲基化模板特异性结合、降低引物序列Tm值差异、去除假阳性扩增及提高敏感性等四大难点.尽管大多数MSP引物设计软件对上述难题都提出了各自解决办法,但在引物设计影响因素考虑、设计与评估并行处理及特异性扩增预测等方面仍然存在较大缺陷.为此,本研究通过对MethPrimer、MSPPrimer、MethBlast、BiSearch等现有MSP引物设计软件原理的深入探究,以及对Bowtie、SAMtools和BEDTools等工具的有效综合整合,基于图形库Matplotlib和第三方Python功能库BioPython与Primer3-py实现了具有系列优点的甲基化特异性PCR引物设计与评估可视化工具MethyScan.它具有引物设计、基因组索引、引物评估等三大完整功能模块,不仅可快速进行MSP引物设计,实现巢式(Nested)引物适配,还可基于4种基因组碱基转换模板分析引物结合信息,图形化展示非特异性扩增与目的片段差异,从而综合评估引物特异性-非特异性扩增.同时,对食管癌、结直肠癌等多种恶性肿瘤中6个潜在生物标志物TFPI-2、NDRG4、CDKN2A、CD44、CASP8和SDHD的甲基化引物设计对比结果表明,MethyScan不仅可获得更多CpG位点的检测引物,而且所获得MSP引物位置与其他软件结果相同或相近,且引物间Tm值差值更小.总之,作为首个图形化展示特异性-非特异性扩增差异MSP引物设计工具,MethyScan可有效提高甲基化引物设计准确性,为临床DNA甲基化检测项目开展、检测试验实施及诊断试剂盒研发提供有力支撑.MethyScan工具下载地址:https://github.com/bioinfo-ibms-pumc/MethyScan.     

过量DMSO显著降低低模板浓度PCR扩增的特异性

DMSO通常经验性地用于提高PCR扩增的效率,但是过量的DMSO可以显降低特异序列的扩增效率,尤其是导致非特异性扩增的现象却被忽视。在6％的DMSO存在时,开始出现非特异条带,同时特异扩增产物减少。本首次报道DMSO对PCR产物特异性的影响并确定了克服上述现象产生的途径,即通过增加模板－引物的比例消除非特异条带。而通常提高复性温度只能部分减少非特异产物,不能避免非特异扩增。本结果有助于提高常规PCR,尤其是分子遗传学分析中经常使用的随机扩增多态性DNA（random amplifeid polymorphic DNA,RAPD）检测的准确度。     

影响反转录过程多种因素的探讨

本文探讨了影响反转录反应的各种因素。温度的适当提高和模板的严格处理可以破坏RNA的二级结构,并提高引物的特异性结合;模板的纯度可以避免杂质对酶的特异性的影响;巢式引物可以在PCR过程中很有效地避免反转录过程中产生的非特异性产物的扩增,而 提高最终产物的特异性。     

比格犬雌激素β受体RNA干扰实验细胞及PCR检测引物的筛选

目的 筛选用于比格犬ERβ基因RNA干扰实验的细胞和检测所用引物.方法 根据比格犬ERβ氨基末端区域和DNA结合区设计三对引物,用阳性质粒筛选最佳引物应用于RNA干扰效果检测,并利用293T、Hela和vero细胞的cDNA验证该引物的特异性.对这三种细胞内人ERβ基因的存在情况也进行了检测.结果 经过三次重复性实验之后,结果显示引物C36684扩增效率高,且没有非特异条带,该引物对293T、Hela和vero细胞cDNA扩增时同样没有非特异性条带,但293T细胞中存在人的ERβ基因.结论 引物C36684用于检测RNA干扰效率,而Hela细胞则作为RNA干扰实验的细胞工具.     

TAIL-PCR技术及其在植物基因中的克隆

热不对称性PCR(thermal asymmetric interlaced PCR,TAIL-PCR)是一种用来分离与已知序列邻近的未知DNA序列的分子生物学技术.该技术利用3个根据已知序列设计的嵌套特异性引物分别和简并引物组合进行PCR反应,选择恰当退火温度对目标片段进行PCR扩增.TAIL-PCR技术作为一种使用技术简单易行,反应高效灵敏,产物特异性高,重复性好,能够在较短的时间内获得目标片段,已经在分子生物学研究领域广泛应用.本文从TAIL-PCR技术原理出发,对该技术特异性引物设计、随机引物组合选择、PCR反应条件等关键性问题进行综述,并介绍TAIL-PCR技术在植物基因克隆上的应用现状及发展前景.     

通用引物双重PCR在节肢动物物种鉴定中的应用

【目的】本研究旨在使用基于线粒体基因通用引物的双重PCR技术同时扩增单一样本中两条标记基因,从而达到简化节肢动物物种鉴定流程的目的。【方法】在一次PCR实验中同时加入可扩增线粒体COI基因和16S rDNA两个不同分子标记的引物,对3纲8目14科的14种节肢动物物种标本的基因组DNA进行扩增;扩增产物经电泳和胶回收后测序,并BLAST在线搜索相似序列,验证基于通用引物的双重PCR在不同的动物类群中用于物种鉴定的有效性。【结果】应用基于COI和16S rDNA的引物从分属于3纲8目14科的14种节肢动物基因组DNA中均可成功扩增目的基因;扩增产物测序结果进一步证实了扩增的准确性。【结论】通过本方法进行物种的分子鉴定,不仅可以保证物种鉴定的高准确率,还可以明显减少时间与DNA样本量的消耗,这对需要快速准确鉴定物种或珍稀的材料样本十分重要。     

属特异性T-RFLP技术用于乳酸杆菌的群落分析

【目的】设计乳酸杆菌属特异性T-RFLP技术(末端限制性片段长度多态性分析)对14株乳酸杆菌进行分型。【方法】采用源于16S-23S rRNA基因间隔区序列的乳酸杆菌属特异性引物LAB-rev,乳酸杆菌的属特异性引物,6-FAM荧光标记后结合16S上游通用引物7f用于乳酸杆菌的PCR扩增。【结果】选取HaeⅢ和HhaⅠ进行限制性酶切,最后对酶切后的产物末端测序得到T-RFLP峰谱图,该图谱能够快速准确地对不同种的乳酸杆菌进行定性、定量的分析。【结论】实验成功搭建T-RFLP技术用于微生态环境中乳酸杆菌检测的平台,对于在功能性食品、乳酸饮料和药物对肠道微生态的影响及菌种鉴定等领域有重大意义。     

复合PCR扩增人mtDNA HVR方法的初探

目的:建立一种高效的扩增线粒体DNA高可变区(mtDNA HVR)的方法.方法:本研究选取5例健康成人静脉血,用人血全基因组DNA试剂盒,提取全基因组DNA,设计引物,用复合PCR方式,对线粒体DNA中的高可变区进行扩增.复合扩增的方式为:用6对套叠引物分开进行两次独立的PCR,扩增mtDNA HVR.第一次扩增用3对引物,目标DNA片段基本涵盖整个线粒体DNA的高可变区,扩增后得到互不重叠的3个短片段,分别为113 bp,126 bp和131bp.第二次复合扩增用其余的3对引物,目标片段基本重叠在第一次扩增所得的目标片段的区域内,扩增得到3个互不重叠的片段为124 bp,133 bp和93bp.所有扩增产物经过纯化后测序.结果:复合PCR方式获得的mtDNA HVR基因序列完整,5个样本均出现特异性条带,电泳结果条带单一、清晰.结论:复合扩增PCR方法对mtDNA HVR区的扩增效率高,测序结果稳定,结合6对套叠引物,不但保证了序列的完整性,另外,两次独立的PCR也减少了PCR反应过程中错配的发生,此法也适用于保存时间较久的古代线粒体DNA短片段的研究.复合扩增PCR还展示出了潜在的高产量的特点,相对传统PCR显示了其更多的优势.     

酒酒球菌的快速特异性PCR鉴定

以Oenococcus oeni苹果酸-乳酸酶基因(mleA)为目标基因,设计了1对特异性引物PmleaL/PmleaR进行酒酒球菌的快速鉴定研究。结果表明,直接以O.oeni的菌落为模板,通过引物对PmleaL/PmleaR的PCR扩增,可得到mleA基因的特异性条带;用此特异性引物进行供试乳酸菌的PCR鉴定,所有O.oeni菌系均得到特异性条带,而供试的其它种类乳酸菌未扩增出目标带。PmleaL/PmleaR可用于O.oeni的快速PCR鉴定。     

应用改进的通用荧光PCR引物进行多重STR分型

通过设计通用荧光PCR引物并结合DNA测序系统建立了小鼠的多重STR分型方案.实验针对小鼠基因组设计了两对不同的通用引物序列,标记了FAM荧光的通用序列和"加尾"的位点特异性引物共同用于小鼠的多重PCR的STR基因分型.本研究优化了通用引物和特异性引物间的比例,优化了多重STR-PCR的反应条件,并最终利用该技术方案实现了五重STR分型.实验验证了该方案在多重STR分型中的可行性.与传统的荧光检测PCR产物方案相比,应用通用方案完成多重PCR反应大大节省了实验时间与经费.     

裸子植物DNA条形码ITS2高通用性引物的筛选

DNA条形码技术是利用标准DNA片段进行准确快速鉴定物种的一种方法,理想的DNA条形码片段应具有高通用性。虽然核糖体DNA内部转录间隔区II（ITS2）被建议作为种子植物有效的DNA条形码,但目前裸子植物还没有通用性高的引物可用。为获得高通用性的ITS2引物,本研究基于裸子植物55个属的5．8S基因的保守序列区设计了3个正向引物,与已有的ITS反向引物组合,组成了7对ITS2引物进行通用性的评价。选取了裸子植物8目、12科和40属的56个种用于本文的研究。引物组合5．8SR／ITS4、5．8SRa／ITS4和5．8SF2／S3R因为在科水平评价中通用性低或者产生的PCR产物有双带,因而排除在全部物种水平上进一步评价。其余4对引物（GYM-5．8SF1／ITS4、GYM-5．8SFl／S3R、GYM-5．8SF2／ITS4和S2F／S3R）在56个物种的PCR检测中,均有100％的扩增率。基于PCR产物的亮度、序列质量和正反向引物覆盖率的综合评价,建议引物GYM_5．8SF2／ITS4作为裸子植物条形码片段ITS2最好的通用引物。     

用反向斑点杂交方法检测猪常见致病菌

目的:建立检测猪常见致病菌的反向斑点杂交方法。方法:将23S rRNA基因芯片用的针对12种细菌的25～30 mer探针加长到30～38 mer,2对通用引物序列不变。用地高辛标记下游引物,以尼龙膜为载体制备膜芯片,检验探针/膜杂交的特异性和敏感性;另外设计1条大肠杆菌K88基因探针、一段带K88探针的报告基因和1对报告基因的反向PCR引物,在PCR体系中增加封口的K88报告基因和反向引物对,被检样品扩增后进行膜杂交。结果:修改的13条探针与参考目标菌株在膜上成特异性杂交,对52个参考菌株和野外分离株的检测准确率为92%;膜杂交的敏感性与玻片芯片接近,最小检出量为100 fg DNA;在尼龙膜上增加K88探针,与3重PCR产物杂交,可以检测到大肠杆菌K88毒力基因。结论:建立的反向斑点杂交方法简便快速,检测成本低,可用于仪器设备不足的实验室,同时可以加入检测如大肠杆菌K88等致病基因,提高基于保守基因的芯片的诊断能力。     

Comparison of primers for the detection of Salmonella enterica serovars using real-time PCR

AIMS: To evaluate the specificity and sensitivity of PCR primers for the detection of Salmonella enterica in a real-time PCR assay using pure cultures. METHODS AND RESULTS: Unenriched whole cells in sterile water were used as template for each PCR. SYBR Green dye was used for the nonspecific detection of dsDNA. The real-time PCR detection limits of five previously published primer sets used in conventional PCR applications were not below 3 x 10(3) CFU per reaction (rxn). A new primer set, Sen, was designed, which detected Salm. enterica Newport down to 6 CFU rxn(-1) in one case, and gave an average detection limit of 35 CFU rxn(-1) over three separate runs. CONCLUSIONS: Primers originally designed for end-point PCR did not have adequate specificity or sensitivity compared with those specifically designed for real-time PCR. SIGNIFICANCE AND IMPACT OF THE STUDY: This study emphasizes the importance of evaluating real-time PCR primer sets in pure cultures prior to testing in field samples. This study will benefit other researchers in selecting an appropriate primer set for real-time PCR detection of Salm. enterica.     

Sequences from the aspergillopepsin PEP gene of Aspergillus fumigatus: evidence on their use in selective PCR identification of Aspergillus species in infected clinical samples

In immunodeficient patients, Aspergillus species emerge as circumstantial pathogens. Aspergillus fumigatus is a distant first among the pathogenic aspergilli, which cause deep-seated mycoses. Sequences of the pep gene of A. fumigatus as potential PCR primers, which have not been tested before, were used to identify this species and if possible, differentiate it from other, co-identified, clinically important species of the genus. We present results of the three most promising primer pairs, pep-1/pep-22, pep-15/pep-22 and pep-21/pep32. The second pair was of better specificity when tested with DNA extracted from pure cultures of a multitude of aspergilli, whereas the first co-amplified four clinically significant Aspergillus species. The compatibility of the PCR method with the CTAB DNA extraction protocol varied according to the biological fluid tested and the primer pair used. The first two pairs showed moderate adaptability to the different commercial DNA extraction kits, which were tested in whole blood, spiked with Aspergillus fumigatus hyphae and conidia - as were all the biological fluids used. Restriction of the amplification products with MspI produced distinct patterns for different Aspergillus spp. This approach, as a potential diagnostic tool, seems reliable and sensitive due to its flexibility, speed, low cost, ease of application and selectable breadth of detection.     

ITS primers with enhanced specificity for basidiomycetes - application to the identification of mycorrhizae and rusts

We have designed two taxon-selective primers for the internal transcribed spacer (ITS) region in the nuclear ribosomal repeat unit. These primers, ITS1-F and ITS4-B, were intended to be specific to fungi and basidiomycetes, respectively. We have tested the specificity of these primers against 13 species of ascomycetes, 14 of basidiomycetes, and 15 of plants. Our results showed that ITS4-B, when paired with either a 'universal' primer ITS1 or the fungal-specific primer ITS1-F, efficiently amplified DNA from all basidiomycetes and discriminated against ascomycete DNAs. The results with plants were not as clearcut. The ITS1-F/ITS4-B primer pair produced a small amount of PCR product for certain plant species, but the quantity was in most cases less than that produced by the 'universal' ITS primers. However, under conditions where both plant and fungal DNAs were present, the fungal DNA was amplified to the apparent exclusion of plant DNA. ITS1-F/ITS4-B preferential amplification was shown to be particularly useful for detection and analysis of the basidiomycete component in ectomycorrhizae and in rust-infected tissues. These primers can be used to study the structure of ectomycorrhizal communities or the distribution of rusts on alternate hosts.     

双歧杆菌属特异性定量引物的设计及验证

【目的】旨在设计一对双歧杆菌属特异性引物以检测不同样品中低丰度双歧杆菌的含量。【方法】在NCBI中下载57株双歧杆菌全基因组序列,以其共有单拷贝核心基因为目的片段设计双歧杆菌属特异性引物;并对引物进行PCR初筛和特异性复筛;之后借助ddPCR(Droplet Digital PCR,微滴式数字PCR)依次对筛选出的引物进行特异性、灵敏度和实用性验证。【结果】引物Bif-D-9特异性最好,可扩增出4株双歧杆菌而不能扩增20株非双歧杆菌中的任何一株菌;同时通过ddPCR仪定量稀释后的DNA,其扩增结果呈线性下降趋势,证明其灵敏度较好;另外,Bif-D-9结合ddPCR定量出婴儿粪便中双歧杆菌的拷贝数为71 copies/μL,母亲粪便中双歧杆菌的拷贝数为2.7 copies/μL,证明了该方法的实用性。【结论】引物Bif-D-9具有双歧杆菌属特异性,且灵敏度较高、实用性较好,适用于复杂样品中双歧杆菌属定量。     

痘病毒科不同病毒属特异的PCR检测方法的建立

目的:建立可准确、快速地鉴别诊断可感染人的不同属痘病毒的特异PCR方法。方法:设计针对正痘病毒属、副痘病毒属和传染性软疣病毒属的多对特异引物,并制备相应的DNA模板,针对不同的模板优化引物与反应条件,分别进行检测筛选,建立病毒属特异的单独与多重PCR方法。结果:单一模板的PCR扩增反应中,正痘病毒的检测敏感性可达101拷贝/μL(引物为OPEaL-F1880/OPEaL-R2057),副痘病毒的检测敏感性可达101拷贝/μL(引物为PP2/PP3),传染性软疣病毒的检测敏感性为100 pg/μL体系(引物为MCV1/MCV2);混合模板的PCR扩增反应中,各属特异的引物均可获得预期大小的特异片段。结论:我们建立的PCR诊断方法,可用于痘病毒科不同病毒属感染的实验室特异快速鉴别诊断。     

美洲斑潜蝇SS-PCR检测技术研究

【背景】美洲斑潜蝇是一种严重威胁瓜果蔬菜、烟草、棉花等经济作物和花卉生产的入侵性害虫。由于潜叶蝇类害虫体型较小、生活方式隐蔽、形态相似,本文针对其难以快速准确地进行形态鉴别的问题,以美洲斑潜蝇为研究对象,以菜田常见的4种潜叶蝇类害虫为参照,采用种特异性PCR方法（species-specific PCR,SS-PCR）,研究其快速分子检测鉴定技术。【方法】调用GenBank中一段936bp的美洲斑潜蝇线粒体DNA（mtDNA）细胞色素氧化酶亚基Ⅰ基因（COⅠ）的序列（Gen-Bank登录号为EU219613）,并根据此基因片段的碱基序列设计引物1对,其扩增片段大小为294bp。【结果】种特异性检验结果显示,该引物只对美洲斑潜蝇的COⅠ基因具有扩增能力,对其他种类如南美斑潜蝇、三叶斑潜蝇、葱斑潜蝇、豌豆潜叶蝇等没有扩增能力。该引物不仅对成虫具有良好的扩增效果,对蛹、幼虫以及单粒卵也具有同样的扩增效果,其最低检出阈值为1/3840头成虫。【结论与意义】SS-PCR技术体系可用于美洲斑潜蝇的鉴定识别与检测监测,对阻止其进一步扩散蔓延具有重要意义。