科技信息

荧光定量PCR技术是一种先进的定量核酸检测分子诊断技术,在西方国家广泛用于乙肝HBV,丙肝HCV,艾滋病HIV,性病STD等传染病及肿瘤性疾病快速早期诊断,并作为一种先进手段用于多种生物学及医学研究,在我国现行禽流感诊断国家标准中也规定了要用该方法检测核酸确诊。荧光定量基因扩增PCR检测系统是实现荧光定量PCR技术的核心设备,目前国内主要依赖进口,价格大约是普通PCR仪的十倍。西安天隆科技有限公司通过与西安交通大学教育部生物医学信息工程重点实验室生物医学及分子光子学中心产学研结合,自主研发的荧光定量基因扩增PCR检测系…     

荧光定量PCR技术及其在科研中的应用

荧光定量PCR技术是一种新型的核酸定量技术,与常规的PCR相比,荧光定量PCR具有检测灵敏,精确,特异性强,无污染,快速等特点.目前该技术已广泛应用于不同研究的多个领域.主要从荧光定量PCR的基本原理,主要类型和检测应用进行了综述.     

快速检测伪狂犬病毒荧光定量PCR技术建立及应用

以伪狂犬病毒(PRV)保守的gE基因序列为参考,设计、优化出一对特异的PCR引物和一条TaqMan荧光探针,结合RotorGene检测系统,建立一种快速定量检测伪狂犬病毒的荧光定量PCR技术.该方法线形范围为1.0×102-1.0×107拷贝/μL,灵敏度达102拷贝/μLDNA,比常规PCR高10倍.检测的特异性明显高于常规PCR,同时避免了常规PCR因电泳造成的污染.应用该技术检测66例猪组织或鼻咽拭子样品,阳性42份,阳性检出率为63.6%(42/66).与病毒分离培养、常规PCR相比较结果显示,该方法具有快速、灵敏、特异、重复性好和能定量检测等优点,该方法可用于猪场PRV感染的快速定量检测和肉类食品进出口检疫.     

实时荧光定量PCR方法检测小RNA

<正>Real-time QuantitativePCR Detecting System,即实时定量核酸扩增检测系统,也称为实时定量基因扩增检测系统,简称定量PCR(qPCR)。荧光定量PCR一般分为非特异性荧光定量PCR和特异性荧光定量PCR。本文主要介绍一种应用非特异性荧光定量PCR(以SYBR Green I为例)方法对小RNA进行定量分析。SYBRGreen I qPCR分析小RNA的优点为:实验设计简单,一般需要一条特异性反转录引物,一条特异性正向PCR引物,反向PCR引物可通用于所有小RNA分析,无需象TaqMan方法那样专门设计探针;实验成本相对较低;可通过溶解曲线分析来检测扩增反应的特异性。这些特点有利于初学者掌握该技术,而对于一般的分析也可以完全达到实验目的。操作方法如下:     

实时荧光定量PCR在猪肺炎支原体检测中的应用

实时荧光定量PCR技术是一种利用荧光检测方法来定量核酸的技术,具有高度的灵敏性、特异性和精确性.综述了荧光定量PCR技术的基本原理及其在猪肺炎支原体检测中的应用.     

实时定量PCR技术及应用

实时定量PCR(Real-tim e Quantitative Polym erase Chain Reaction,RQ-PCR),是20世纪90年代中期发展起来的基于PCR技术的利用不同的荧光检测来给核酸定量的技术。克服了传统PCR的许多不足,能准确敏感地检测模板浓度,DNA拷贝数和检测基因变异。综述了RQ-PCR技术的原理,RQ-PCR实时定量检测系统及应用。     

新型冠状病毒荧光定量PCR的Ct值与病毒分离的结果分析

为探究利用SARS-CoV-2的ORF1ab基因和N基因作为靶标进行荧光定量检测的Ct值与SARS-CoV-2病毒分离阳性率之间的关系。本研究对广州入境的新型冠状病毒肺炎输入病例临床样本进行荧光定量PCR检测和用Vero细胞进行病毒分离,统计病毒分离率与荧光定量PCR检测Ct值之间的关系,再通过logistics回归模型用Ct值来预测病毒分离率;同时对收集到的临床样本进行三代测序及进化树的构建。结果显示,在160例新型冠状病毒肺炎输入病例临床样本中,分离到74株新型冠状病毒,分离阳性率为46.25%,分离到包括20株Alpha、9株Beta、2株Delta等VOC毒株和2株Epsilon、1株Eta等VOI毒株,其他变异株42株;病例样本荧光定量PCR检测ORF1ab基因Ct值为16.12～39.00,N基因的Ct值为17.82～39.41;病毒分离率与样本荧光定量PCR检测的ORF1ab基因和N基因的Ct值均呈负相关,在Ct值>31时,分离率仅9.10%(6/66),而当Ct值<23.1时,病毒分离阳性率可超过95%,分离到新冠病毒的病例样本荧光定量PCR检测的ORF1a...     

实时荧光定量PCR在固氮酶基因检测中的应用

实时荧光定量PCR是近年发展起来的一种新的实时定量检测特定核酸技术,它是核酸探针技术、荧光共振能量传递技术和PCR技术的有机结合。与常规PCR相比,它具有特异性更强、能有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点,扩大了PCR的应用范围。概述实时荧光定量PCR技术在固氮酶(nifH)基因检测中的应用与研究进展,并探讨该技术的发展和应用前景。     

16SrRNA荧光定量PCR法检测双歧杆菌

目的应用16SrRNA序列设计引物定量测定双歧杆菌。方法应用青春型双歧杆菌2627号作常规PCR扩增出的模板经系列稀释做荧光定量PCR,制作标准曲线;对青春型、长型、短型、婴儿型、两歧型、链型等6个种共15株双歧杆菌和大肠杆菌等10株其他细菌做荧光定量PCR,计算机通过与标准曲线比较给出定量结果;对青春型双歧杆菌2627号进行敏感性测定。结果15株双歧杆菌(10     

快速检测伪狂犬病毒荧光定量PCR技术建立及应用

以伪狂犬病毒(PRV)保守的gE基因序列为参考,设计、优化出一对特异的PCR引物和一条TaqMan荧光探针,结合RotorGene检测系统,建立一种快速定量检测伪狂犬病毒的荧光定量PCR技术。该方法线形范围为1.0×102-1.0×107拷贝/μL,灵敏度达102拷贝/μLDNA,比常规PCR高10倍。检测的特异性明显高于常规PCR,同时避免了常规PCR因电泳造成的污染。应用该技术检测66例猪组织或鼻咽拭子样品,阳性42份,阳性检出率为63.6%(42/66)。与病毒分离培养、常规PCR相比较结果显示,该方法具有快速、灵敏、特异、重复性好和能定量检测等优点,该方法可用于猪场PRV感染的快速定量检测和肉类食品进出口检疫。     

荧光定量PCR技术在临床微生物检测中的应用

荧光定量PCR技术是近些年来发展起来的一种核酸检测技术,它以灵敏度高、特异性强、重复性好、快速准确定量等特点被广泛应用于各个领域。现主要介绍荧光定量PCR技术在病毒、细菌、真菌和寄生虫4个临床微生物检测方面的应用进展。     

应用实时荧光PCR技术定性定量检测改良品质的转基因小麦

目的:对转入高分子量谷蛋白亚基的小麦中转基因成分进行实时荧光PCR定性定量检测。方法:针对转基因小麦品系中通用的ubiquitin启动子,NOS终止子以及标记基因bar基因进行定性筛选检测,同时用已知为单拷贝的Wx012基因作为小麦物种内源特异参照基因,用单粒B73转基因小麦提取基因组DNA建立内源基因和外源基因的标准曲线,对转基因小麦样品A进行定量检测,同时优化实时荧光PCR条件反应条件。定量检测结果为5.35%。结果:研究的实时荧光PCR技术对转基因小麦中转基因成分能够快速准确地进行定性定量检测。     

转基因大豆、玉米、油菜和水稻品系特异性检测质粒标准分子的快速构建及应用

本文采用重叠延伸PCR技术快速构建了转基因大豆GTS40-3-2、玉米NK603、油菜RT73和水稻TT51-1的4种品系作物的质粒标准分子.经快速PCR鉴定及测序分析验证后,将构建的阳性质粒标准分子应用于实时荧光定量PCR标准曲线的构建,并建立其相应的荧光定量PCR检测体系,同时对该体系的扩增效率、精确度、灵敏度等指标进行了评估. 结果显示,建立的实时荧光定量PCR检测体系中,目标序列的扩增效率均在97.434%~101.479%正常范围内（R2≥0.995）,定量极限为20 copies,表明我们已成功构建了这4种转基因作物的品系质粒标准分子,并能有效应用于实时荧光定量PCR标准曲线的构建.     

核酸定量检测方法研究进展

核酸相关的研究和应用广泛存在于各个学科领域,与之相关的核酸定量检测技术越来越受到研究人员的重视。本文对目前实验室广泛采用的和近几年进展迅速的核酸定量方法(包括紫外分光光度法、荧光染料法、实时荧光定量PCR法、数字PCR法等)进行介绍,着重阐述其检测原理和优缺点,为研究人员今后进行相关研究提供参考。     

EvaGreen实时荧光定量PCR检测猪圆环病毒2型方法的建立

根据GenBank中的猪圆环病毒2型(PCV2)ORF4基因序列设计一对特异性引物,通过常规PCR扩增PCV2的ORF4基因,并将其纯化的PCR产物克隆入pMD18-T载体中,构建重组质粒。应用该重组质粒进行EvaGreen实时荧光定量PCR,建立了PCV2 DNA的标准曲线,并进行熔解曲线分析。结果显示:建立的EvaGreen实时荧光定量PCR特异性强,与其他非靶标病毒基因不发生交叉反应;灵敏度高,最高可检测到10拷贝/μL的病毒量;重复性好,3个浓度的批间和批内的变异系数均小于2.5%;对118份临床样品进行检测,阳性样品25份,阳性率为21.2%,检测结果与普通PCR相符率为99.2%,其中一份样品经荧光PCR检测为PCV2阳性,普通PCR检测为阴性。结果表明,建立的EvaGreen实时荧光定量PCR方法具有特异性强、敏感度高、重复性好、简便快捷等特点,可用于临床PCV2感染的早期诊断以及分子流行病学调查。     

肺炎克雷伯菌的芯片式数字PCR检测方法的建立

【背景】条件致病菌肺炎克雷伯菌是医源性感染最重要的革兰氏阴性菌之一,目前对该病原菌的核酸检测方法存在费时费力、灵敏度低、准确性差等问题。【目的】建立基于芯片式数字PCR的肺炎克雷伯菌检测方法。【方法】依据肺炎克雷伯菌的16SrRNA基因保守序列设计特异性引物和TaqMan探针,通过与实时荧光定量PCR的比较分析,确定了芯片式数字PCR方法的检测范围和最佳反应条件,并进行了方法特异性、灵敏性分析及临床菌株的检测。【结果】芯片式数字PCR检测灵敏度比实时荧光定量PCR提高了约1.5个数量级,最低检出限可达到3.77 copies/μL;优化后的芯片式数字PCR特异性与实时荧光定量PCR结果一致,方法的相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)均小于25%;本研究利用优化后的芯片式数字PCR方法共检测了28株临床菌株,检测到14株为肺炎克雷伯菌,14株为其他种属,这也与实时荧光定量PCR检测结果一致。【结论】采用芯片式数字PCR技术建立了肺炎克雷伯菌核酸检测的绝对定量方法。该方法特异性好、灵敏度高、准确度高,适合肺炎克雷伯菌的核酸检测和定量分析,也为其他临...     

数字PCR技术及应用研究进展

数字PCR是继实时定量PCR之后新兴发展起来的一种绝对定量分析技术。通过将单个DNA分子转移入独立的反应室,PCR扩增反应后,对荧光信号进行检测分析,实现单分子的绝对定量。数字PCR技术摆脱了对标准曲线的依赖,具有更高灵敏度和准确度,在基因突变检测、拷贝数变异检测、微生物检测、转基因食品检测以及下一代测序等方面均得到广泛应用。本文介绍数字PCR技术的定量方法,并评述该技术在主要应用领域的研究进展。     

转豇豆胰蛋白酶CPTI基因棉花检测用标准分子的制备

利用PCR的方法克隆豇豆胰蛋白酶基因CPTI、基因表达调控元件35S启动子、NOS终止子以及棉花内标基因Sad1,连接到克隆载体上,构建成质粒标准分子pGB。PCR检测过程中,质粒标准分子和转基因棉花中能扩增出4个目的条带,而非转基因棉花中不能扩增出相应的条带,证明构建好的质粒标准分子能用于转基因棉花的定性检测。荧光定量PCR绘制4个目的基因片段的标准曲线,各标准曲线的相关系数均达到0.985以上,说明建立的PCR具有很好的Ct值-初始浓度相关性,达到定量分析的需求,而且荧光定量PCR反应具有很好的重复性和稳定性,可用于实际样品的定量检测。     

转基因烟草荧光定量检测方法研究

依据实时定量PCR原理,参照35S启动子、NOS终止子、GUS基因和NPTII基因序列设计TaqMan引物和荧光标记探针。采用美国MJ公司OpticonTM2荧光定量PCR检测系统对烤后烟叶进行转基因定量检测技术研究,从中筛选出扩增效率高,灵敏度好的PCR引物和探针序列,同时通过对扩增体系,扩增条件的梯度实验,优化出荧光定量检测的最佳反应体系和反应条件,从而建立了转基因烟草定量检测方法。该方法经验证其检测灵敏度达到0.05％。在2003年6月参加CORESTA(国际烟草科研与合作中心)组织的国际烟草转基因定量检测合作试验中,该优化转基因烟草定量检测技术获得了较好成绩,对盲检样品检测结果评价(Z-score)列国际12家实验室之首,证明此法灵敏度高、稳定性好。     

新型MGB探针在沙眼衣原体实时PCR检测中的应用

为建立基于TaqMan-MGB探针的沙眼衣原体DNA荧光定量PCR检测方法,探讨其临床应用价值,用 PCR法扩增沙眼衣原体隐蔽质粒pLVG440 2 464～2 980 nt段,并克隆入pMD18-T载体用作参比模板,设计一对引物和一个TaqMan-MGB探针,优化反应条件,建立沙眼衣原体DNA荧光定量PCR检测系统,并运用该系统同时应用连接酶链式反应(LCR)法对临床标本进行检测.结果显示所建立的沙眼衣原体DNA荧光定量PCR检测系统,最低检测限度为1 DNA拷贝每反应;在10⁰～10⁹ DNA拷贝每反应范围内,C_t值(每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数）和DNA拷贝数呈线性关系（r＞0.990）;对临床标本检测结果同LCR分析结果吻合率为100%.以上结果表明,所建立的基于TaqMan-MGB探针的沙眼衣原体DNA荧光定量PCR检测系统具有敏感性高、特异性强和线性检测范围广等特点,适用于对沙眼衣原体进行大规模筛选.