EvaGreen实时荧光定量PCR检测猪圆环病毒2型方法的建立

根据GenBank中的猪圆环病毒2型(PCV2)ORF4基因序列设计一对特异性引物,通过常规PCR扩增PCV2的ORF4基因,并将其纯化的PCR产物克隆入pMD18-T载体中,构建重组质粒。应用该重组质粒进行EvaGreen实时荧光定量PCR,建立了PCV2 DNA的标准曲线,并进行熔解曲线分析。结果显示:建立的EvaGreen实时荧光定量PCR特异性强,与其他非靶标病毒基因不发生交叉反应;灵敏度高,最高可检测到10拷贝/μL的病毒量;重复性好,3个浓度的批间和批内的变异系数均小于2.5%;对118份临床样品进行检测,阳性样品25份,阳性率为21.2%,检测结果与普通PCR相符率为99.2%,其中一份样品经荧光PCR检测为PCV2阳性,普通PCR检测为阴性。结果表明,建立的EvaGreen实时荧光定量PCR方法具有特异性强、敏感度高、重复性好、简便快捷等特点,可用于临床PCV2感染的早期诊断以及分子流行病学调查。     

猪圆环病毒2型Cap蛋白在烟草叶绿体中的表达

猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)可读框2(open reading frame 2,ORF2)基因编码具有多个抗原表位的病毒衣壳(Cap)蛋白,能在机体内有效引发免疫反应并产生中和抗体,是预防和治疗猪圆环病毒病(porcine circovirus-associated disease,PCVAD)的主要抗原。但Cap蛋白高昂的生产成本限制了它的广泛应用。为了探索Cap蛋白新的生产途径,本研究选择烟草叶绿体为表达平台,构建了ORF2抗原基因烟草叶绿体表达载体pNK-a03,并通过基因枪法(gene biolistics)将表达载体导入烟草叶绿体中。转化植株经PCR和RT-PCR检测,证实ORF2抗原基因已整合进烟草叶绿体基因组中且正常转录。蛋白质印迹检测和ELISA分析表明,Cap蛋白在烟草叶绿体内获得有效表达,具有免疫活性。此外,种子萌发研究结果显示,转基因烟草植株F1代具有aadA抗性,目的基因可正常进行遗传。这些研究结果为探索Cap蛋白的新型表达途径提供了理论基础。     

猪细小病毒LDR-PCR检测方法的建立和应用

为准确特异灵敏地检测猪细小病毒(PPV),建立一种新的LDR-PCR方法。首先在病毒的保守区内设计一对LDR探针,LDR探针两端各连有一段引物对应序列,以连接产物为模板进行PCR,琼脂糖凝胶电泳检测结果。以标准质粒为模板,通过对LDR反应的退火温度、连接酶浓度及探针浓度等反应条件进行优化,确定了LDR最佳的反应体系,并建立了LDR-PCR方法。结果表明,可以特异地检测PPV,与猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒(PCV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)无交叉反应;最低检测限为102个拷贝。利用建立的方法对41例临床样本进行检测,14份样品PPV阳性,与普通PCR检测结果符合率为97.6%。     

转Bt基因水稻对二化螟绒茧蜂生物学特性的影响

用转Bt基因 (cry1Ab) 水稻KMD1饲喂3龄、4龄和5龄二化螟Chilo suppressalis一定时间后, 作为二化螟绒茧蜂Apanteles chilonis的寄主,研究了转基因水稻经寄主对绒茧蜂生物学特性的影响。结果发现：KMD1处理后,三个龄期幼虫的寄生率都显著下降,其中4龄和5龄达极显著水平;3龄和4龄上的结茧率显著低于对照;蜂蛹历期均短于对照,但仅3龄差异显著;从5龄幼虫所羽化的雄蜂寿命显著短于对照;蜂茧长显著短于对照;而对卵＋幼虫期、茧块茧数、蜂羽化率及性比均无显著影响。     

稻田蜘蛛生态位变化及杀虫剂对捕食功能的影响

通过对稻田各蜘蛛和害虫空间生态位的研究发现,空间生态位宽度随季节而变化,狼蛛的生态位宽度值逐渐变小;肖蛸两头高中间低;微蛛在7月下旬最大;球腹蛛在8月下旬9月上旬最大,各类群的数量是影响该类群空间生态位的重要因素。空间生态位具有明显的日节律,狼蛛在7-8月份以中午最宽,微蛛变化不大;肖蛸在7-8月份下午的生态位宽度值大于上午,9月份则上午大于下午;球腹蛛7-8月份以上午为最大;跳蛛下午大于上午,不同种类农药在一天中不同时间施用对各类蜘蛛存活率及捕食功能的影响不同,杀虫双上午用药对蜘蛛集团的捕食功能减退率影响较小,甲胺磷则相反。     

水对稻田蜘蛛捕食功能的影响

采用脉冲抽样法调查,将两年的田间飞虱每日被捕食量与捕食性天敌密度的资料分为有水和无水两组,分析了两种条件下飞虱被捕食量、被捕食百分率与蜘蛛密度、飞虱平均拥挤度的关系,并在室内模拟有水和无水分别进行了拟水狼蛛(Pirata subpiraticus)和食虫瘤胸蛛(Oedothorax insecticeps)对褐飞虱（Nilaparvata lugens Stal)的捕食功能反应。结果表明：飞虱被捕食百分率随飞虱平均拥挤度增加而呈递减趋势;在同一飞虱平均拥挤度时,有水时飞虱被捕食量大于无水;有水时飞虱被捕食量与水狼蛛密度呈二次抛物线型关系,水狼蛛密度在每穴1．4头时,飞虱被捕食量最大;无水时飞虱被捕食量与水狼蛛密度呈线型关系;两种条件下飞虱被捕食量与微蛛密度的关系不明显。室内功能反应同样证实了水狼蛛在有水时的捕食量大于无水,前者比后者高1．5倍,而食虫瘤胸蛛无明显差异。     

转Bt基因作物Bt毒蛋白在土壤中的安全性研究

商业化的转Bt基因作物获准在田间大面积种植,使其释放的Bt毒蛋白对土壤生态系统的生态风险性问题成为人们关注的焦点,本文综述了转Bt抗虫作物以植株残体、根系分泌物、花粉等形式释放的Bt毒蛋白通过田间耕作等方式进入土壤后的一些安全性问题,包括土壤活性颗粒对Bt毒蛋白的吸附作用。Bt毒蛋白在土壤中的杀虫活性、存留,土壤微生物对Bt毒蛋白的降解作用以及Bt毒蛋白对土壤生物的影响等。     

转Bt基因水稻表达的毒蛋白Cry1Ab在害虫及其捕食者体内的积累动态

在室内对转基因水稻KMD1中的Cry1Ab毒蛋白经食物链在几种主要害虫及其捕食性天敌体内的积累进行了研究。结果表明： 无论是水稻孕穗期还是成熟期,二化螟Chilo suppressalis连续取食KMD1或取食KMD1.36 h后移至对照品种秀水11上取食不同时间后,幼虫体内的Cry1Ab含量均随取食时间延长逐渐下降。稻眼蝶 Mycalesis gotama幼虫连续取食KMD1或在KMD1上取食两天后移至秀水11上继续取食不同时间,体内的Cry1Ab含量也都随取食时间延长而下降,但下降速度较二化螟更快。取食KMD1的二化螟和稻眼蝶幼虫的粪便中均检测到较高浓度的Cry1Ab,对照组中均无Cry1Ab。取食KMD1的二化螟幼虫血淋巴中检测到Cry1Ab,含量为3.5 ng/g。取食KMD1的褐飞虱 Nilaparvata lugens、稻蚜Sitobion avenae以及饲喂取食过KMD1的二化螟或稻眼蝶幼虫的拟水狼蛛Pirata subpiraticus体内都含有一定浓度的Cry1Ab,其中,拟水狼蛛体内的CrylAb含量以饲喂取食KMD1稻眼蝶幼虫的含量最高,约为饲喂取食KMD1二化螟幼虫的60倍。这些结果表明Cry1Ab可以沿水稻害虫天敌食物链传递。     

定量PCR检测microRNA表达的数据归一化新技术

数据归一化技术对研究结果的分析具有重要的作用.在定量PCR实验中,通常利用稳定表达的看家基因作为实验数据归一化的内参,但最近的研究表明,这些看家基因的表达量在不同的生理病理过程中也表现出显著的变化,不适合作为数据归一化处理的基准.针对这一问题,提出一种新的数据处理技术,利用单细胞归一化方法(percellome),对定量PCR检测miRNA表达的数据进行处理,显著提高了数据处理的准确性.以8周龄/40周龄小鼠脑为实验材料,选择14种microRNA的表达情况进行了检测.在研究中,将3种不同拷贝数的人工合成的RNA片段(spike RNA)作为内参加入到样品中,用于microRNA表达检测的归一化基准.研究发现,未经处理的microRNA单细胞拷贝数的变化范围为2.0×105～4.3×105,而经单细胞归一处理,上述表达变化范围为2到26倍.该项研究还发现,看家基因U6 ncRNA和5S rRNA的表达水平存在显著的变化,在以基因组DNA为归一化基准时,其表达量变化为1.5和4.8倍,而在以RNA水平为归一化基准时,其表达量变化为5.8和3.8倍,表明这些基因不适合作为数据处理的基准.据此,为microRNA的定量研究提供了一种新的、可靠的归一化方案.     

田间蜘蛛集团对飞虱的每日捕食量与室内、盆栽水稻的捕食作用比较

采用控制论中的脉冲采样法结合杀死飞虱计数法研究了田间蛛蛛对飞虱的每日捕食量估计并与室内,盆栽罩笼水稻功能反应的捕食作用进行了比较,结果表明田间蜘蛛平均每头每日对飞虱的捕食量为0.669头,这一捕食量比室内和盆栽水稻的捕食量要小得多;田间捕食百分率与飞虱密度呈二次抛物线关系,即飞虱低密度和高密度捕食百分率均低于中等密度,在每穴10头飞虱左右,捕食量和捕食百分率最高,在有一定存量蜘蛛时,捕食量与微蛛,狼蛛数量呈显著的二元线性回归关系,但偏相关系数为负,由此表明随蜘蛛密度的增加捕食量反而下降,这与一些多物种共存系统和田间罩笼的研究结果相一致。